Name: visualizing cytoskeleton-dependent trafficking of lipid-containing organelles in drosophila embryos
Uploaded: 2021-12-13T13:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos at JoVE.com

Ringraziamo Pakinee Phromsiri, Brian Jencik, Jinghong (James) Tang e Roger White per i loro commenti sul manoscritto. Ringraziamo Patrick Oakes, Stefano Di Talia e Victoria Deneke per aver condiviso le loro competenze su come eseguire l'analisi PIV. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Institutes of Health F31 HD100127 (a M. D. K.) e R01 GM102155 (a M. A. W).

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

L'embrione di Drosophila è un modello potente e conveniente per studiare questioni fondamentali nella biologia cellulare e organismica. La sua relativa semplicità, la potente genetica e le piccole dimensioni lo rendono un sistema eccellente per l'imaging sia dei processi cellulari che dello sviluppo. Qui, un protocollo di microiniezione standard viene adattato per consentire l'utilizzo di FP negli embrioni. Questo approccio consente l'imaging fluorescente di specifiche strutture cellulari senza la necessità di fluorofori geneticamente codificati, aprendo molti background genetici all'imaging. La combinazione di più coloranti e proteine marcate fluorescenti scelte strategicamente può aprire l'imaging live multicanale che copre l'intero spettro della luce visibile.
Passaggi critici nel protocollo: Questo protocollo utilizza BODIPY 493/503 per etichettare i LD. Questo approccio può essere facilmente adattato per contrassegnare altre strutture cellulari. Per la successiva analisi dell'immagine, uno dei fattori più importanti è il rapporto segnale-rumore, cioè la luminosità del colorante rispetto al segnale di fondo. I lisosomi sono stati ripresi con successo (LysoTracker Red, 1 mM), così come i mitocondri (Mitoview 633, 200 μM), l'ER (ER tracker Green, 10 μM) e i microtubuli (tubulina SiR, 200 nM in DMSO), come mostrato in Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5. Inoltre, le vescicole di tuorlo sono autofluorescenti ed emettono luce blu dopo l'eccitazione UV (immagine che utilizza 405 nm come lunghezza d'onda di eccitazione (Figura 6)). Per altri coloranti, mirare a che la concentrazione del colorante sia 100-1.000x di ciò che sarebbe necessario per colorare le cellule coltivate vive; questo è simile alla concentrazione di una soluzione madre che verrebbe diluita in terreni di coltura cellulare. Poiché questo protocollo richiede un'iniezione di 100 fL e l'embrione di Drosophila è di circa 9 nL nel volume18, queste concentrazioni di colorante saranno in media a una concentrazione embrionale interna inferiore a 1/100 di ciò che è presente nei terreni di coltura cellulare. Temporaneamente, la concentrazione locale sarà più alta nel sito di iniezione, che è più rilevante per i FP che non si diffondono bene (cioè coloranti mitocondriali e SiR-tubulina). Per questi FP, iniziare dalle alte concentrazioni raccomandate; se si osserva una morte inaspettata, diluire successivamente due volte fino a raggiungere un compromesso accettabile tra sopravvivenza e potenza del segnale.
Quando si co-iniettano più coloranti, entrambi i coloranti devono essere nello stesso solvente o entrambi i solventi e i coloranti devono essere compatibili con la miscela (non sono raccomandate concentrazioni di alcol superiori a ~ 10%).
La qualità degli aghi è essenziale per il successo di questa procedura, poiché la punta deve essere il più fine possibile. Altrimenti, il danno causato dalla ferita da iniezione può compromettere il successivo sviluppo dell'embrione. Poiché gli estrattori di aghi commerciali differiscono, è importante seguire i suggerimenti del produttore e provare più parametri di trazione fino a raggiungere la forma desiderata. È fondamentale eseguire la fase di controllo qualità 1.1.3 poiché lavorare con una punta dell'ago incrinata, frastagliata o di grandi dimensioni renderà l'iniezione di successo più difficile o addirittura impossibile.
L'embrione deve essere parzialmente essiccato in modo che ulteriori volumi di liquido possano essere aggiunti durante l'iniezione. Se l'embrione è sotto-essiccato, l'ago non entrerà facilmente e il citoplasma schizzerà fuori mentre l'ago penetra o mentre la soluzione viene iniettata. Se l'embrione è troppo essiccato, sembrerà sgonfiato e non si svilupperà correttamente. Il tempo esatto di asciugatura dipende dalle condizioni locali, ad esempio l'umidità dell'aria, e può cambiare di giorno in giorno. Deve essere determinato empiricamente per ogni sessione.
La capacità dell'embrione di sopravvivere dopo la microiniezione dipende in modo critico dalla qualità dell'ago, dal corretto essiccamento e dalla limitazione del volume di iniezione a meno di 1 pL (idealmente 100 fL). Finché questi parametri sono ottimizzati, non è evidente alcuna tossicità significativa quando i coloranti descritti vengono iniettati alle concentrazioni raccomandate. Se gli embrioni sopravvivono alle fasi di essiccazione e iniezione, in genere si sviluppano con successo nell'estensione della banda germinale, con un'eccezione delle sonde microtubule e ER che hanno causato difetti di cellularizzazione ad alti livelli (iniezione di 100 fL della concentrazione di riserva di ciascuno). I test non hanno riscontrato evidenti difetti dello sviluppo quando DMSO, acqua e miscele dei due sono stati iniettati ai volumi raccomandati, con un tasso di sopravvivenza embrionale attraverso l'estensione della banda germinale di ~ 75% o più. Volumi di iniezione superiori a 1 pL hanno causato difetti e gli embrioni iniettati con volumi di ~ 4 pL sviluppati per meno di 1 ora. Pertanto, i volumi di iniezione devono essere mantenuti bassi, il che significa che le concentrazioni di colorante devono essere elevate.
Generalmente, le iniezioni lungo il bordo laterale dell'embrione sono raccomandate in quanto provocano il minor danno. Tuttavia, potrebbe essere necessario regolare il sito di iniezione in base alle proprietà diffusive dei FP impiegati. BODIPY 493/503 e LysoTracker si diffondono più velocemente sull'intero embrione rispetto al Lipid Spot 610 (un altro colorante per contrassegnare gli LD), mentre SiR-Tubulin e Mitoview 633 non si diffondono mai completamente attraverso l'embrione (imaging fino a 7 ore dopo l'iniezione). Pertanto, può essere necessaria l'iniezione all'interno o vicino al sito di interesse. Quando si inietta nelle regioni anteriore o posteriore, si raccomanda un ago particolarmente sottile.
L'acquisizione di immagini si basa sulla microscopia confocale per sezionare e risolvere otticamente piccoli organelli e tutti i componenti citoscheletrici. Le tecniche che richiedono l'analisi di molte immagini (ad esempio, STORM o PALM) non funzioneranno perché il contenuto embrionale è in movimento e i fluorofori non sono ottimizzati per il fotocceleramento. La microscopia a epifluorescenza manca della risoluzione laterale e assiale per distinguere la maggior parte degli organelli e delle strutture cellulari più piccole. Per questi motivi, si consiglia vivamente di utilizzare un microscopio confocale o di utilizzare la tecnologia dei fogli di luce.
La riproducibilità dell'analisi delle immagini si basa in gran parte su dati di imaging coerenti. Per le maggiori possibilità di successo, è necessaria l'ottimizzazione della tecnica di iniezione e l'acquisizione delle immagini. Stabilire e praticare una tecnica in cui i coloranti di interesse, il sito di iniezione, l'età dell'embrione, il volume di iniezione e la configurazione dell'acquisizione sono tutti coerenti genererà i dati più robusti per l'analisi delle immagini.
Modifiche e risoluzione dei problemi del metodo Questo protocollo dimostra un metodo per analizzare il flusso di massa di LD in embrioni in stadio di scissione utilizzando la velocimetria dell'immagine delle particelle. Lo stesso approccio può essere utilizzato per altri organelli, altri stadi di sviluppo e altri metodi di analisi. Ad esempio, la Figura 2 mostra l'analisi di LD e organelli acidi che fluiscono nelle fasi sinciziali dell'embriogenesi, visualizzate co-iniettando BODIPY 493/503 e LysoTracker Red. È stata ottenuta un'ulteriore imaging di successo del movimento LD negli embrioni fino a 7 ore dopo la fecondazione; questi embrioni mantengono la ferita da iniezione ma sono in grado di svilupparsi per diverse ore.
I dati raccolti utilizzando questo protocollo sono stati utilizzati per la velocimetria delle immagini di particelle, ma sono disponibili molte altre tecniche di analisi. Ad esempio, i programmi di tracciamento delle particelle come quelli che si trovano in ImageJ, Imaris o il tracciamento manuale possono essere utilizzati per ottenere velocità e direzionalità delle strutture in movimento. Si noti che la maggior parte di questi software di tracciamento sono costruiti per funzionare con i dati provenienti da sistemi di coltura cellulare planare e non sempre si adattano bene a strutture 3D come l'embrione di Drosophila . Inoltre, per la generazione dei dati di tracciamento delle particelle della migliore qualità, dovrebbero essere ripresi più piani Z; questo dovrebbe essere fattibile se i tempi di acquisizione dello stack di immagini sono inferiori a ~ 2 s. Questo benchmark dovrebbe essere raggiungibile su dischi confocali rotanti, fogli luminosi reticolari e recenti sistemi confocali a scansione laser. Tuttavia, la fattibilità del tracciamento delle particelle per organelli abbondanti come LD, mitocondri e lisosomi è bassa in quanto la quantità di segnale positivo in un campo visivo è troppo alta per gli attuali metodi di tracciamento. Può essere possibile il monitoraggio di strutture meno abbondanti come nuclei o vescicole di tuorlo. PIV per l'analisi del flusso funziona bene per LD e organelli acidi nelle fasi di scissione perché entrambi gli organelli si muovono liberamente. Organelli come nuclei, ER e mitocondri sono legati ad altre strutture cellulari e quindi non si muovono liberamente e non sono adatti all'analisi software che presuppone il movimento libero. Lo sperimentatore dovrebbe scegliere le tecniche più adatte all'organello di interesse.
Durante gli stadi di blastoderma sinciziale e cellulare, gli LCD (così come alcuni altri organelli) si muovono lungo i microtubuli orientati radialmente5. È quindi possibile trovare viste trasversali (come nella Figura 5) in cui singoli microtubuli sono a fuoco per lunghe distanze, consentendo il tracciamento delle particelle in 2D. Poiché questi piani ottici sono profondi all'interno dell'embrione, la potenza complessiva del segnale è diminuita e il rapporto segnale-rumore è ridotto.
Per l'analisi del tracciamento, l'imaging il più velocemente possibile può rivelare dettagli cruciali del movimento e quindi del macchinario mobile. Ad esempio, il movimento lipidico-goccioline è una miscela di due stati mobili, movimento lento-corto (~ 200 nm / s; distanza media di viaggio ~ 100 nm) e movimento veloce-lungo (~ 450 nm / s; distanza media di viaggio ~ 1.000 nm) 19; quindi, se le immagini vengono scattate ogni secondo o anche meno frequentemente, lo stato lento-corto diventa non rilevabile. Tuttavia, l'imaging frequente induce anche lo sbiancamento del fluoroforo e la fototossicità. Le condizioni di imaging, quindi, devono essere regolate in base alla domanda esatta da affrontare.
Limitazioni del metodo A seconda del colorante desiderato, il metodo può essere limitato dalla compatibilità tra la solubilità del colorante e la tossicità della soluzione iniettabile. Alcoli come l'isopropanolo e l'etanolo sono difficili da maneggiare all'interno di un ago a causa della loro viscosità inferiore e sembrano danneggiare i componenti cellulari e uccidere l'embrione.
Il metodo non è adatto anche per visualizzare i primi passi nell'embriogenesi perché ci vogliono più di 30 minuti per preparare gli embrioni per l'iniezione. A temperatura ambiente, i cicli cellulari iniziali dell'embrione durano solo ~ 10 minuti ciascuno; quindi, anche se si dovesse scegliere un uovo appena fecondato nel passaggio 5.2.3, i primi cicli cellulari sarebbero già completati nel momento in cui l'embrione è pronto per l'imaging.
L'illuminazione con luce nella gamma UV/blu è considerevolmente più fototossica rispetto alle lunghezze d'onda più lunghe. In tali condizioni (ad esempio, seguire le vescicole autofluorescenti del tuorlo; Figura 6), si deve limitare il tempo di imaging (portando a serie temporali più brevi) o utilizzare una potenza laser inferiore (con conseguente riduzione del rapporto segnale-rumore).
Dopo la cellularizzazione, i coloranti iniettati in una posizione specifica tendono a diffondersi male, poiché devono attraversare molte membrane cellulari. Ciò limita la regione di osservazione nelle fasi successive dello sviluppo.
Il significato del metodo rispetto ai metodi esistenti/alternativi Il movimento degli LD e di altri organelli contenenti lipidi nei primi embrioni può essere visualizzato con fluorofori geneticamente codificati, tecniche prive di etichette e mediante l'introduzione di FP. Quest'ultimo può essere ottenuto mediante permeabilizzazione della membrana vitellina12 o l'approccio di microiniezione discusso qui.
I fluorofori geneticamente codificati sono marcatori versatili i cui livelli sono tipicamente altamente riproducibili da embrione a embrione. Tuttavia, hanno rendimenti quantistici inferiori e candeggina più facilmente rispetto agli FP. In genere, sono disponibili solo in una o due versioni con tag (ad esempio, GFP o mCherry), limitando la scelta di quali strutture possono essere visualizzate contemporaneamente. I FP, d'altra parte, spesso esistono in una grande varietà; ad esempio, sono disponibili vari coloranti specifici per goccioline lipidiche con spettri di emissione da Autodot nello spettro UV / blu a Lipidtox e LipidSpot 610 nello spettro rosso lontano. Gli FP possono anche essere applicati direttamente a qualsiasi ceppo di interesse e quindi non richiedono la costruzione di ceppi per, ad esempio, introdurre il marcatore organello desiderato in un ceppo mutante di interesse. Questo vantaggio è particolarmente pronunciato quando più strutture devono essere etichettate contemporaneamente; invece di incroci che richiedono tempo che coprono più generazioni, questo può essere ottenuto in un solo giorno mescolando i coloranti pertinenti e introducendoli allo stesso tempo. Infine, se i processi cellulari devono essere sondati con inibizione farmacologica, farmaci e coloranti possono essere introdotti insieme.
I metodi senza etichetta sono approcci molto potenti per rilevare specifiche strutture cellulari. Ad esempio, gli LCD possono essere rilevati specificamente negli embrioni precoci mediante microscopia di terza generazione armonica20 o microscopia a perdita raman stimolata a femtosecondi21. Come gli FP, questi approcci possono essere applicati in qualsiasi background genetico e, poiché non causano lo sbiancamento, consentono potenzialmente un'acquisizione più rapida delle immagini. Tuttavia, sono in genere limitati a specifici organelli e quindi non supportano da soli l'imaging multiplex; richiedono anche microscopi specializzati.
Esistono due strategie generali per introdurre piccole molecole negli embrioni. Uno è l'approccio di microiniezione impiegato qui; l'altro è il trattamento chimico (terpenico) per permeabilizzare la membrana vitellina. Quest'ultimo approccio12 è meno coinvolto della microiniezione, ma anche più variabile da embrione a embrione. Inoltre, dopo la permeabilizzazione, la protezione fornita dalla membrana vitellina è compromessa e l'embrione vero e proprio è accessibile al mezzo esterno, rendendo più difficile mantenerlo in vita. La microiniezione ha molte meno probabilità di far deragliare lo sviluppo embrionale rispetto alla permeabilizzazione. Tuttavia, la permeabilizzazione è raccomandata se molti embrioni devono essere monitorati contemporaneamente, ad esempio per scopi di screening farmacologico. Per seguire il movimento delle strutture cellulari e ottenere serie di immagini riproducibili adatte all'analisi delle immagini, la microiniezione è il metodo di scelta.
Importanza e potenziali applicazioni del metodo in specifiche aree di ricerca L'embrione di Drosophila è un importante sistema modello per lo studio di molti processi biologici e di sviluppo cellulare 1,5,6. L'etichettatura degli organelli con proteine fluorescenti ha dato importanti contributi alla comprensione di come si sviluppa l'embrione precoce, di come trafficano i vari organelli e di come tale traffico sia modulato dallo sviluppo e geneticamente. Tuttavia, la loro propensione allo sbiancamento e le sfide di generare ceppi in cui più organelli sono etichettati con colori diversi limitano l'applicazione di questo approccio. L'uso di FP introdotti dalla microiniezione risolve molte di queste sfide e può anche essere combinato con proteine marcate fluorescentemente. Questa tecnica consente l'imaging di più organelli, strutture cellulari e componenti citoscheletrici in qualsiasi background genetico. Di conseguenza, diversi genotipi possono essere confrontati tramite imaging dal vivo, rendendo possibile determinare l'effetto delle mutazioni sul traffico di più organelli.
Questo protocollo dimostra l'approccio di iniezione FP per gli embrioni di Drosophila melanogaster, ma in linea di principio, questo approccio si applica a tutte le uova di insetto per le quali sono state stabilite tecniche di microiniezione, comprese altre specie di Drosophila, grilli22 e afidi23.

I coloranti vitali e le sonde molecolari sono potenti strumenti per l'immagine di specifiche strutture cellulari e organelli vivi. Nell'embrione di Drosophila, molti organelli diversi mostrano la localizzazione guidata dal citoscheletro 1,2,3,4, ma l'applicazione di queste piccole molecole è impegnativa perché il guscio d'uovo è impermeabile a molti di loro. Questo protocollo descrive un metodo per utilizzare sonde fluorescenti (FP) in embrioni vivi tramite microiniezione al fine di rilevare il traffico su larga scala di organelli. La procedura comprende la preparazione della soluzione di iniezione, la raccolta degli ovuli e la preparazione degli embrioni, la microiniezione, l'imaging e l'analisi delle immagini.
Drammatici riarrangiamenti spaziali di organelli sono comuni in molti ovociti, uova ed embrioni animali, in parte a causa delle grandi dimensioni di queste cellule. Nell'embrione di Drosophila , ad esempio, le goccioline lipidiche (LD) e le vescicole del tuorlo si muovono verso il centro embrionale poco prima della cellularizzazione5. Questo movimento dipende dai microtubuli e lascia una regione di ~ 40 μm intorno alla periferia dell'embrione impoverito dei due organelli. Durante le prime fasi di scissione, molti organelli vengono trasportati da flussi citoplasmatici che sono guidati da contrazioni a base di actina-miosina sulla superficie dell'embrione6. Sebbene gli embrioni di molte specie mostrino riarrangiamenti simili, l'embrione di Drosophila è particolarmente adatto per seguire questi processi mediante imaging perché si sviluppa esternamente a "temperatura ambiente" di laboratorio standard, è relativamente trasparente, abbastanza piccolo da adattarsi alla maggior parte delle configurazioni del microscopio e può essere manipolato utilizzando potenti strumenti genetici.
Per alcuni organelli, sono disponibili proteine marcate fluorescentemente che etichettano specificamente queste strutture. Ad esempio, LSD-2 (noto anche come dPLIN2) è una proteina che negli embrioni si rivolge specificamente alla LD7. Sono disponibili linee volanti che trasportano transgeni inducibili che codificano per una fusione tra Green Fluorescent Protein (GFP) e LSD-28 o una trappola genica in cui la proteina fluorescente gialla (YFP) viene inserita nella regione codificante del gene endogeno LSD-2 9,10. Tuttavia, questo approccio ha dei limiti, incluso il fatto che queste proteine di fusione hanno basse rese quantistiche e tendono a sbiancare facilmente. Inoltre, etichettare più strutture diverse contemporaneamente può essere difficile: per molti organelli, è attualmente disponibile un solo tipo di tag fluorescente (spesso GFP o mCherry), quindi l'imaging di due organelli contemporaneamente potrebbe richiedere nuovi transgeni o inserzioni; inoltre, anche se sono disponibili tag compatibili, introdurli in un singolo ceppo può richiedere incroci che richiedono tempo. Rende anche meno conveniente l'uso delle molte potenti risorse genetiche, ad esempio, se due marcatori di organelli, un driver Gal4 e un costrutto RNAi inducibile devono essere presenti nella stessa madre.
In linea di principio, queste limitazioni possono essere superate con l'uso di FP, inclusi coloranti vitali (ad esempio, LysoTracker per contrassegnare i lisosomi), sonde molecolari (ad esempio, SiR-tubulina per etichettare i microtubuli) e molecole biologiche marcate fluorescentemente (ad esempio, C12 BODIPY per sondare il metabolismo degli acidi grassi11). Dall'uso in cellule coltivate, sono in genere ben convalidati come potenti strumenti per sondare la biologia cellulare. Gli FP sono versatili, hanno proprietà fotografiche superiori e sono compatibili con le proteine fluorescenti. Più coloranti possono essere miscelati e applicati contemporaneamente, spesso con i benefici della separazione nelle aree viola / blu e rosso lontano dello spettro e piccoli spostamenti di Stokes, impedendo il sanguinamento del canale. Piccoli spostamenti stokes consentono l'acquisizione simultanea di più canali di imaging, consentendo il tracciamento di più organelli contemporaneamente. Infine, possono anche essere applicati all'etichettatura degli organelli negli embrioni di altre specie di Drosophila o anche di altri insetti in cui non possono essere disponibili proteine marcate fluorescentemente.
Tuttavia, la maggior parte di questi FP non può attraversare l'elaborato guscio d'uovo dell'embrione di Drosophila . Si compone di cinque strati: tre strati coriali esterni (corion) che prevengono danni meccanici più uno strato ceroso che circonda la membrana vitellina che crea una barriera chimica12. Per semplicità, la combinazione dello strato ceroso e della membrana vitellina sarà indicata come la "membrana vitellina" di seguito. Per bypassare il guscio d'uovo, questo protocollo adatta un approccio di microiniezione embrionale stabilito per introdurre FP nell'embrione di Drosophila . Il protocollo descrive come monitorare il flusso citoplasmatico di LD negli embrioni in fase di scissione. Comprende la preparazione di aghi per iniezione e gabbie per la raccolta delle uova, il processo di raccolta delle uova e la rimozione meccanica del corion. Esamina come microiniettare e visualizzare gli embrioni e come analizzare il flusso di massa di LD usando la velocimetria dell'immagine delle particelle (PIV, adattata da6). Fornisce consigli sulla risoluzione dei problemi per garantire la sopravvivenza degli embrioni e creare il miglior sistema per l'imaging. Si discute anche di come il protocollo possa essere modificato per visualizzare contemporaneamente LD e microtubuli o per applicarlo allo studio di altri organelli, inclusi lisosomi, mitocondri, vescicole di tuorlo e reticolo endoplasmatico (ER).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AUTODO</td>
			<td>abcepta</td>
			<td>SM1000a</td>
			<td>Stains lipid droplets in violet/blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3922</td>
			<td>Stains lipid droplets in green</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Beads &#8211;Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Company</td>
			<td>21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4350030000000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape</td>
			<td>Scotch (3M)</td>
			<td>-</td>
			<td>Sold by many vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E34251</td>
			<td>Stains the ER/nuclear envelope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femptotip II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H129354N</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Must be pulled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Buy the appropriate refractive index for your objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane 
			greener alternative 
			anhydrous, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654-1L</td>
			<td>Heptane is considered toxic by the USA&#39;s OSHA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Sp5</td>
			<td>Many different types of confocal microscopes will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidSpot 610</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70069</td>
			<td>Stains lipid droplets in far red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Stains lysosomes in red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoView 633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70055</td>
			<td>Stains mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle loading pipette tips - 20uL microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td># 5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000, Next Generation Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiR-Tubulin</td>
			<td>Cytosketon Inc</td>
			<td>CY-SC014</td>
			<td>Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransferMan</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5178 NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViaFluor 405</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70064</td>
			<td>Stains microtubules in violet/blue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing cytoskeleton-dependent trafficking of lipid-containing organelles in drosophila embryos

Gli embrioni precoci di Drosophila sono grandi cellule contenenti una vasta gamma di organelli convenzionali ed embrionali specifici. Durante le prime tre ore di embriogenesi, questi organelli subiscono movimenti drammatici alimentati dallo streaming citoplasmatico a base di actina e dal traffico motorio lungo i microtubuli. Lo sviluppo di una moltitudine di piccole sonde fluorescenti (FP) specifiche per organelli consente di visualizzare una vasta gamma di diverse strutture contenenti lipidi in qualsiasi genotipo, consentendo l'imaging dal vivo senza richiedere un fluoroforo geneticamente codificato. Questo protocollo mostra come iniettare coloranti vitali e sonde molecolari negli embrioni di Drosophila per monitorare il traffico di organelli specifici mediante imaging dal vivo. Questo approccio è dimostrato etichettando le goccioline lipidiche (LD) e seguendo il loro movimento di massa mediante velocimetria dell'immagine delle particelle (PIV). Questo protocollo fornisce una strategia suscettibile allo studio di altri organelli, tra cui lisosomi, mitocondri, vescicole di tuorlo e ER, e per tracciare il movimento dei singoli LD lungo i microtubuli. L'uso di coloranti disponibili in commercio porta i benefici della separazione nelle regioni viola / blu e rosso lontano dello spettro. Mediante la co-etichettatura multiplex di organelli e/o elementi citoscheletrici tramite microiniezione, tutte le risorse genetiche in Drosophila sono disponibili per studi di traffico senza la necessità di introdurre proteine marcate in modo fluorescente. A differenza dei fluorofori geneticamente codificati, che hanno basse rese quantistiche e candeggina facilmente, molti dei coloranti disponibili consentono la cattura rapida e simultanea di diversi canali con elevate rese di fotoni.

Dopo l'iniezione, il colorante sarà localizzato solo nel sito in cui è stata inserita la punta dell'ago. Il colorante si diffonderà quindi lontano dal sito di iniezione a seconda delle sue caratteristiche diffusive. La Figura 1 mostra l'iniezione di BODIPY 493/503, subito dopo l'iniezione (pannello A) e 24 minuti dopo (pannello B). Dopo 24 minuti, il colorante è arrivato all'incirca al punto medio dell'asse lungo dell'embrione.
L'analisi della motilità degli organelli può essere ottenuta attraverso iniezioni di coloranti e imaging time-lapse. Nella Figura 2, un embrione è stato co-iniettato con BODIPY 493/503 (Figura 2A) e LysoTracker Red (Figura 2B) e ripreso utilizzando l'eccitazione laser a 488 e 596 nm, rispettivamente. Questo embrione è stato poi ripreso in time-lapse (un fotogramma ogni 30 s per 30 min, 5 min analizzati). La serie temporale è stata quindi eseguita attraverso l'analisi PIV, il cui output è mostrato tramite streamline nella Figura 2A, B. Si noti che le linee di flusso non rappresentano la traiettoria delle singole particelle, ma il flusso citoplasmatico viene dedotto dall'analisi di tutte le particelle in quella regione del citoplasma. Attraverso l'etichettatura di due strutture cellulari indipendenti (LD e organelli acidi), l'analisi PIV trova flussi simili, con entrambe le etichette che convergono sulla regione centrale dell'embrione dove il citoplasma scorre nell'interno dell'embrione6.
Gli FP attualmente disponibili consentono l'etichettatura di molti altri organelli e strutture cellulari. La Figura 3 mostra l'etichettatura dell'ER tramite il tracker ER Green. Il tracker ER fornisce una buona risoluzione dell'involucro nucleare, consentendo la visualizzazione delle principali fasi del ciclo cellulare. Il tracker ER Green viene ripreso utilizzando l'eccitazione a 488 nm.
L'etichettatura dei mitocondri è complicata, poiché la maggior parte dei coloranti testati sembra essere intrappolata nel primo mitocondrio in cui entrano. D'altra parte, non è stato rilevato alcun segno di tossicità del colorante, rendendo possibile seguire i mitocondri marcati attraverso la cellularizzazione e il ciclo nucleare ectodermico 15. La Figura 4 mostra una cellula ectodermica diverse ore dopo l'iniezione con Mitoview 633 (lunghezza d'onda di eccitazione 633 nm).
BODIPY, Lysotracker e LipidSpot sono robusti e possono essere utilizzati per acquisire ~ 500 + immagini a 512 x 512, media di linea 3, frame rate da 1 / s a 0,1 / s. ER tracker Green, SiR-tubulina e i coloranti mitocondriali menzionati sono meno robusti e producono ~ 50-200 immagini nelle stesse condizioni.
A partire dagli stadi di blastoderma, gli LCD si muovono bidirezionalmente lungo i microtubuli, alimentati dai motori a polarità opposta kinesin-1 e dineina citoplasmatica5. Questo movimento può essere visualizzato co-etichettando LD e microtubuli iniettando sia BODIPY 493/503 che SiR-Tubulin (Figura 5). Poiché gli LCD spesso invertono la loro direzione di movimento (mentre passano tra kinesin-1 e dineina citoplasmatica), frame rate più elevati durante l'acquisizione catturano meglio i dettagli critici della motilità LD.
L'imaging dal vivo delle vescicole autofluorescenti del tuorlo è possibile senza alcuna forma di iniezione di colorante (Figura 6). Tuttavia, l'autofluorescenza è debole e il laser di eccitazione è fototossico. Pertanto, l'imaging dal vivo del tuorlo autofluorescente ha uno scarso rapporto segnale-rumore rispetto all'iniezione di colorante.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig01.jpg"> Figura 1: Diffusione di BODIPY 493/503 attraverso l'embrione. Il colorante è stato iniettato lungo il bordo laterale verso l'estremità anteriore (in alto a destra) e si diffonde da questo sito di iniezione nell'embrione, etichettando LDs. (A) Il colorante si è diffuso attraverso porzioni dell'embrione adiacenti al sito di iniezione. (B) Circa 24 min/2 cicli nucleari dopo, il colorante si è diffuso oltre il punto medio dell'embrione. Barra di scala: 100 μm. Un telaio 1024 x 1024 (linea media 4) è stato acquistato ogni 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig02.jpg"> Figura 2: Velocimetria a immagini di particelle (PIV) per LD e organelli acidi. Un embrione è stato iniettato sia con BODIPY 493/503 che con LysoTracker Red. (A) Canale BODIPY. (B) Canale rosso LysoTracker. (A',B') Semplifica i diagrammi generati dall'analisi PIV dei due canali generati da 10 fotogrammi sequenziali, inclusi quelli mostrati in A e B. A' corrisponde al flusso di LD, e B' corrisponde al flusso di organelli acidi. Si noti che sia A' che B' mostrano una confluenza a sinistra del centro in cui il contenuto embrionale fluisce fuori dal piano visivo, nel centro dell'embrione. Inoltre, si noti che BODIPY ha diffuso più di LysoTracker poiché diversi coloranti hanno proprietà diffusive diverse. Barra di scala: 100 μm. Un telaio 1024 x 1024 (linea media 4) è stato acquistato ogni 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig03.jpg"> Figura 3: Il tracker ER etichetta le divisioni nucleari sinciziali. Un embrione di blastoderma sinciziale è stato microiniettato con ER tracker e una parte della sua superficie è stata fotografata nel tempo. (A) Assemblaggio del mandrino durante una divisione nucleare. (B) Abscissione dell'involucro nucleare durante la stessa divisione. (C) Successive interfasi. (D) L'inizio della divisione successiva è indicato dall'aspetto centrosomico (presenza di regioni circolari prive di ER, contrassegnate da punte di freccia). Si noti il graduale sbiancamento della tintura. Lunghezza d'onda di eccitazione: 488 nm. Barra della scala: 5 μm. A: fotogramma iniziale, B: 3 minuti trascorsi, C: 10 minuti trascorsi, D: 13 minuti trascorsi. Un telaio 1024 x 1024 (linea media 4) è stato acquistato ogni 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig04.jpg"> Figura 4: Mitoview 633 etichettatura dei mitocondri. Un embrione è stato iniettato con Mitoview 633 durante lo stadio di blastoderma sinciziale e fotografato 4 ore dopo, dopo la cellularizzazione. L'immagine mostra una cellula neuroectodermica di un embrione in estensione della banda germinale. Barra scala: 5 μm. Un telaio 1024 x 1024 (linea media 4) è stato acquistato ogni 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig05.jpg"> Figura 5: Co-etichettatura di LD e microtubuli. Un embrione cellularizzante è stato iniettato con una miscela di BODIPY 493/503 (giallo A,B,C) e SiR Tubulina (magenta A',B',C'). A'', B'', C'' mostrano i canali uniti. I pannelli A, A'' e A'' mostrano la cornice iniziale, i pannelli B, B' e B'' mostrano la cornice dopo 5 s, e i pannelli C, C' e C'' mostrano la cornice dopo 10 s. Barra scala: 5 μm. Un telaio 512 x 512 (linea media 3) è stato acquistato ogni 2,5 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig06.jpg"> Figura 6: Imaging dell'autofluorescenza della vescicola del tuorlo durante le fasi di scissione sinciziale. (A) All'inizio dell'acquisizione. (B) Dopo 8 min. (C) Dopo 16 min. Lunghezza d'onda di eccitazione: 405 nm. Una bassa intensità di eccitazione è stata utilizzata per mantenere in vita l'embrione. Barra di scala: 100 μm. Un telaio 1024 x 1024 (linea media 4) è stato acquistato ogni 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Dati supplementari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/PIV_analysis_script_Kilwein_Welte_JoVE_2021.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

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Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Nel primo embrione di Drosophila , molti organelli sono mobili. In linea di principio, possono essere ripresi dal vivo tramite specifiche sonde fluorescenti, ma il guscio d'uovo impedisce l'applicazione diretta all'embrione. Questo protocollo descrive come introdurre tali sonde tramite microiniezione e quindi analizzare il movimento degli organelli di massa tramite velocimetria dell'immagine delle particelle .

Visualizzazione del traffico citoscheletro-dipendente di organelli contenenti lipidi in embrioni di Drosophila

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Nel primo embrione di Drosophila, molti organelli subiscono un movimento su larga scala. Il nostro protocollo descrive come monitorare questo movimento utilizzando coloranti fluorescenti sviluppati per la coltura cellulare. Rispetto alle proteine fluorescenti, le sonde fluorescenti disponibili in commercio sono più luminose e coprono una gamma più ampia dello spettro.Consentono la colabeling multiplex e possono essere utilizzati in qualsiasi background genetico. Ci vuole pratica e tentativi ed errori per sapere quanto tempo per essiccare gli embrioni, in modo che scoppino durante l'iniezione o si secchino e smettano di svilupparsi. Per iniziare, iniziare a preparare gli aghi per iniezione posizionando il capillare in un supporto capillare sull'estrattore dell'ago e fissandolo con i dadi alari.Allineare il centro del capillare con l'elemento riscaldante. Secondo le istruzioni del produttore, scegliere le impostazioni appropriate sull'estrattore dell'ago. Utilizzando un microscopio di dissezione, eseguire il test di controllo qualità.Premere gli aghi nello stucco orizzontalmente con le punte dell'ago sospese nell'aria. Coprire gli aghi con il coperchio e conservare fino all'uso. Utilizzando punte di carico dell'ago attaccate a una micropipetta, aspirare un microlitro della soluzione di iniezione nella punta senza intrappolare bolle d'aria.Usando i guanti, tenere l'ago in una mano con la punta rivolta verso l'esterno e inserire la punta di carico in esso. Erogare il liquido vicino alla punta dell'ago, rimuovere la pipetta e tenere l'ago verticalmente fino a quando il liquido scorre verso la punta. Coprire il contenitore con un foglio di alluminio senza danneggiare le punte degli aghi per evitare lo sbiancamento dei coloranti.Utilizzando una pipetta di trasferimento o un micropipettero, posizionare una piccola goccia di colla eptana al centro di una scivolata di copertura rettangolare e lasciarla evaporare. Per rimuovere meccanicamente il corion, coprire la piastra embrionale opportunamente invecchiata con un sottile strato di olio di alocarbonio 27 per trasformare il guscio d'uovo trasparente. Visualizza la piastra sotto un microscopio di dissezione con illuminazione trans per confermare lo stadio embrionale e selezionare gli embrioni nelle fasi di scissione.Usando una pinzetta fine, raccogli un embrione dello stadio desiderato afferrando le appendici dorsali e trasferiscilo sul vetrino preparato coperto con nastro biadesivo. Posizionare l'embrione sul nastro e ridurre al minimo il trasferimento di olio. Arrotolare delicatamente l'embrione sulla superficie del nastro spingendo con il lato della punta della pinzetta senza colpirlo direttamente.Continuare a rotolare l'embrione fino a quando il corion aderisce al nastro e si incrina. Dopo che il corion si è incrinato, continua a rotolare l'embrione per separarlo dal corion, che rimane attaccato al nastro. Arrotolare l'embrione sul corion, che è meno adesivo del nastro.Strofinare delicatamente l'embrione con le pinzette fino a quando non si attacca alle pinzette per il trasferimento. Quindi, trasferire l'embrione sul coperchio e portarlo a contatto con la colla per tenere l'embrione in posizione, separandolo dalle pinzette. Regolare l'orientamento dell'embrione sul coperchio.Lasciare che gli embrioni si secchino per cinque-12 minuti posizionando il coperchio con gli embrioni nella camera di essiccazione e sigillandolo. Togliere il coperchio dalla camera e mettere una goccia di olio di alocarbonio 700, coprendo gli embrioni per evitare ulteriori essiccazioni. Esaminarli sotto l'ambito di dissezione e procedere alla microiniezione se gli embrioni sono stati essiccati correttamente.Posiziona l'obiettivo 4X nel percorso della luce e, utilizzando la manopola di messa a fuoco sul microscopio, regola gli embrioni a fuoco. Sposta gli embrioni orizzontalmente al centro del campo visivo usando i controlli del palcoscenico. Tenere gli embrioni ai margini del campo visivo e allontanarsi in preparazione per abbassare l'ago.Rimanendo sullo stesso piano focale, abbassare la punta dell'ago e assicurarsi che sia visibile nel campo visivo insieme agli embrioni. Controllare che l'ago funzioni erogando parte della soluzione di iniezione in olio di alocarbonio 700. In caso di successo, una bolla di soluzione apparirà nell'olio vicino alla punta dell'ago.Usando i controlli di stadio, spostare l'embrione verso la punta dell'ago fino a quando la punta non perfora delicatamente l'embrione ed entra in esso. Contemporaneamente, iniziare il flusso della soluzione iniettabile fino a quando non appare un punto chiaro transitorio nel sito della punta dell'ago, indicando il successo del trasferimento della soluzione nell'embrione. Fissare il coperchio sul microscopio confocale utilizzando il supporto del vetrino.Prestare attenzione in quanto lo slittamento del coperchio è fragile. Ispezionare gli embrioni utilizzando la funzione di epifluorescenza sul microscopio confocale con un obiettivo 40X e assicurarsi che il fluoro 4 nell'embrione sia visibile prima di procedere. Per l'imaging dal vivo, durante le fasi sinciziali, impostare le dimensioni dell'immagine di 512 x 512 pixel, la media delle linee di tre e una frequenza fotogrammi di 0,1 fotogrammi al secondo.Dopo l'iniezione del colorante BODIPY 493 503, è stato localizzato nel sito in cui è stata inserita la punta dell'ago e quindi diffuso adiacente al sito di iniezione. Dopo 24 minuti, il colorante si è diffuso oltre il punto medio dell'embrione. La motilità degli organelli è stata monitorata iniettando nell'embrione BODIPY 493 503 e LysoTracker Red.L'analisi velocimetrica dell'immagine delle particelle ha rivelato che il contenuto embrionale convergeva sulla regione centrale dell'embrione, dove il citoplasma scorre all'interno dell'embrione. L'etichettatura dell'ER, utilizzando ER-Tracker Green, fornisce una risoluzione vivida dell'involucro nucleare, consentendo la visualizzazione delle principali fasi del ciclo cellulare. L'embrione è stato iniettato con MitoView 633 allo stadio di blastoderma e ripreso quattro ore dopo.L'immagine mostra una cellula neuroectodermica di un embrione in estensione della banda germinale. Un embrione cellularizzante è stato iniettato con una miscela di BODIPY 493 503 e Tubulina SiR, che mostra che le goccioline lipidiche si muovono bidirezionalmente lungo i microtubuli. L'embrione deve essere parzialmente essiccato in modo che il liquido possa essere iniettato.Troppo poco essiccazione causerà la fuoriuscita dell'embrione quando iniettato, troppo essiccazione ucciderà l'embrione. I video di organelli in movimento possono essere caratterizzati attraverso diverse tecniche di analisi delle immagini. Il tracciamento delle particelle rivela il comportamento dei singoli organelli, la velocimetria di imaging delle particelle rivela il flusso di massa.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-bersaglio Cromogenico Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione per il confronto Gene domini di espressione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

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Ricerca

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Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Imaging confocale e a super-risoluzione del traffico intracellulare polarizzato e della secrezione di proteine della membrana basale durante l'oogenesi della drosophila

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility in Drosophila

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos (Video) | JoVE 

Inibizione optogenetica della contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 accoppiata alla misurazione della tensione epiteliale negli embrioni di Drosophila

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...