Name: visualizing cytoskeleton-dependent trafficking of lipid-containing organelles in drosophila embryos
Uploaded: 2021-12-13T13:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos at JoVE.com

Vi takker Pakinee Phromsiri, Brian Jencik, Jinghong (James) Tang og Roger White for deres kommentarer til manuskriptet. Vi takker Patrick Oakes, Stefano Di Talia og Victoria Deneke for å ha delt sin ekspertise om hvordan man utfører PIV-analyse. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd F31 HD100127 (til M. D. K.) og R01 GM102155 (til M. A. W).

<ol>
	<li>Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+organization+and+function+in+the+Drosophila+blastoderm+embryo.">Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).</li><li>Mavor, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab8+directs+furrow+ingression+and+membrane+addition+during+epithelial+formation+in+Drosophila+melanogaster.">Rab8 directs furrow ingression and membrane addition during epithelial formation in Drosophila melanogaster.</a> Development. 143 (5), 892-903 (2016).</li><li>Riggs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeleton+remodeling+during+early+Drosophila+furrow+formation+requires+recycling+endosomal+components+Nuclear-fallout+and+Rab11.">Actin cytoskeleton remodeling during early Drosophila furrow formation requires recycling endosomal components Nuclear-fallout and Rab11.</a> Journal of Cell Biology. 163 (1), 143-154 (2003).</li><li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos:+forces+and+kinetics.">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92 (4), 547-557 (1998).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=As+the+fat+flies:+The+dynamic+lipid+droplets+of+Drosophila+embryos.">As the fat flies: The dynamic lipid droplets of Drosophila embryos.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (9), 1156-1185 (2015).</li><li>Deneke, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+nuclear+positioning+synchronizes+the+cell+cycle+in+Drosophila+embryos.">Self-organized nuclear positioning synchronizes the cell cycle in Drosophila embryos.</a> Cell. 177 (4), 925-941 (2019).</li><li>Welte, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+perilipin+homolog+LSD2.">Regulation of lipid-droplet transport by the perilipin homolog LSD2.</a> Current Biology. 15 (14), 1266-1275 (2005).</li><li>Bailey, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+role+for+lipid+droplets+in+a+stem+cell+niche+of+Drosophila.">Antioxidant role for lipid droplets in a stem cell niche of Drosophila.</a> Cell. 163 (2), 340-353 (2015).</li><li>Johnson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2Av+buffering+via+dynamic+sequestration+to+lipid+droplets+in+Drosophila+embryos.">H2Av buffering via dynamic sequestration to lipid droplets in Drosophila embryos.</a> Elife. 7, 36021 (2018).</li><li>Lowe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+expression+patterns,+subcellular+localisations+and+interaction+partners+of+Drosophila+proteins+using+a+pigP+protein+trap+library.">Analysis of the expression patterns, subcellular localisations and interaction partners of Drosophila proteins using a pigP protein trap library.</a> Development. 141 (20), 3994-4005 (2014).</li><li>Rambold, A. S., Cohen, S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+trafficking+in+starved+cells:+regulation+by+lipid+droplet+lipolysis,+autophagy,+and+mitochondrial+fusion+dynamics.">Fatty acid trafficking in starved cells: regulation by lipid droplet lipolysis, autophagy, and mitochondrial fusion dynamics.</a> Developmental Cell. 32 (6), 678-692 (2015).</li><li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules.">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).</li><li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+centrifugation+of+Drosophila+embryos.">In-vivo centrifugation of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+collection.">Drosophila embryo collection.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li><li>Wieschaus, E., N&#252;sslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).</li><li>. The Interactive Fly: Stages of Development and Mitotic Domains Available from: <a target="_blank" href="https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm">https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm</a> (1999)</li><li>Liberzon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OpenPIV/openpiv-python: OpenPIV - Python (v0.22.2) with a new extended search PIV grid option. , (2020).</li><li>Markow, T. A., Beall, S., Matzkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+size,+embryonic+development+time+and+ovoviviparity+in+Drosophila+species.">Egg size, embryonic development time and ovoviviparity in Drosophila species.</a> Journal of Evolutionary Biology. 22 (2), 430-434 (2009).</li><li>Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein-mediated+cargo+transport+in+vivo.+A+switch+controls+travel+distance.">Dynein-mediated cargo transport in vivo. A switch controls travel distance.</a> Journal of Cell Biology. 148 (5), 945-956 (2000).</li><li>Debarre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+lipid+bodies+in+cells+and+tissues+using+third-harmonic+generation+microscopy.">Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy.</a> Nature Methods. 3 (1), 47-53 (2006).</li><li>Dou, W., Zhang, D., Jung, Y., Cheng, J. X., Umulis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+lipid-droplet+intracellular+motion+in+early+Drosophila+embryos+using+femtosecond-stimulated+Raman+loss+microscopy.">Label-free imaging of lipid-droplet intracellular motion in early Drosophila embryos using femtosecond-stimulated Raman loss microscopy.</a> Biophysical Journal. 102 (7), 1666-1675 (2012).</li><li>Barry, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injecting+Gryllus+bimaculatus+Eggs.">Injecting Gryllus bimaculatus Eggs.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), (2019).</li><li>Le Trionnaire, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+protocol+for+targeted+mutagenesis+with+CRISPR-Cas9+system+in+the+pea+aphid.">An integrated protocol for targeted mutagenesis with CRISPR-Cas9 system in the pea aphid.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 110, 34-44 (2019).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Drosophila-embryoet er en kraftig og praktisk modell for å studere grunnleggende spørsmål i cellulær og organismebiologi. Dens relative enkelhet, kraftige genetikk og liten størrelse gjør det til et utmerket system for avbildning av både cellulære prosesser og utvikling. Her er en standard mikroinjeksjonsprotokoll tilpasset for å muliggjøre FP-bruk i embryoer. Denne tilnærmingen muliggjør fluorescerende avbildning av spesifikke cellulære strukturer uten behov for genetisk kodede fluoroforer, og åpner mange genetiske bakgrunner for avbildning. Kombinere flere fargestoffer pluss strategisk utvalgte fluorescerende merkede proteiner kan åpne flerkanals levende bildebehandling som spenner over hele spekteret av synlig lys.
Kritiske trinn i protokollen: Denne protokollen bruker BODIPY 493/503 til å merke LDer. Denne tilnærmingen kan enkelt tilpasses for å markere andre cellulære strukturer. For etterfølgende bildeanalyse er en av de viktigste faktorene signal-til-støy-forholdet, det vil si lysstyrken på fargestoffet sammenlignet med bakgrunnssignalet. Lysosomer har blitt avbildet (LysoTracker Red, 1 mM), samt mitokondrier (Mitoview 633, 200 μM), ER (ER tracker Green, 10 μM) og mikrotubuler (SiR tubulin, 200 nM i DMSO), som vist i figur 2, figur 3, figur 4, figur 5. I tillegg er eggeplomme vesikler autofluorescent og avgir blått lys på UV-eksitasjon (bilde som bruker 405 nm som eksitasjonsbølgelengde (figur 6)). For andre fargestoffer, ta sikte på at fargekonsentrasjonen skal være 100-1000x av det som trengs for farging av dyrkede celler lever; Dette ligner konsentrasjonen av en lagerløsning som vil bli fortynnet i cellekulturmedier. Ettersom denne protokollen krever en injeksjon på 100 fL og Drosophila-embryoet er omtrent 9 nL i volum18, vil disse fargekonsentrasjonene i gjennomsnitt være en intern embryonal konsentrasjon på under 1/100 av det som er tilstede i cellekulturmediene. Midlertidig vil den lokale konsentrasjonen være høyere på injeksjonsstedet, noe som er mest relevant for FPs som ikke diffuserer godt (dvs. mitokondriefarger og SiR-tubulin). For disse FPs, start ved anbefalte høye konsentrasjoner; Hvis uventet død observeres, fortynn to ganger til et akseptabelt kompromiss mellom overlevelse og signalstyrke nås.
Ved samtidig injeksjon av flere fargestoffer bør begge fargestoffene enten være i samme løsningsmiddel, eller både løsningsmidlene og fargestoffene skal være kompatible med blandingen (alkoholkonsentrasjoner over ~ 10% anbefales ikke).
Kvaliteten på nålene er avgjørende for suksessen til denne prosedyren, da spissen må være så fin som mulig. Ellers kan skade fra injeksjonssår kompromittere den etterfølgende utviklingen av embryoet. Ettersom kommersielle nåletrekkere er forskjellige, er det viktig å følge produsentens forslag og prøve ut flere trekkparametere til ønsket form er oppnådd. Det er viktig å utføre kvalitetskontrolltrinnet 1.1.3, da arbeid med en sprukket, hakket eller stor borenålspiss vil gjøre den vellykkede injeksjonen vanskeligere eller til og med umulig.
Embryoet må delvis uttørkes slik at ytterligere mengder væske kan tilsettes under injeksjonen. Hvis embryoet er under-tørket, vil nålen ikke komme lett inn, og cytoplasma vil sprute ut når nålen trenger inn eller når løsningen injiseres. Hvis embryoet er overtørket, vil det se deflatert ut og vil ikke utvikle seg riktig. Den nøyaktige tørketiden avhenger av lokale forhold, for eksempel luftfuktighet, og kan endres fra dag til dag. Det må bestemmes empirisk for hver økt.
Embryoets evne til å overleve etter mikroinjeksjon avhenger kritisk av nålens kvalitet, riktig uttørking og begrensning av injeksjonsvolum til mindre enn 1 pL (ideelt 100 fL). Så lenge disse parametrene er optimalisert, er det ikke tydelig noen betydelig toksisitet når de beskrevne fargestoffene injiseres ved de anbefalte konsentrasjonene. Hvis embryoer overlever uttørkings- og injeksjonstrinnene, utvikler de seg vanligvis godt til bakteriebåndforlengelse, et unntak er mikrotubul- og ER-sondene som forårsaket cellulariseringsfeil på høye nivåer (100 fL injeksjon av lagerkonsentrasjonen av hver). Testing fant ingen åpenbare utviklingsfeil da DMSO, vann og blandinger av de to ble injisert ved de anbefalte volumene, med en embryooverlevelsesrate gjennom bakteriebåndforlengelse på ~ 75% eller mer. Injeksjonsvolumer mer enn 1 pL forårsaket defekter og embryoer injisert med ~ 4 pL volumer utviklet i mindre enn 1 time. Derfor må injeksjonsvolumene holdes lave, noe som betyr at fargekonsentrasjonene må være høye.
Generelt anbefales injeksjoner langs embryoets laterale kant, da de resulterer i minst skade. Det kan imidlertid hende at injeksjonsstedet må justeres avhengig av de diffusive egenskapene til FPs sysselsatte. BODIPY 493/503 og LysoTracker sprer seg raskere over hele embryoet enn Lipid Spot 610 (et annet fargestoff for å markere LD-er), mens SiR-Tubulin og Mitoview 633 aldri sprer seg fullt ut over embryoet (avbildning så sent som 7 timer etter injeksjon). Dermed kan injeksjon i eller i nærheten av interessestedet være nødvendig. Ved injeksjon i de fremre eller bakre områdene anbefales en spesielt fin nål.
Bildeanskaffelse er avhengig av konfektmikroskopi for optisk seksjon og løser små organeller og alle cytoskeletale komponenter. Teknikker som krever analyse av mange bilder (f.eks. STORM eller PALM) vil ikke fungere fordi det embryonale innholdet er i bevegelse og fluoroforene ikke er optimalisert for fotoswitching. Epifluorescence mikroskopi mangler lateral og aksial oppløsning for å gjøre ut de fleste organeller og mindre cellulære strukturer. Av disse grunnene anbefales det sterkt å bruke et konfokalt mikroskop eller bruke lysarkteknologi.
Reproduserbarheten til bildeanalysen er i stor grad avhengig av konsistente bildedata. For størst mulig sjanse for å lykkes, er det nødvendig med optimalisering av injeksjonsteknikken og bildeanskaffelse. Etablering og praktisering av en teknikk der fargestoff(er) av interesse, injeksjonssted, embryoets alder, injeksjonsvolum og oppkjøpsoppsett er alle konsistente, vil generere de mest robuste dataene for bildeanalyse.
Endringer og feilsøking av metoden Denne protokollen demonstrerer en metode for å analysere bulkstrømmen av LP-er i spaltingsstadiumembryoer ved hjelp av partikkelbildehastighet. Den samme tilnærmingen kan brukes til andre organeller, andre utviklingsstadier og andre analysemetoder. Figur 2 viser for eksempel analyse av LD-er og sure organeller som strømmer i synytialstadiene av embryogenese, visualisert ved samtidig injisering av BODIPY 493/503 og LysoTracker Red. Ytterligere vellykket avbildning av LD-bevegelse i embryoer opptil 7 timer etter befruktning er oppnådd; Disse embryoene beholder injeksjonssåret, men er i stand til å utvikle seg i flere timer.
Data samlet inn ved hjelp av denne protokollen har blitt brukt til partikkelbilde velocimetry, men mange andre analyseteknikker er tilgjengelige. For eksempel kan partikkelsporingsprogrammer som de som finnes i ImageJ, Imaris eller manuell sporing brukes til å oppnå hastigheter og direksjonaliteter av bevegelige strukturer. Vær oppmerksom på at de fleste slike sporingsprogramvare er bygget for å fungere med data fra planare cellekultursystemer og tilpasser seg ikke alltid godt til 3D-strukturer som Drosophila-embryoet . Videre, for generering av partikkelsporingsdata av beste kvalitet, må flere Z-fly avbildes; Dette bør være mulig hvis anskaffelsestidene for bildestakken er under ~2 s. Denne referansen bør nås på roterende platekonfekt, gitterlysark og nyere laserskanningskontrodokale systemer. Imidlertid er muligheten for partikkelsporing for rikelige organeller som LP-er, mitokondrier og lysosomer lave, da mengden positivt signal i et synsfelt er for høy for de nåværende sporingsmetodene. Sporing av mindre rikelige strukturer som nuklei eller eggeplomme vesicles kan være mulig. PIV for strømningsanalyse fungerer bra for LP-er og sure organeller i spaltingsstadier fordi begge organellene beveger seg fritt. Organeller som nuklei, ER og mitokondrier er bundet til andre cellulære strukturer og beveger seg dermed ikke fritt og er ikke egnet til programvareanalyse som antar fri bevegelse. Etterforskeren bør velge teknikkene som passer best til organellet av interesse.
I løpet av de synytiale og cellulære blastodermstadiene beveger LDer (så vel som noen andre organeller) seg langs radialorienterte mikrotubuler5. Det er derfor mulig å finne tverrsnittsvisninger (som i figur 5) der enkle mikrotubuler er i fokus for lange avstander, slik at partikkelsporing i 2D. Siden disse optiske flyene er dypt inne i embryoet, reduseres den generelle signalstyrken, og signal-til-støy-forholdet reduseres.
For sporingsanalyse kan bildebehandling så raskt som mulig avsløre viktige detaljer om bevegelsen og dermed av motile maskineriet. For eksempel er lipiddråpebevegelse en blanding av to motile tilstander, langsom kort bevegelse (~ 200 nm / s; gjennomsnittlig reiseavstand ~ 100 nm) og rask lang bevegelse (~ 450 nm / s; gjennomsnittlig reiseavstand ~ 1,000 nm)19; Dermed, hvis bilder tas hvert sekund eller enda sjeldnere, blir den langsomme korte tilstanden uoppdagelig. Hyppig avbildning induserer imidlertid også fluoroforbleking og fototoksisitet. Bildeforholdene må derfor justeres avhengig av det nøyaktige spørsmålet som skal tas opp.
Begrensninger ved metoden Avhengig av ønsket fargestoff, kan metoden begrenses av kompatibiliteten mellom fargestoffløseligheten og toksisiteten til injeksjonsoppløsningen. Alkoholer som isopropanol og etanol er vanskelige å håndtere i en nål på grunn av deres lavere viskositet og ser ut til å skade cellulære komponenter og drepe embryoet.
Metoden er heller ikke godt egnet for visualisering av de tidligste trinnene i embryogenese fordi det tar 30+ min å forberede embryoene til injeksjon. Ved romtemperatur er embryoets første cellesykluser bare ~ 10 min lange hver; Så selv om man skulle velge et nylig befruktet egg i trinn 5.2.3, ville de første cellesyklusene allerede være fullført når embryoet er klart for avbildning.
Belysning med lys i UV/blå rekkevidde er betydelig mer fototoksisk enn for lengre bølgelengder. Under slike forhold (f.eks. for å følge autofluorescent eggeplomme vesicles; Figur 6), må man begrense bildetiden (noe som fører til kortere tidsserier) eller bruke lavere lasereffekt (noe som resulterer i redusert signal-til-støy-forhold).
Etter cellulærisering har fargestoffer injisert på et bestemt sted en tendens til å diffusere dårlig, da de må krysse mange cellemembraner. Dette begrenser observasjonsområdet i senere utviklingsstadier.
Metodens betydning med hensyn til eksisterende/alternative metoder Bevegelsen av LP-er og andre lipidholdige organeller i tidlige embryoer kan visualiseres med genetisk kodede fluoroforer, etikettfrie teknikker og ved innføring av FPs. Sistnevnte kan oppnås ved permeabilisering av vitellinemembranen12 eller mikroinjeksjonsmetoden som er diskutert her.
Genetisk kodede fluoroforer er allsidige markører hvis nivåer vanligvis er svært reproduserbare fra embryo til embryo. Imidlertid har de lavere kvanteutbytte og blekemiddel lettere enn FPs. Vanligvis er de bare tilgjengelige i en eller to kodede versjoner (f.eks. GFP eller mCherry), noe som begrenser valget av hvilke strukturer som kan avbildes samtidig. FPs, derimot, eksisterer ofte i et stort utvalg; For eksempel er ulike lipiddråpespesifikke fargestoffer tilgjengelige med utslippsspektra fra Autodot i UV / blått spektrum til Lipidtox og LipidSpot 610 i det fjerne røde spekteret. FPs kan også brukes direkte på enhver interessestamme, og krever derfor ikke belastningskonstruksjon for for eksempel å introdusere ønsket organellemarkør i en mutant interessestamme. Denne fordelen er spesielt uttalt når flere strukturer skal merkes samtidig; I stedet for tidkrevende kryss som spenner over flere generasjoner, kan dette oppnås på en enkelt dag ved å blande de relevante fargestoffene og introdusere dem samtidig. Til slutt, hvis cellulære prosesser skal undersøkes med farmakologisk hemming, kan medisiner og fargestoffer innføres sammen.
Etikettfrie metoder er svært kraftige tilnærminger for å oppdage spesifikke cellulære strukturer. For eksempel kan LDer spesifikt påvises i tidlige embryoer ved tredje harmonisk generasjon mikroskopi20 eller ved femtosecond Stimulert Raman Loss mikroskopi21. I likhet med FPs kan disse tilnærmingene brukes i hvilken som helst genetisk bakgrunn, og fordi de ikke forårsaker bleking, tillater de potensielt raskere bildeanskaffelse. Imidlertid er de vanligvis begrenset til spesifikke organeller og støtter dermed ikke i seg selv multipleksavbildning; de krever også spesialiserte mikroskoper.
Det er to generelle strategier for å introdusere små molekyler i embryoer. Den ene er mikroinjeksjonsmetoden som brukes her; den andre er kjemisk (terpen) behandling for å permeabilisere vitellinemembranen. Sistnevnte tilnærming12 er mindre involvert enn mikroinjeksjon, men også mer variabel fra embryo til embryo. I tillegg, etter permeabilisering, er beskyttelsen fra vitellinemembranen kompromittert og embryoet riktig er tilgjengelig for det eksterne mediet, noe som gjør det mer utfordrende å holde det i live. Mikroinjeksjon er mye mindre sannsynlig å avspore embryonal utvikling enn permeabilisering. Permeabilisering anbefales imidlertid hvis mange embryoer må overvåkes samtidig, for eksempel for narkotikascreening. For å følge bevegelsen av cellulære strukturer og oppnå reproduserbare bildeserier som er egnet for bildeanalyse, er mikroinjeksjon den valgte metoden.
Viktigheten og potensielle anvendelser av metoden på spesifikke forskningsområder Drosophila-embryoet er et viktig modellsystem for å studere mange cellebiologiske og utviklingsmessige prosesser 1,5,6. Merking av organeller med fluorescerende proteiner har gitt store bidrag til forståelsen av hvordan det tidlige embryoet utvikler seg, hvordan ulike organeller trafikkerer, og hvordan slik menneskehandel moduleres utviklingsmessig og genetisk. Imidlertid begrenser deres tilbøyelighet til blekemiddel og utfordringene med å generere stammer der flere organeller er merket med forskjellige farger, anvendelsen av denne tilnærmingen. Bruken av FPs introdusert av mikroinjeksjon løser mange av disse utfordringene og kan til og med kombineres med fluorescerende merkede proteiner. Denne teknikken tillater avbildning av flere organeller, cellestrukturer og cytoskeletale komponenter i enhver genetisk bakgrunn. Som et resultat kan flere genotyper sammenlignes via levende avbildning, noe som gjør det mulig å bestemme effekten av mutasjoner på smugling av flere organeller.
Denne protokollen demonstrerer FP-injeksjonsmetoden for embryoer av Drosophila melanogaster, men i prinsippet gjelder denne tilnærmingen for eventuelle insektegg som mikroinjeksjonsteknikker er etablert for, inkludert andre arter av Drosophila, crickets22 og bladlus23.

Vitale fargestoffer og molekylære sonder er kraftige verktøy for å bilde spesifikke cellulære strukturer og organeller lever. I Drosophila-embryoet viser mange forskjellige organeller cytoskjelettdrevet lokalisering 1,2,3,4, men anvendelsen av disse små molekylene er utfordrende fordi eggeskallet er ugjennomtrengelig for mange av dem. Denne protokollen beskriver en metode for å bruke fluorescerende sonder (FPs) i levende embryoer via mikroinjeksjon for å oppdage storskala smugling av organeller. Prosedyren dekker fremstilling av injeksjonsoppløsning, eggsamling og fremstilling av embryoer, mikroinjeksjon, avbildning og bildeanalyse.
Dramatiske romlige omorganiseringer er vanlige i mange dyreocytter, egg og embryoer, delvis på grunn av den store størrelsen på disse cellene. I Drosophila-embryoet beveger for eksempel lipiddråper (LDer) og eggeplomme vesikler seg mot embryosenteret like før cellulærisering5. Denne bevegelsen avhenger av mikrotubuler og etterlater en ~ 40 μm region rundt periferien av embryoet utarmet av de to organellene. I tidligere spaltingsstadier transporteres mange organeller av cytoplasmatiske strømmer som drives av aktin-myosinbaserte sammentrekninger på embryooverflaten6. Selv om embryoene til mange arter viser lignende omorganiseringer, er Drosophila-embryoet spesielt egnet for å følge disse prosessene ved avbildning fordi det utvikler seg eksternt ved standard laboratorium "romtemperatur", er relativt gjennomsiktig, liten nok til å passe på de fleste mikroskopoppsett, og kan manipuleres ved hjelp av kraftige genetiske verktøy.
For noen organeller er fluorescerende merkede proteiner tilgjengelige som spesifikt merker disse strukturene. For eksempel er LSD-2 (også kjent som dPLIN2) et protein som i embryoer spesifikt retter seg mot LDer7. Flylinjer er tilgjengelige som bærer enten udugelige transgenes som koder en fusjon mellom Green Fluorescent Protein (GFP) og LSD-28 eller en genfelle der gult fluorescerende protein (YFP) settes inn i kodeområdet til det endogene LSD-2-genet 9,10. Denne tilnærmingen har imidlertid begrensninger, inkludert at disse fusjonsproteinene har lave kvanteutbytter og har en tendens til å bleke lett. I tillegg kan merking av flere forskjellige strukturer samtidig være utfordrende: for mange organeller er bare en type fluorescerende tag (ofte GFP eller mCherry) for tiden tilgjengelig, så avbildning av to organeller samtidig kan kreve nye transgenes eller innsettinger; Selv om kompatible tagger er tilgjengelige, kan det å introdusere dem i en enkelt belastning kreve tidkrevende kryss. Det gjør også det mindre praktisk å bruke de mange kraftige genetiske ressursene, for eksempel hvis to organellemarkører, en Gal4-driver og en inducible RNAi-konstruksjon alle må være til stede i samme mor.
I prinsippet kan disse begrensningene overvinnes ved bruk av FPs, inkludert vitale fargestoffer (f.eks LysoTracker for å markere lysosomer), molekylære sonder (f.eks. SiR-tubulin for å merke mikrotubuler) og fluorescerende merkede biologiske molekyler (f.eks. C12 BODIPY for å sondere fettmetabolismesyre11). Fra bruk i dyrkede celler er de vanligvis godt validert som kraftige verktøy for å undersøke cellulær biologi. FPs er allsidige, har overlegne fotoegenskaper og er kompatible med fluorescerende proteiner. Flere fargestoffer kan blandes og påføres samtidig, ofte med fordelene ved separasjon i de fiolette / blå og fjernrøde områdene i spekteret og små Stokes-skift, og forhindrer kanalblødning gjennom. Små Stokes-skift gjør det mulig å fange flere bildekanaler samtidig, slik at sporing av flere organeller samtidig kan spores. Til slutt kan de like mye brukes på merking av organeller i embryoer av andre Drosophila-arter eller til og med andre insekter der ingen fluorescerende merkede proteiner kan være tilgjengelige.
Imidlertid kan de fleste av disse FPs ikke krysse det forseggjorte eggeskallet til Drosophila-embryoet . Den består av fem lag: tre ytre choronic lag (korion) som forhindrer mekanisk skade pluss et voksaktig lag rundt vitellinemembranen som skaper en kjemisk barriere12. For enkelhets skyld vil kombinasjonen av det voksaktige laget og vitellinemembranen bli referert til som "vitelline membranen" nedenfor. For å omgå eggeskallet tilpasser denne protokollen en etablert embryomikroinjeksjonstilnærming for å introdusere FPs i Drosophila-embryoet . Protokollen beskriver hvordan man overvåker den cytoplasmatiske strømmen av LP-er i spaltingsstadiumembryoer. Det inkluderer fremstilling av injeksjonsnåler og eggoppsamlingsbur, prosessen med eggsamling og mekanisk fjerning av koret. Det går over hvordan man mikroinjekterer og avbilder embryoene og hvordan man analyserer bulkstrømmen av LP-er ved hjelp av partikkelbilde velocimetry (PIV, tilpasset fra6). Den gir råd om feilsøking for å sikre embryooverlevelse og skape det beste systemet for avbildning. Også diskutert er hvordan protokollen kan endres til samtidig bilde-ID-er og mikrotubuler eller å bruke den på studiet av andre organeller, inkludert lysosomer, mitokondrier, eggeplomme vesikler og endoplasmic retikulum (ER).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AUTODO</td>
			<td>abcepta</td>
			<td>SM1000a</td>
			<td>Stains lipid droplets in violet/blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3922</td>
			<td>Stains lipid droplets in green</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Beads &#8211;Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Company</td>
			<td>21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4350030000000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape</td>
			<td>Scotch (3M)</td>
			<td>-</td>
			<td>Sold by many vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E34251</td>
			<td>Stains the ER/nuclear envelope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femptotip II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H129354N</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Must be pulled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Buy the appropriate refractive index for your objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane 
			greener alternative 
			anhydrous, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654-1L</td>
			<td>Heptane is considered toxic by the USA&#39;s OSHA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Sp5</td>
			<td>Many different types of confocal microscopes will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidSpot 610</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70069</td>
			<td>Stains lipid droplets in far red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Stains lysosomes in red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoView 633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70055</td>
			<td>Stains mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle loading pipette tips - 20uL microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td># 5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000, Next Generation Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiR-Tubulin</td>
			<td>Cytosketon Inc</td>
			<td>CY-SC014</td>
			<td>Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransferMan</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5178 NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViaFluor 405</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70064</td>
			<td>Stains microtubules in violet/blue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing cytoskeleton-dependent trafficking of lipid-containing organelles in drosophila embryos

Tidlige Drosophila embryoer er store celler som inneholder et stort utvalg av konvensjonelle og embryospesifikke organeller. I løpet av de tre første timene med embryogenese gjennomgår disse organellene dramatiske bevegelser drevet av aktinbasert cytoplasmisk streaming og motordrevet smugling langs mikrotubuler. Utviklingen av en rekke små, organelle-spesifikke fluorescerende sonder (FPs) gjør det mulig å visualisere et bredt spekter av forskjellige lipidholdige strukturer i enhver genotype, slik at levende avbildning uten å kreve en genetisk kodet fluorofor. Denne protokollen viser hvordan man injiserer vitale fargestoffer og molekylære sonder i Drosophila-embryoer for å overvåke smugling av spesifikke organeller ved levende avbildning. Denne tilnærmingen demonstreres ved å merke lipiddråper (LDer) og følge deres bulkbevegelse ved partikkelbildehastighet (PIV). Denne protokollen gir en strategi som kan brukes til studiet av andre organeller, inkludert lysosomer, mitokondrier, eggeplomme vesikler og ER, og for å spore bevegelsen til individuelle ID-er langs mikrotubuler. Bruk av kommersielt tilgjengelige fargestoffer bringer fordelene med separasjon inn i de fiolette / blå og fjernrøde områdene i spekteret. Ved multipleks co-merking av organeller og / eller cytoskeletale elementer via mikroinjeksjon, er alle de genetiske ressursene i Drosophila tilgjengelige for menneskehandelstudier uten å måtte introdusere fluorescerende merkede proteiner. I motsetning til genetisk kodede fluoroforer, som har lave kvanteutbytter og blekemiddel lett, tillater mange av de tilgjengelige fargestoffene rask og samtidig fangst av flere kanaler med høye fotonutbytter.

Etter injeksjon vil fargestoffet bare lokaliseres på stedet der nålespissen ble satt inn. Fargestoffet vil deretter spre seg bort fra injeksjonsstedet avhengig av dets diffusive egenskaper. Figur 1 viser injeksjon av BODIPY 493/503, kort tid etter injeksjon (panel A) og 24 min senere (panel B). Etter 24 min har fargestoffet gjort det til omtrent midtpunktet av embryoets lange akse.
Analyse av organellemotilitet kan oppnås gjennom fargeinjeksjoner og tidsforløpavbildning. I figur 2 ble et embryo injisert sammen med BODIPY 493/503 (figur 2A) og LysoTracker Red (figur 2B) og avbildet ved hjelp av lasereksitasjon ved henholdsvis 488 og 596 nm. Dette embryoet ble deretter tidsforløp avbildet (en ramme hver 30 s i 30 min, 5 min analysert). Tidsseriene ble deretter kjørt gjennom PIV-analyse, hvor produksjonen vises via strømlinjeformede tall i figur 2A,B. Legg merke til at strømlinjeformene ikke representerer banen til individuelle partikler, men den cytoplasmatiske strømmen er utledet fra å analysere alle partiklene i den regionen av cytoplasmaet. Gjennom merking av to uavhengige cellulære strukturer (LDer og sure organeller) finner PIV-analysen lignende strømmer, med begge etikettene konvergerende på den sentrale delen av embryoet der cytoplasmaet strømmer inn i embryoets indre6.
For tiden tillater tilgjengelige FPs merking av mange andre organeller og cellulære strukturer. Figur 3 viser merkingen av ER via ER tracker Green. ER tracker gir en fin oppløsning av atomkonvolutten, slik at visualisering av store cellesyklusstadier. ER tracker Green er avbildet ved hjelp av 488 nm eksitasjon.
Merking av mitokondriene er vanskelig, da de fleste fargestoffer testet ser ut til å være fanget i den første mitokondrie de kommer inn i. På den annen side ble det ikke oppdaget tegn på fargetoksisitet, noe som gjorde det mulig å følge merkede mitokondrier gjennom cellulærisering og den ektodermale kjernefysiske syklusen 15. Figur 4 viser en ektodermal celle flere timer etter injeksjon med Mitoview 633 (eksitasjonsbølgelengde 633 nm).
BODIPY, Lysotracker og LipidSpot er robuste og kan brukes til å skaffe ~ 500 + bilder på 512 x 512, linje gjennomsnitt 3, bildefrekvenser fra 1/s til 0.1/s. ER tracker Grønn, SiR-tubulin, og de nevnte mitokondriefargene er mindre robuste og gir ~ 50-200 bilder under samme forhold.
Fra blastoderm stadier beveger LDene seg toveis langs mikrotubuler, drevet av de motsatte polaritetsmotorene kinesin-1 og cytoplasmic dynein5. Denne bevegelsen kan visualiseres ved å merke LDer og mikrotubuler samtidig ved å injisere både BODIPY 493/503 og SiR-Tubulin (figur 5). Ettersom LD-er ofte reverserer bevegelsesretningen (når de bytter mellom kinesin-1 og cytoplasmisk dynein), fanger høyere bildefrekvenser under oppkjøpet bedre kritiske detaljer om LD-motilitet.
Levende avbildning av autofluorescent eggeplomme vesikler er mulig uten noen form for fargeinjeksjon (figur 6). Imidlertid er autofluorescence svak, og eksitasjonslaseren er fototoksisk. Dermed har levende avbildning av autofluorescent eggeplomme et dårlig signal-til-støy-forhold i forhold til fargeinjeksjon.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig01.jpg"> Figur 1: Spredning av BODIPY 493/503 gjennom embryoet. Fargestoffet ble injisert langs sidekanten mot den fremre enden (øverst til høyre) og diffuserer fra dette injeksjonsstedet inn i embryoet, merking av LP-er. (A) Fargestoffet har diffusert gjennom deler av embryoet ved siden av injeksjonsstedet. (B) Omtrent 24 min/2 kjernefysiske sykluser senere har fargestoffet spredd seg forbi embryoets midtpunkt. Skala bar: 100 μm. En ramme på 1024 x 1024 (linjegjennomsnitt 4) ble anskaffet hver 30 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig01large.jpg" target="_blank">. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig02.jpg"> Figur 2: Partikkelbilde velocimetry (PIV) for LDer og sure organeller. Et embryo ble injisert med både BODIPY 493/503 og LysoTracker Red. (A) BODIPY kanal. (B) LysoTracker Rød kanal. (A',B') Effektiviser diagrammer generert av PIV-analyse av de to kanalene generert fra 10 sekvensielle rammer, inkludert de som vises i A og B. A' tilsvarer strømmen av LP-er, og B' tilsvarer strømmen av sure organeller. Legg merke til at både A' og B' viser en venstreorientert samløp der embryonalt innhold strømmer ut av synsplanet, inn i midten av embryoet. Vær også oppmerksom på at BODIPY har diffusert mer enn LysoTracker, da forskjellige fargestoffer har forskjellige diffusive egenskaper. Skala bar: 100 μm. En ramme på 1024 x 1024 (linjegjennomsnitt 4) ble anskaffet hver 30 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig02large.jpg" target="_blank">. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig03.jpg"> Figur 3: ER tracker merker synytiale kjernefysiske divisjoner. Et synytialt blastoderm-embryo ble mikroinjisert med ER tracker og en del av overflaten ble avbildet over tid. (A) Spindelmontering under en kjernefysisk divisjon. (B) Abscission av atomkonvolutten under samme divisjon. (C) Etterfølgende interfase. (D) Utbruddet av neste divisjon er indikert med sentrosomt utseende (forekomst av sirkulære ER-frie regioner, preget av pilspisser). Legg merke til den gradvise fargeblekingen. Eksitasjon bølgelengde: 488 nm. Skalastang: 5 μm. A: innledende ramme, B: 3 min forløpt, C: 10 min forløpt, D: 13 minutter forløpt. En ramme på 1024 x 1024 (linjegjennomsnitt 4) ble anskaffet hver 30 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig03large.jpg" target="_blank">. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig04.jpg"> Figur 4: Mitoview 633 merking av mitokondrier. Et embryo ble injisert med Mitoview 633 under det synytiale blastodermstadiet og avbildet 4 timer senere, etter cellulærisering. Bildet viser en nevroektodermal celle av et embryo i bakteriebåndforlengelse. Skala bar: 5 μm. En ramme på 1024 x 1024 (linjegjennomsnitt 4) ble anskaffet hver 30 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig04large.jpg" target="_blank">. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig05.jpg"> Figur 5: Sammerking av LP-er og mikrotubuler. Et cellulært embryo ble injisert med en blanding av BODIPY 493/503 (gul A, B, C) og SiR Tubulin (magenta A', B', C'). A'', B'', C'' viser de sammenslåtte kanalene. Panelene A, A' og A'' viser startrammen, panelene B, B' og B'' viser rammen etter 5 s, og panelene C, C' og C'' viser rammen etter 10 s. Skala bar: 5 μm. En ramme på 512 x 512 (linjegjennomsnitt 3) ble anskaffet hver 2.5 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig06.jpg"> Figur 6: Bildebehandling av eggeplomme vesicle autofluorescence under synytial spalting stadier. (A) Ved starten av oppkjøpet. (B) Etter 8 min. (C) Etter 16 min. Eksitasjon bølgelengde: 405 nm. Lav eksitasjonsintensitet ble brukt til å holde embryoet i live. Skala bar: 100 μm. En ramme på 1024 x 1024 (linjegjennomsnitt 4) ble anskaffet hver 30 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig06large.jpg" target="_blank">. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Supplerende data. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/PIV_analysis_script_Kilwein_Welte_JoVE_2021.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos at JoVE.com

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

I det tidlige Drosophila-embryoet er mange organeller motile. I prinsippet kan de avbildes levende via spesifikke fluorescerende sonder, men eggeskallet forhindrer direkte påføring av embryoet. Denne protokollen beskriver hvordan man introduserer slike sonder via mikroinjeksjon, og deretter analyserer bulk organelle bevegelse via partikkelbilde velocimetry.

Visualisering av Cytoskeleton-avhengig smugling av lipidholdige organeller i Drosophila embryoer

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

I det tidlige Drosophila-embryoet gjennomgår mange organeller storskala bevegelse. Vår protokoll beskriver hvordan du overvåker denne bevegelsen ved hjelp av fluorescerende fargestoffer utviklet for cellekultur. Sammenlignet med fluorescerende proteiner er kommersielt tilgjengelige fluorescerende sonder lysere og spenner over et bredere spekter av spekteret.De tillater multiplex colabeling og kan brukes i hvilken som helst genetisk bakgrunn. Det tar praksis og prøving og feiling å vite hvor lenge desiccate embryoer, slik at de enten brister under injeksjon eller tørker opp og slutter å utvikle seg. For å begynne, begynn å forberede injeksjonsnålene ved å plassere kapillæren i en kapillærholder på nåletrekkeren og sikre den ved hjelp av vingemuttere.Juster midten av kapillæren etter varmeelementet. I henhold til produsentens instruksjoner, velg passende innstillinger på nåletrekkeren. Bruk et dissekeringsmikroskop til å utføre kvalitetskontrolltesten.Trykk nålene inn i kittet horisontalt med nålespissene suspendert i luften. Dekk nålene med lokket og oppbevar til bruk. Bruk nålelastespisser festet til en mikropipette, trekk en mikroliter av injeksjonsoppløsningen inn i spissen uten å fange luftbobler.Bruk hansker til å holde nålen i den ene hånden med spissen pekende bort og sett lastespissen inn i den. Dispenser væsken nær nålespissen, fjern pipetten og hold nålen vertikalt til væsken strømmer til spissen. Dekk beholderen med aluminiumsfolie uten å skade nålespissene for å forhindre bleking av fargestoffene.Bruk en overføringspipette, eller en mikropipetter, plasser en liten dråpe heptanlim i midten av en rektangulær dekselslipp, og la den fordampe. For å fjerne koreksjonen mekanisk, dekk riktig alderen embryoplate med et tynt lag halokarbonolje 27 for å snu eggeskallet gjennomsiktig. Se platen under et disseksjonsmikroskop med transbelysning for å bekrefte embryostadiet og velg embryoene i spaltingsstadier.Bruk fine pinsett, plukk opp et embryo av ønsket stadium ved å ta tak i dorsale vedlegg og overføre det til den forberedte glasssklie dekket med dobbeltsidig tape. Plasser embryoet på båndet og minimer overføringen av olje. Rull embryoet forsiktig over overflaten av båndet ved å skyve med siden av spissen av pinsettene uten å stikke det direkte.Fortsett å rulle embryoet til koret fester seg til båndet og sprekker. Etter chorion sprekker, fortsett å rulle embryoet for å skille det fra koret, som forblir fast på båndet. Rull embryoet tilbake på koret, som er mindre lim enn båndet.Gni forsiktig embryoet med pinsettene til det festes til pinsettene for overføring. Overfør deretter embryoet til dekselslippet og ta det i kontakt med limet for å holde embryoet på plass, skille det fra pinsettene. Juster retningen på embryoet på dekselslippet.La embryoene desiccate i fem til 12 minutter ved å plassere dekselet glide med embryoer inn i uttørkingskammeret og forsegle det. Ta av dekselslippet fra kammeret og legg en dråpe halokarbonolje 700, som dekker embryoene for å forhindre ytterligere uttørking. Undersøk dem under dissekeringsområdet og fortsett til mikroinjeksjon hvis embryoene ble tørket riktig.Plasser 4X-målet i lysbanen og bruk fokusknappen på mikroskopet, juster embryoene i fokus. Flytt embryoene horisontalt inn i midten av synsfeltet ved hjelp av scenekontrollene. Hold embryoene på kanten av synsfeltet og panorer bort som forberedelse til å senke nålen.Bor med samme fokusplan, senk nålespissen og sørg for at den er synlig i synsfeltet sammen med embryoene. Kontroller at kanylen fungerer ved å dispensere noe av injeksjonsoppløsningen i halokarbonolje 700. Hvis det lykkes, vises en boble av løsning i oljen nær nålespissen.Bruk scenekontrollene til å flytte embryoet mot nålespissen til spissen forsiktig punkterer embryoet og går inn i det. Samtidig begynner strømmen av injeksjonsoppløsning til et forbigående klart sted vises på nålespissens sted, noe som indikerer vellykket løsningsoverføring til embryoet. Fest dekselsklien på det kontrokale mikroskopet ved hjelp av skyveholderen.Vær forsiktig da dekselslippet er skjøre. Inspiser embryoene ved hjelp av epifluorescensfunksjonen på det konfokale mikroskopet med et 40X mål og sørg for at fluor 4 i embryoet er synlig før du fortsetter. For direkte bildebehandling angir du bildestørrelsen på 512 x 512 piksler, linjegjennomsnittet på tre og en bildefrekvens på 0,1 bilder per sekund under synkroniseringsstadiene.Etter at BODIPY 493 503 fargestoff ble injisert, ble det lokalisert på stedet der nålespissen ble satt inn og deretter diffusert ved siden av injeksjonsstedet. Etter 24 minutter har fargestoffet diffusert forbi embryoets midtpunkt. Organellemotiliteten ble overvåket ved å injisere embryoet med BODIPY 493 503 og LysoTracker Red.Partikkelbilde-velocimetryanalysen viste at det embryonale innholdet konvergerte på embryoets sentrale region, hvor cytoplasmaet strømmer inn i embryoets indre. Merking av ER, ved hjelp av ER-Tracker Green, gir en levende oppløsning av atomkonvolutten, slik at visualisering av store cellesyklusstadier. Embryoet ble injisert med MitoView 633 på blastodermstadiet og avbildet fire timer senere.Bildet viser en nevroektodermal celle av et embryo i bakteriebåndforlengelse. Et cellulært embryo ble injisert med en blanding av BODIPY 493 503 og SiR Tubulin, som viser at lipiddråpene beveger seg toveis langs mikrotubuler. Embryoet må delvis uttørkes slik at væske kan injiseres.For lite uttørking vil føre til at embryoet lekker når det injiseres, for mye uttørking vil drepe embryoet. Videoer av bevegelige organeller kan karakteriseres via forskjellige bildeanalyseteknikker. Partikkelsporing avslører oppførselen til individuelle organeller, partikkelavbildningshastighet avslører bulkstrømmen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering for Sammenligning av genekspresjon domener i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoet

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protokoller for Visualisering Steroidogenic organer og deres Interaktiv organer med Farging i bananflue<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Tiner dyrking og Cryopreserving Drosophila linjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranukleære Actin stenger i Live Heat Stresset Drosophila Embryoer

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Visualisere effekten av oksidativ skade på Drosophila Egg Chambers ved hjelp av Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Confocal og Super-Resolution Imaging av polarisert intracellulær smugling og sekresjon av kjellermembranproteiner under Drosophila Oogenese

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility in Drosophila

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos (Video) | JoVE 

Optogenetisk hemming av rho1-mediert aktomyosinkontraktilitet kombinert med måling av epitelspenning i Drosophila-embryoer

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...