Name: visualizing cytoskeleton-dependent trafficking of lipid-containing organelles in drosophila embryos
Uploaded: 2021-12-13T13:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos at JoVE.com

Agradecemos a Pakinee Phromsiri, Brian Jencik, Jinghong (James) Tang y Roger White por sus comentarios sobre el manuscrito. Agradecemos a Patrick Oakes, Stefano Di Talia y Victoria Deneke por compartir su experiencia sobre cómo realizar análisis PIV. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud F31 HD100127 (a M. D. K.) y R01 GM102155 (a M. A. W.).

<ol>
	<li>Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+organization+and+function+in+the+Drosophila+blastoderm+embryo.">Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).</li><li>Mavor, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab8+directs+furrow+ingression+and+membrane+addition+during+epithelial+formation+in+Drosophila+melanogaster.">Rab8 directs furrow ingression and membrane addition during epithelial formation in Drosophila melanogaster.</a> Development. 143 (5), 892-903 (2016).</li><li>Riggs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeleton+remodeling+during+early+Drosophila+furrow+formation+requires+recycling+endosomal+components+Nuclear-fallout+and+Rab11.">Actin cytoskeleton remodeling during early Drosophila furrow formation requires recycling endosomal components Nuclear-fallout and Rab11.</a> Journal of Cell Biology. 163 (1), 143-154 (2003).</li><li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos:+forces+and+kinetics.">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92 (4), 547-557 (1998).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=As+the+fat+flies:+The+dynamic+lipid+droplets+of+Drosophila+embryos.">As the fat flies: The dynamic lipid droplets of Drosophila embryos.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (9), 1156-1185 (2015).</li><li>Deneke, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+nuclear+positioning+synchronizes+the+cell+cycle+in+Drosophila+embryos.">Self-organized nuclear positioning synchronizes the cell cycle in Drosophila embryos.</a> Cell. 177 (4), 925-941 (2019).</li><li>Welte, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+perilipin+homolog+LSD2.">Regulation of lipid-droplet transport by the perilipin homolog LSD2.</a> Current Biology. 15 (14), 1266-1275 (2005).</li><li>Bailey, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+role+for+lipid+droplets+in+a+stem+cell+niche+of+Drosophila.">Antioxidant role for lipid droplets in a stem cell niche of Drosophila.</a> Cell. 163 (2), 340-353 (2015).</li><li>Johnson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2Av+buffering+via+dynamic+sequestration+to+lipid+droplets+in+Drosophila+embryos.">H2Av buffering via dynamic sequestration to lipid droplets in Drosophila embryos.</a> Elife. 7, 36021 (2018).</li><li>Lowe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+expression+patterns,+subcellular+localisations+and+interaction+partners+of+Drosophila+proteins+using+a+pigP+protein+trap+library.">Analysis of the expression patterns, subcellular localisations and interaction partners of Drosophila proteins using a pigP protein trap library.</a> Development. 141 (20), 3994-4005 (2014).</li><li>Rambold, A. S., Cohen, S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+trafficking+in+starved+cells:+regulation+by+lipid+droplet+lipolysis,+autophagy,+and+mitochondrial+fusion+dynamics.">Fatty acid trafficking in starved cells: regulation by lipid droplet lipolysis, autophagy, and mitochondrial fusion dynamics.</a> Developmental Cell. 32 (6), 678-692 (2015).</li><li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules.">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).</li><li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+centrifugation+of+Drosophila+embryos.">In-vivo centrifugation of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+collection.">Drosophila embryo collection.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li><li>Wieschaus, E., N&#252;sslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).</li><li>. The Interactive Fly: Stages of Development and Mitotic Domains Available from: <a target="_blank" href="https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm">https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm</a> (1999)</li><li>Liberzon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OpenPIV/openpiv-python: OpenPIV - Python (v0.22.2) with a new extended search PIV grid option. , (2020).</li><li>Markow, T. A., Beall, S., Matzkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+size,+embryonic+development+time+and+ovoviviparity+in+Drosophila+species.">Egg size, embryonic development time and ovoviviparity in Drosophila species.</a> Journal of Evolutionary Biology. 22 (2), 430-434 (2009).</li><li>Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein-mediated+cargo+transport+in+vivo.+A+switch+controls+travel+distance.">Dynein-mediated cargo transport in vivo. A switch controls travel distance.</a> Journal of Cell Biology. 148 (5), 945-956 (2000).</li><li>Debarre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+lipid+bodies+in+cells+and+tissues+using+third-harmonic+generation+microscopy.">Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy.</a> Nature Methods. 3 (1), 47-53 (2006).</li><li>Dou, W., Zhang, D., Jung, Y., Cheng, J. X., Umulis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+lipid-droplet+intracellular+motion+in+early+Drosophila+embryos+using+femtosecond-stimulated+Raman+loss+microscopy.">Label-free imaging of lipid-droplet intracellular motion in early Drosophila embryos using femtosecond-stimulated Raman loss microscopy.</a> Biophysical Journal. 102 (7), 1666-1675 (2012).</li><li>Barry, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injecting+Gryllus+bimaculatus+Eggs.">Injecting Gryllus bimaculatus Eggs.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), (2019).</li><li>Le Trionnaire, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+protocol+for+targeted+mutagenesis+with+CRISPR-Cas9+system+in+the+pea+aphid.">An integrated protocol for targeted mutagenesis with CRISPR-Cas9 system in the pea aphid.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 110, 34-44 (2019).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El embrión de Drosophila es un modelo poderoso y conveniente para estudiar cuestiones fundamentales en biología celular y de organismos. Su relativa simplicidad, genética poderosa y tamaño pequeño lo convierten en un excelente sistema para obtener imágenes tanto de los procesos celulares como del desarrollo. Aquí, se adapta un protocolo de microinyección estándar para permitir el uso de FP en embriones. Este enfoque permite obtener imágenes fluorescentes de estructuras celulares específicas sin la necesidad de fluoróforos codificados genéticamente, lo que abre muchos antecedentes genéticos a las imágenes. La combinación de múltiples colorantes más proteínas marcadas fluorescentemente estratégicamente elegidas puede abrir imágenes en vivo multicanal que abarcan todo el espectro de luz visible.
Pasos críticos en el protocolo: Este protocolo utiliza BODIPY 493/503 para etiquetar los LD. Este enfoque se puede adaptar fácilmente para marcar otras estructuras celulares. Para el análisis posterior de la imagen, uno de los factores más importantes es la relación señal-ruido, es decir, el brillo del tinte en comparación con la señal de fondo. Se han obtenido imágenes exitosas de lisosomas (LysoTracker Red, 1 mM), así como de mitocondrias (Mitoview 633, 200 μM), el ER (ER tracker Green, 10 μM) y microtúbulos (SiR tubulina, 200 nM en DMSO), como se muestra en la Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5. Además, las vesículas vitelinosas son autofluorescentes y emiten luz azul tras la excitación UV (imagen que utiliza 405 nm como longitud de onda de excitación (Figura 6)). Para otros colorantes, apunte a que la concentración de colorante sea 100-1,000x de lo que se necesitaría para teñir células cultivadas vivas; esto es similar a la concentración de una solución madre que se diluiría en medios de cultivo celular. Como este protocolo requiere una inyección de 100 fL y el embrión de Drosophila es de aproximadamente 9 nL en el volumen18, estas concentraciones de colorante promediarán una concentración embrionaria interna de menos de 1/100 de lo que está presente en el medio de cultivo celular. Temporalmente, la concentración local será mayor en el sitio de inyección, lo que es más relevante para los FP que no se difunden bien (es decir, colorantes mitocondriales y SiR-tubulina). Para estos FP, comience en las altas concentraciones recomendadas; si se observa una muerte inesperada, diluir sucesivamente dos veces hasta que se alcance un compromiso aceptable entre la supervivencia y la intensidad de la señal.
Al coinyectar múltiples colorantes, ambos colorantes deben estar en el mismo disolvente, o tanto los disolventes como los colorantes deben ser compatibles con la mezcla (no se recomiendan concentraciones de alcohol superiores a ~ 10%).
La calidad de las agujas es esencial para el éxito de este procedimiento, ya que la punta debe ser lo más fina posible. De lo contrario, el daño de la herida de inyección puede comprometer el desarrollo posterior del embrión. Como los tiradores de agujas comerciales difieren, es importante seguir las sugerencias del fabricante y probar múltiples parámetros de tracción hasta que se logre la forma deseada. Es fundamental realizar el paso de control de calidad 1.1.3, ya que trabajar con una punta de aguja agrietada, dentada o de gran diámetro hará que la inyección exitosa sea más difícil o incluso imposible.
El embrión debe desecarse parcialmente para que se puedan agregar volúmenes adicionales de líquido durante la inyección. Si el embrión está subdesecado, la aguja no entrará fácilmente y el citoplasma saldrá a chorros a medida que la aguja penetre o cuando se inyecte la solución. Si el embrión está sobredesecado, se verá desinflado y no se desarrollará adecuadamente. El tiempo exacto de secado depende de las condiciones locales, por ejemplo, la humedad del aire, y puede cambiar de un día a otro. Tiene que determinarse empíricamente para cada sesión.
La capacidad del embrión para sobrevivir después de la microinyección depende críticamente de la calidad de la aguja, la desecación adecuada y la limitación del volumen de inyección a menos de 1 pL (idealmente 100 fL). Mientras se optimicen estos parámetros, no se observa toxicidad significativa cuando los colorantes descritos se inyectan a las concentraciones recomendadas. Si los embriones sobreviven a los pasos de desecación e inyección, generalmente se desarrollan con éxito hasta la extensión de la banda germinal, una excepción son las sondas de microtúbulos y ER que causaron defectos de celularización a niveles altos (inyección de 100 fL de la concentración de stock de cada uno). Las pruebas no encontraron defectos obvios de desarrollo cuando se inyectaron DMSO, agua y mezclas de los dos a los volúmenes recomendados, con una tasa de supervivencia embrionaria a través de la extensión de la banda germinal de ~ 75% o más. Los volúmenes de inyección superiores a 1 pL causaron defectos y los embriones inyectados con ~ 4 volúmenes de pL se desarrollaron durante menos de 1 h. Por lo tanto, los volúmenes de inyección deben mantenerse bajos, lo que significa que las concentraciones de colorante deben ser altas.
En general, se recomiendan inyecciones a lo largo del borde lateral del embrión, ya que resultan en el menor daño. Sin embargo, es posible que sea necesario ajustar el lugar de inyección en función de las propiedades difusivas de los PF empleados. BODIPY 493/503 y LysoTracker se difunden más rápido en todo el embrión que Lipid Spot 610 (otro tinte para marcar los LD), mientras que SiR-Tubulin y Mitoview 633 nunca se difunden completamente a través del embrión (imágenes tan tarde como 7 h después de la inyección). Por lo tanto, la inyección en o cerca del sitio de interés puede ser necesaria. Al inyectar en las regiones anterior o posterior, se recomienda una aguja particularmente fina.
La adquisición de imágenes se basa en la microscopía confocal para seccionar ópticamente y resolver pequeños orgánulos y todos los componentes citoesqueléticos. Las técnicas que requieren el análisis de muchas imágenes (por ejemplo, STORM o PALM) no funcionarán porque el contenido embrionario está en movimiento y los fluoróforos no están optimizados para el fotomutamiento. La microscopía de epifluorescencia carece de la resolución lateral y axial para distinguir la mayoría de los orgánulos y las estructuras celulares más pequeñas. Por estas razones, se recomienda encarecidamente utilizar un microscopio confocal o emplear tecnología de láminas de luz.
La reproducibilidad del análisis de imágenes se basa en gran medida en datos de imágenes consistentes. Para tener la mayor probabilidad de éxito, se requiere la optimización de la técnica de inyección y la adquisición de imágenes. Establecer y practicar una técnica en la que el colorante (s) de interés, el sitio de inyección, la edad del embrión, el volumen de inyección y la configuración de adquisición sean consistentes generará los datos más sólidos para el análisis de imágenes.
Modificaciones y solución de problemas del método Este protocolo demuestra un método para analizar el flujo a granel de LD en embriones en etapa de escisión utilizando velocimetría de imagen de partículas. El mismo enfoque se puede utilizar para otros orgánulos, otras etapas de desarrollo y otros métodos de análisis. Por ejemplo, la Figura 2 muestra el análisis de LD y orgánulos ácidos que fluyen en las etapas sincitiales de la embriogénesis, visualizados mediante la coinyección de BODIPY 493/503 y LysoTracker Red. Se han logrado imágenes más exitosas del movimiento de la DA en embriones hasta 7 h después de la fertilización; estos embriones retienen la herida de la inyección, pero son capaces de desarrollarse durante varias horas.
Los datos recopilados utilizando este protocolo se han utilizado para la velocimetría de imágenes de partículas, pero hay muchas otras técnicas de análisis disponibles. Por ejemplo, los programas de seguimiento de partículas como los que se encuentran en ImageJ, Imaris o el seguimiento manual se pueden utilizar para obtener velocidades y direccionales de estructuras en movimiento. Tenga en cuenta que la mayoría de estos programas de seguimiento están diseñados para trabajar con datos de sistemas de cultivo celular plano y no siempre se adaptan bien a estructuras 3D como el embrión de Drosophila . Además, para la generación de datos de seguimiento de partículas de la mejor calidad, se necesitarían imágenes de múltiples planos Z; esto debería ser factible si los tiempos de adquisición de la pila de imágenes son inferiores a ~ 2 s. Este punto de referencia debe ser alcanzable en discos giratorios confocales, láminas de luz de celosía y sistemas confocales de escaneo láser recientes. Sin embargo, la viabilidad del seguimiento de partículas para orgánulos abundantes como LD, mitocondrias y lisosomas es baja, ya que la cantidad de señal positiva en un campo de visión es demasiado alta para los métodos de seguimiento actuales. El seguimiento de estructuras menos abundantes como núcleos o vesículas vitelinos puede ser posible. PIV para el análisis de flujo funciona bien para LD y orgánulos ácidos en etapas de escisión porque ambos orgánulos se mueven libremente. Los orgánulos como los núcleos, el RE y las mitocondrias están atados a otras estructuras celulares y, por lo tanto, no se mueven libremente y no son adecuados para el análisis de software que asume el movimiento libre. El investigador debe elegir las técnicas que mejor se adapten al orgánulo de interés.
Durante las etapas de blastodermo sincitial y celular, los LD (así como algunos otros orgánulos) se mueven a lo largo de los microtúbulos orientados radialmente5. Por lo tanto, es posible encontrar vistas transversales (como en la Figura 5) donde los microtúbulos individuales están enfocados durante largas distancias, lo que permite el seguimiento de partículas en 2D. Dado que estos planos ópticos están profundamente dentro del embrión, la intensidad general de la señal disminuye y la relación señal-ruido se reduce.
Para el análisis de seguimiento, las imágenes lo más rápido posible pueden revelar detalles cruciales del movimiento y, por lo tanto, de la maquinaria móvil. Por ejemplo, el movimiento de gotas lipídicas es una mezcla de dos estados móviles, movimiento lento-corto (~200 nm/s; distancia media de viaje ~100 nm) y movimiento rápido-largo (~450 nm/s; distancia media de viaje ~1.000 nm)19; por lo tanto, si las imágenes se toman cada segundo o incluso con menos frecuencia, el estado lento-corto se vuelve indetectable. Sin embargo, las imágenes frecuentes también inducen el blanqueamiento de fluoróforos y la fototoxicidad. Las condiciones de imagen, por lo tanto, deben ajustarse en función de la pregunta exacta que se abordará.
Limitaciones del método Dependiendo del colorante deseado, el método puede estar limitado por la compatibilidad entre la solubilidad del colorante y la toxicidad de la solución inyectable. Los alcoholes como el isopropanol y el etanol son difíciles de manejar dentro de una aguja debido a su menor viscosidad y parecen dañar los componentes celulares y matar al embrión.
El método tampoco es adecuado para visualizar los primeros pasos en la embriogénesis porque se necesitan más de 30 minutos para preparar los embriones para la inyección. A temperatura ambiente, los ciclos celulares iniciales del embrión duran solo ~ 10 minutos cada uno; por lo tanto, incluso si uno recogiera un óvulo recién fertilizado en el paso 5.2.3, los primeros ciclos celulares ya se completarían para cuando el embrión esté listo para la obtención de imágenes.
La iluminación con luz en el rango UV/azul es considerablemente más fototóxica que para longitudes de onda más largas. En tales condiciones (por ejemplo, seguir vesículas de yema autofluorescentes; Figura 6), uno tiene que limitar el tiempo de imagen (lo que lleva a series de tiempo más cortas) o usar una potencia láser más baja (lo que resulta en una relación señal-ruido reducida).
Después de la celularización, los colorantes inyectados en un lugar específico tienden a difundirse mal, ya que deben atravesar muchas membranas celulares. Esto limita la región de observación en etapas posteriores del desarrollo.
La importancia del método con respecto a los métodos existentes/alternativos El movimiento de los LD y otros orgánulos que contienen lípidos en embriones tempranos se puede visualizar con fluoróforos codificados genéticamente, técnicas sin etiquetas y mediante la introducción de FP. Esto último se puede lograr mediante la permeabilización de la membranavitellineal 12 o el enfoque de microinyección discutido aquí.
Los fluoróforos codificados genéticamente son marcadores versátiles cuyos niveles suelen ser altamente reproducibles de embrión a embrión. Sin embargo, tienen rendimientos cuánticos más bajos y se blanquean más fácilmente que los FP. Por lo general, solo están disponibles en una o dos versiones etiquetadas (por ejemplo, GFP o mCherry), lo que limita la elección de qué estructuras se pueden visualizar simultáneamente. Los FP, por otro lado, a menudo existen en una gran variedad; por ejemplo, varios colorantes específicos de gotas lipídicas están disponibles con espectros de emisión desde Autodot en el espectro UV / azul hasta Lipidtox y LipidSpot 610 en el espectro rojo lejano. Los FP también se pueden aplicar directamente a cualquier cepa de interés y, por lo tanto, no requieren la construcción de la deformación para, por ejemplo, introducir el marcador de orgánulo deseado en una cepa mutante de interés. Esta ventaja es particularmente pronunciada cuando se van a etiquetar múltiples estructuras simultáneamente; en lugar de cruces que consumen mucho tiempo y abarcan varias generaciones, esto se puede lograr en un solo día mezclando los tintes relevantes e introduciéndolos al mismo tiempo. Finalmente, si los procesos celulares se van a sondear con inhibición farmacológica, se pueden introducir medicamentos y colorantes juntos.
Los métodos sin etiquetas son enfoques muy poderosos para detectar estructuras celulares específicas. Por ejemplo, los LD se pueden detectar específicamente en embriones tempranos mediante microscopía de tercera generación armónica20 o mediante microscopía de pérdida Raman estimulada de femtosegundo21. Al igual que los FP, estos enfoques se pueden aplicar en cualquier fondo genético, y debido a que no causan blanqueamiento, potencialmente permiten una adquisición de imágenes más rápida. Sin embargo, generalmente se limitan a orgánulos específicos y, por lo tanto, no admiten por sí mismos imágenes multiplex; también requieren microscopios especializados.
Existen dos estrategias generales para introducir moléculas pequeñas en los embriones. Uno es el enfoque de microinyección empleado aquí; el otro es el tratamiento químico (terpeno) para permeabilizar la membrana vitelina. Este último enfoque12 está menos involucrado que la microinyección, pero también es más variable de embrión a embrión. Además, después de la permeabilización, la protección proporcionada por la membrana vitelina se ve comprometida y el embrión propiamente dicho es accesible al medio externo, lo que hace que sea más difícil mantenerlo vivo. Es mucho menos probable que la microinyección descarrile el desarrollo embrionario que la permeabilización. Sin embargo, se recomienda la permeabilización si muchos embriones necesitan ser monitoreados simultáneamente, por ejemplo, con fines de detección de drogas. Para seguir el movimiento de las estructuras celulares y obtener series de imágenes reproducibles adecuadas para el análisis de imágenes, la microinyección es el método de elección.
Importancia y aplicaciones potenciales del método en áreas de investigación específicas El embrión de Drosophila es un sistema modelo importante para el estudio de muchos procesos biológicos y de desarrollo celular 1,5,6. El etiquetado de orgánulos con proteínas fluorescentes ha hecho importantes contribuciones a la comprensión de cómo se desarrolla el embrión temprano, cómo se trafican varios orgánulos y cómo dicho tráfico se modula desde el punto de vista del desarrollo y genéticamente. Sin embargo, su propensión a la lejía y los desafíos de generar cepas en las que múltiples orgánulos están etiquetados con diferentes colores limitan la aplicación de este enfoque. El uso de FP introducidos por microinyección resuelve muchos de estos desafíos e incluso se puede combinar con proteínas marcadas fluorescentemente. Esta técnica permite la obtención de imágenes de múltiples orgánulos, estructuras celulares y componentes citoesqueléticos en cualquier fondo genético. Como resultado, se pueden comparar varios genotipos a través de imágenes en vivo, lo que permite determinar el efecto de las mutaciones en el tráfico de múltiples orgánulos.
Este protocolo demuestra el enfoque de inyección de FP para embriones de Drosophila melanogaster, pero en principio, este enfoque se aplica a cualquier huevo de insecto para el que se hayan establecido técnicas de microinyección, incluidas otras especies de Drosophila, grillos22 y pulgones23.

Los colorantes vitales y las sondas moleculares son herramientas poderosas para obtener imágenes de estructuras celulares específicas y orgánulos en vivo. En el embrión de Drosophila, muchos orgánulos diferentes muestran una localización impulsada por el citoesqueleto 1,2,3,4, pero la aplicación de estas pequeñas moléculas es un desafío porque la cáscara del huevo es impermeable a muchas de ellas. Este protocolo describe un método para utilizar sondas fluorescentes (FP) en embriones vivos a través de microinyección con el fin de detectar el tráfico a gran escala de orgánulos. El procedimiento cubre la preparación de la solución inyectable, la recolección de óvulos y la preparación de embriones, la microinyección, las imágenes y el análisis de imágenes.
Los reordenamientos espaciales dramáticos de orgánulos son comunes en muchos ovocitos, óvulos y embriones animales, en parte debido al gran tamaño de estas células. En el embrión de Drosophila , por ejemplo, las gotas lipídicas (LD) y las vesículas de yema se mueven hacia el centro embrionario justo antes de la celularización5. Este movimiento depende de los microtúbulos y deja una región de ~ 40 μm alrededor de la periferia del embrión agotada de los dos orgánulos. Durante las primeras etapas de escisión, muchos orgánulos son transportados por flujos citoplasmáticos que son impulsados por contracciones basadas en actina-miosina en la superficie del embrión6. Aunque los embriones de muchas especies exhiben reordenamientos similares, el embrión de Drosophila es particularmente adecuado para seguir estos procesos por imágenes porque se desarrolla externamente a "temperatura ambiente" estándar del laboratorio, es relativamente transparente, lo suficientemente pequeño como para caber en la mayoría de las configuraciones de microscopio y puede manipularse utilizando poderosas herramientas genéticas.
Para algunos orgánulos, hay disponibles proteínas marcadas fluorescentemente que etiquetan específicamente estas estructuras. Por ejemplo, LSD-2 (también conocida como dPLIN2) es una proteína que en embriones se dirige específicamente a LDs7. Hay líneas de moscas disponibles que transportan transgenes inducibles que codifican una fusión entre green fluorescent Protein (GFP) y LSD-28 o una trampa genética en la que se inserta proteína fluorescente amarilla (YFP) en la región codificante del gen endógeno LSD-2 9,10. Sin embargo, este enfoque tiene limitaciones, incluyendo que estas proteínas de fusión tienen bajos rendimientos cuánticos y tienden a blanquearse fácilmente. Además, el etiquetado de múltiples estructuras diferentes simultáneamente puede ser un desafío: para muchos orgánulos, solo un tipo de etiqueta fluorescente (a menudo GFP o mCherry) está disponible actualmente, por lo que la obtención de imágenes de dos orgánulos al mismo tiempo puede requerir nuevos transgenes o inserciones; además, incluso si hay etiquetas compatibles disponibles, introducirlas en una sola cepa puede requerir cruces que consumen mucho tiempo. También hace que el uso de los muchos recursos genéticos poderosos sea menos conveniente, por ejemplo, si dos marcadores de orgánulos, un controlador Gal4 y una construcción de ARNi inducible tienen que estar presentes en la misma madre.
En principio, estas limitaciones se pueden superar con el uso de PF, incluidos colorantes vitales (por ejemplo, LysoTracker para marcar lisosomas), sondas moleculares (por ejemplo, SiR-tubulina para etiquetar microtúbulos) y moléculas biológicas marcadas con fluorescencia (por ejemplo, C12 BODIPY para sondear el metabolismo de los ácidos grasos11). Desde su uso en células cultivadas, generalmente están bien validadas como herramientas poderosas para sondear la biología celular. Los FP son versátiles, tienen propiedades fotográficas superiores y son compatibles con proteínas fluorescentes. Se pueden mezclar y aplicar múltiples tintes simultáneamente, a menudo con los beneficios de la separación en las áreas violeta / azul y rojo lejano del espectro y pequeños cambios de Stokes, evitando el sangrado del canal. Los pequeños cambios de Stokes permiten la captura simultánea de múltiples canales de imagen, lo que permite el seguimiento de varios orgánulos a la vez. Finalmente, también se pueden aplicar al etiquetado de orgánulos en los embriones de otras especies de Drosophila o incluso otros insectos donde no se pueden disponer de proteínas marcadas fluorescentemente.
Sin embargo, la mayoría de estos FP no pueden atravesar la elaborada cáscara de huevo del embrión de Drosophila . Consta de cinco capas: tres capas coriónicas externas (corion) que evitan daños mecánicos más una capa cerosa que rodea la membrana vitelline que crea una barrera química12. Para simplificar, la combinación de la capa cerosa y la membrana vitelina se denominará "membrana vitelina" a continuación. Para evitar la cáscara del huevo, este protocolo adapta un enfoque de microinyección embrionaria establecido para introducir FP en el embrión de Drosophila . El protocolo describe cómo monitorear el flujo citoplasmático de LD en embriones en etapa de escisión. Incluye la preparación de agujas de inyección y jaulas de recolección de huevos, el proceso de recolección de huevos y la extracción mecánica del corion. Repasa cómo microinyectar e obtener imágenes de los embriones y cómo analizar el flujo masivo de LD utilizando la velocimetría de imagen de partículas (PIV, adaptada de6). Proporciona consejos sobre la solución de problemas para garantizar la supervivencia del embrión y crear el mejor sistema para la obtención de imágenes. También se discute cómo se puede modificar el protocolo para obtener imágenes simultáneas de LD y microtúbulos o para aplicarlo al estudio de otros orgánulos, incluidos los lisosomas, las mitocondrias, las vesículas vitelinosas y el retículo endoplásmico (RE).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AUTODO</td>
			<td>abcepta</td>
			<td>SM1000a</td>
			<td>Stains lipid droplets in violet/blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3922</td>
			<td>Stains lipid droplets in green</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Beads &#8211;Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Company</td>
			<td>21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4350030000000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape</td>
			<td>Scotch (3M)</td>
			<td>-</td>
			<td>Sold by many vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E34251</td>
			<td>Stains the ER/nuclear envelope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femptotip II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H129354N</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Must be pulled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Buy the appropriate refractive index for your objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane 
			greener alternative 
			anhydrous, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654-1L</td>
			<td>Heptane is considered toxic by the USA&#39;s OSHA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Sp5</td>
			<td>Many different types of confocal microscopes will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidSpot 610</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70069</td>
			<td>Stains lipid droplets in far red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Stains lysosomes in red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoView 633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70055</td>
			<td>Stains mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle loading pipette tips - 20uL microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td># 5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000, Next Generation Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiR-Tubulin</td>
			<td>Cytosketon Inc</td>
			<td>CY-SC014</td>
			<td>Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransferMan</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5178 NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViaFluor 405</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70064</td>
			<td>Stains microtubules in violet/blue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing cytoskeleton-dependent trafficking of lipid-containing organelles in drosophila embryos

Los embriones tempranos de Drosophila son células grandes que contienen una amplia gama de orgánulos convencionales y específicos del embrión. Durante las primeras tres horas de embriogénesis, estos orgánulos experimentan movimientos dramáticos impulsados por la transmisión citoplasmática basada en actina y el tráfico impulsado por motores a lo largo de los microtúbulos. El desarrollo de una multitud de pequeñas sondas fluorescentes (FP) específicas de orgánulos permite visualizar una amplia gama de diferentes estructuras que contienen lípidos en cualquier genotipo, lo que permite obtener imágenes en vivo sin requerir un fluoróforo codificado genéticamente. Este protocolo muestra cómo inyectar colorantes vitales y sondas moleculares en embriones de Drosophila para monitorear el tráfico de orgánulos específicos mediante imágenes en vivo. Este enfoque se demuestra mediante el etiquetado de gotas lipídicas (LD) y siguiendo su movimiento a granel mediante velocimetría de imagen de partículas (PIV). Este protocolo proporciona una estrategia susceptible para el estudio de otros orgánulos, incluidos los lisosomas, las mitocondrias, las vesículas de yema y la sala de emergencias, y para rastrear el movimiento de los LD individuales a lo largo de los microtúbulos. El uso de tintes disponibles comercialmente trae los beneficios de la separación en las regiones violeta / azul y rojo lejano del espectro. Mediante el co-etiquetado multiplex de orgánulos y/o elementos citoesqueléticos a través de microinyección, todos los recursos genéticos en Drosophila están disponibles para estudios de tráfico sin la necesidad de introducir proteínas marcadas fluorescentemente. A diferencia de los fluoróforos codificados genéticamente, que tienen bajos rendimientos cuánticos y blanquean fácilmente, muchos de los colorantes disponibles permiten la captura rápida y simultánea de varios canales con altos rendimientos de fotones.

Después de la inyección, el tinte se localizará solo en el sitio donde se insertó la punta de la aguja. El tinte se difundirá lejos del sitio de inyección dependiendo de sus características difusivas. La Figura 1 muestra la inyección de BODIPY 493/503, poco después de la inyección (panel A) y 24 minutos después (panel B). Después de 24 minutos, el tinte ha llegado aproximadamente al punto medio del eje largo del embrión.
El análisis de la motilidad de los orgánulos se puede lograr a través de inyecciones de tinte e imágenes de lapso de tiempo. En la Figura 2, un embrión fue co-inyectado con BODIPY 493/503 (Figura 2A) y LysoTracker Red (Figura 2B) y fotografiado usando excitación láser a 488 y 596 nm, respectivamente. Este embrión fue fotografiado por lapso de tiempo (un fotograma cada 30 s durante 30 min, 5 min analizados). La serie temporal se ejecutó a través del análisis PIV, cuya salida se muestra a través de racionalizaciones en la Figura 2A, B. Tenga en cuenta que las líneas aerodinámicas no representan la trayectoria de partículas individuales, pero el flujo citoplasmático se infiere del análisis de todas las partículas en esa región del citoplasma. A través del etiquetado de dos estructuras celulares independientes (LD y orgánulos ácidos), el análisis PIV encuentra flujos similares, con ambas etiquetas convergiendo en la región central del embrión donde el citoplasma fluye hacia el interior del embrión6.
Los FP actualmente disponibles permiten el etiquetado de muchos otros orgánulos y estructuras celulares. La Figura 3 muestra el etiquetado de la sala de emergencias a través del rastreador de emergencias Verde. El rastreador de emergencias proporciona una buena resolución de la envoltura nuclear, lo que permite la visualización de las principales etapas del ciclo celular. El rastreador ER Green se visualiza utilizando una excitación de 488 nm.
El etiquetado de las mitocondrias es complicado, ya que la mayoría de los tintes probados parecen estar atrapados en la primera mitocondria en la que ingresan. Por otro lado, no se detectó ningún signo de toxicidad del colorante, lo que permite seguir las mitocondrias marcadas a través de la celularización y el ciclo nuclear ectodérmico 15. La Figura 4 muestra una célula ectodérmica varias horas después de la inyección con Mitoview 633 (longitud de onda de excitación 633 nm).
BODIPY, Lysotracker y LipidSpot son robustos y se pueden usar para adquirir ~ 500 + imágenes a 512 x 512, promedio de línea 3, velocidades de fotogramas de 1 / s a 0.1 / s. ER tracker Green, SiR-tubulina y los tintes mitocondriales mencionados son menos robustos y producen ~ 50-200 imágenes en las mismas condiciones.
Comenzando en las etapas de blastodermo, los LD se mueven bidireccionalmente a lo largo de los microtúbulos, impulsados por los motores de polaridad opuesta kinesina-1 y dineína citoplasmática5. Este movimiento se puede visualizar mediante el co-etiquetado de LD y microtúbulos mediante la inyección de BODIPY 493/503 y SiR-Tubulina (Figura 5). Como los LD con frecuencia invierten su dirección de movimiento (a medida que cambian entre la quinesina-1 y la dineína citoplasmática), las velocidades de fotogramas más altas durante la adquisición capturan mejor los detalles críticos de la motilidad de la LD.
Las imágenes en vivo de vesículas de yema autofluorescentes son posibles sin ninguna forma de inyección de tinte (Figura 6). Sin embargo, la autofluorescencia es tenue y el láser de excitación es fototóxico. Por lo tanto, las imágenes en vivo de la yema autofluorescente tienen una mala relación señal-ruido en relación con la inyección de tinte.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig01.jpg"> Figura 1: Difusión de BODIPY 493/503 a través del embrión. El tinte se inyectó a lo largo del borde lateral hacia el extremo anterior (arriba a la derecha) y se difunde desde este sitio de inyección en el embrión, etiquetando los LD. (A) El tinte se ha difundido a través de porciones del embrión adyacentes al sitio de inyección. (B) Aproximadamente 24 min/2 ciclos nucleares más tarde, el tinte se ha difundido más allá del punto medio del embrión. Barra de escala: 100 μm. Se adquirió un marco de 1024 x 1024 (promedio de línea 4) cada 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig02.jpg"> Figura 2: Velocimetría de imagen de partículas (PIV) para LD y orgánulos ácidos. Se inyectó un embrión con BODIPY 493/503 y LysoTracker Red. (A) Canal BODIPY. (B) Canal rojo de LysoTracker. (A',B') Optimice los diagramas generados por el análisis PIV de los dos canales generados a partir de 10 fotogramas secuenciales, incluidos los que se muestran en A y B. A' corresponde al flujo de LD, y B' corresponde al flujo de orgánulos ácidos. Tenga en cuenta que tanto A' como B' muestran una confluencia a la izquierda del centro donde el contenido embrionario fluye fuera del plano de visión, hacia el centro del embrión. Además, tenga en cuenta que BODIPY ha difundido más que LysoTracker ya que los diferentes tintes tienen diferentes propiedades difusivas. Barra de escala: 100 μm. Se adquirió un marco de 1024 x 1024 (promedio de línea 4) cada 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig03.jpg"> Figura 3: El rastreador ER etiqueta las divisiones nucleares sincitiales. Un embrión de blastodermo sincitial fue microinyectado con rastreador ER y una parte de su superficie fue fotografiada con el tiempo. (A) Montaje del husillo durante una división nuclear. B) Abscisión de la envoltura nuclear durante la misma división. C) Interfase posterior. (D) El inicio de la siguiente división está indicado por la apariencia del centrosoma (aparición de regiones circulares libres de ER, marcadas por puntas de flecha). Tenga en cuenta el blanqueamiento gradual del tinte. Longitud de onda de excitación: 488 nm. Barra de escala: 5 μm. A: fotograma inicial, B: 3 min transcurridos, C: 10 min transcurridos, D: 13 min transcurridos. Se adquirió un marco de 1024 x 1024 (promedio de línea 4) cada 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig04.jpg"> Figura 4: Etiquetado Mitoview 633 de mitocondrias. Se inyectó un embrión con Mitoview 633 durante la etapa de blastodermo sincitial y se tomaron imágenes 4 h después, después de la celularización. La imagen muestra una célula neuroectodérmica de un embrión en extensión de banda germinal. Barra de escala: 5 μm. Se adquirió un marco de 1024 x 1024 (promedio de línea 4) cada 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig05.jpg"> Figura 5: Co-etiquetado de LD y microtúbulos. Se inyectó un embrión celularizante con una mezcla de BODIPY 493/503 (amarillo A, B, C) y SiR Tubulina (magenta A', B', C'). A'', B'', C'' muestran los canales fusionados. Los paneles A, A', y A'' muestran el marco inicial, los paneles B, B' y B'' muestran el marco después de 5 s, y los paneles C, C' y C'' muestran el marco después de 10 s. Barra de escala: 5 μm. Se adquirió un marco de 512 x 512 (promedio de línea 3) cada 2.5 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig06.jpg"> Figura 6: Imagen de la autofluorescencia de la vesícula vitelinosa durante las etapas de escisión sincitial. (A) Al inicio de la adquisición. (B) Después de 8 min. (C) Después de 16 min. Longitud de onda de excitación: 405 nm. Se utilizó una baja intensidad de excitación para mantener vivo al embrión. Barra de escala: 100 μm. Se adquirió un marco de 1024 x 1024 (promedio de línea 4) cada 30 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Datos complementarios. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/PIV_analysis_script_Kilwein_Welte_JoVE_2021.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

En el embrión temprano de Drosophila , muchos orgánulos son móviles. En principio, se pueden obtener imágenes en vivo a través de sondas fluorescentes específicas, pero la cáscara del huevo impide la aplicación directa al embrión. Este protocolo describe cómo introducir tales sondas a través de la microinyección, y luego analizar el movimiento de orgánulos a granel a través de la velocimetría de imagen de partículas.

Visualización del tráfico dependiente de citoesqueletos de orgánulos que contienen lípidos en embriones de Drosophila

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

En el embrión temprano de Drosophila, muchos orgánulos experimentan movimientos a gran escala. Nuestro protocolo describe cómo monitorear este movimiento utilizando colorantes fluorescentes desarrollados para el cultivo celular. En comparación con las proteínas fluorescentes, las sondas fluorescentes disponibles comercialmente son más brillantes y abarcan una gama más amplia del espectro.Permiten el colabeling multiplex y se pueden usar en cualquier fondo genético. Se necesita práctica y prueba y error para saber cuánto tiempo se desecan los embriones, de modo que estallen durante la inyección o se sequen y dejen de desarrollarse. Para comenzar, comience a preparar las agujas de inyección colocando el capilar en un soporte capilar en el extractor de agujas y asegurándolo con tuercas de ala.Alinee el centro del capilar con el elemento calefactor. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, elija la configuración adecuada en el extractor de agujas. Usando un microscopio de disección, realice la prueba de control de calidad.Presione las agujas en la masilla horizontalmente con las puntas de la aguja suspendidas en el aire. Cubra las agujas con la tapa y guárdelas hasta su uso. Usando puntas de carga de aguja unidas a una micropipeta, extraiga un microlitro de la solución de inyección en la punta sin atrapar burbujas de aire.Con guantes, sostenga la aguja en una mano con la punta apuntando hacia afuera e inserte la punta de carga en ella. Dispense el líquido cerca de la punta de la aguja, retire la pipeta y sostenga la aguja verticalmente hasta que el líquido fluya hacia la punta. Cubra el recipiente con papel de aluminio sin dañar las puntas de la aguja para evitar el blanqueamiento de los tintes.Usando una pipeta de transferencia, o un micropipetador, coloque una pequeña gota de pegamento de heptano en el centro de un resbalón de cubierta rectangular y deje que se evapore. Para eliminar el corion mecánicamente, cubra la placa embrionaria adecuadamente envejecida con una capa delgada de aceite de halocarbono 27 para que la cáscara del huevo sea transparente. Vea la placa bajo un microscopio de disección con iluminación trans para confirmar la etapa embrionaria y seleccionar los embriones en etapas de escisión.Usando pinzas finas, recoja un embrión de la etapa deseada agarrando los apéndices dorsales y transfiéralo al portaobjetos de vidrio preparado cubierto con cinta adhesiva de doble cara. Coloque el embrión en la cinta y minimice la transferencia de aceite. Enrolle el embrión suavemente a través de la superficie de la cinta empujando con el lado de la punta de las pinzas sin pincharlo directamente.Continúe enrollando el embrión hasta que el corion se adhiera a la cinta y se agriete. Después de que el corion se agriete, siga rodando el embrión para separarlo del corion, que permanece pegado a la cinta. Vuelva a enrollar el embrión sobre el corion, que es menos adhesivo que la cinta.Frote suavemente el embrión con las pinzas hasta que se adhiera a las pinzas para su transferencia. Luego, transfiera el embrión al resbalón de la cubierta y póngalo en contacto con el pegamento para mantener el embrión en su lugar, separándolo de las pinzas. Ajuste la orientación del embrión en el resbalón de la cubierta.Deje que los embriones se desecan durante cinco a 12 minutos colocando el resbalón de la cubierta con embriones en la cámara de desecación y sellándolo. Retire el resbalón de la cubierta de la cámara y coloque una gota de aceite de halocarbono 700, cubriendo los embriones para evitar una mayor desecación. Examínelos bajo el endoscopio de disección y proceda a la microinyección si los embriones fueron desecados correctamente.Coloque el objetivo 4X en la trayectoria de la luz y, utilizando la perilla de enfoque en el microscopio, ajuste los embriones para enfocarlos. Mueva los embriones horizontalmente hacia el centro del campo de visión utilizando los controles de escenario. Mantenga los embriones en el borde del campo de visión y aléjelos en preparación para bajar la aguja.Permaneciendo con el mismo plano focal, baje la punta de la aguja y asegúrese de que sea visible en el campo de visión junto con los embriones. Compruebe que la aguja está funcionando dispensando parte de la solución de inyección en aceite de halocarbono 700. Si tiene éxito, aparecerá una burbuja de solución en el aceite cerca de la punta de la aguja.Usando los controles de etapa, mueva el embrión hacia la punta de la aguja hasta que la punta perfore suavemente el embrión y entre en él. Simultáneamente, comience el flujo de la solución inyectable hasta que aparezca un punto claro transitorio en el sitio de la punta de la aguja, lo que indica una transferencia exitosa de la solución al embrión. Asegure el deslizamiento de la cubierta en el microscopio confocal con el soporte deslizante.Tenga cuidado ya que el deslizamiento de la cubierta es frágil. Inspeccione los embriones utilizando la función de epifluorescencia en el microscopio confocal con un objetivo 40X y asegúrese de que el fluoro 4 en el embrión sea visible antes de continuar. Para imágenes en vivo, durante las etapas sincitiales, establezca el tamaño de la imagen de 512 por 512 píxeles, un promedio de línea de tres y una velocidad de fotogramas de 0,1 fotogramas por segundo.Después de inyectar el tinte BODIPY 493 503, se localizó en el sitio donde se insertó la punta de la aguja y luego se difundió adyacente al sitio de inyección. Después de 24 minutos, el tinte se ha difundido más allá del punto medio del embrión. La motilidad del orgánulo se monitorizó inyectando al embrión con BODIPY 493 503 y LysoTracker Red.El análisis de velocimetría de imagen de partículas reveló que el contenido embrionario convergió en la región central del embrión, donde el citoplasma fluye hacia el interior del embrión. El etiquetado de la sala de emergencias, utilizando ER-Tracker Green, proporciona una resolución vívida de la envoltura nuclear, lo que permite la visualización de las principales etapas del ciclo celular. El embrión fue inyectado con MitoView 633 en la etapa de blastodermo y fotografiado cuatro horas después.La imagen muestra una célula neuroectodérmica de un embrión en extensión de banda germinal. Se inyectó un embrión celularizante con una mezcla de BODIPY 493 503 y SiR Tubulin, que muestra que las gotas de lípidos se mueven bidireccionalmente a lo largo de los microtúbulos. El embrión debe ser parcialmente desecado para que se pueda inyectar líquido.Muy poca desecación hará que el embrión se filtre cuando se inyecta, demasiada desecación matará al embrión. Los videos de orgánulos en movimiento se pueden caracterizar a través de diversas técnicas de análisis de imágenes. El seguimiento de partículas revela el comportamiento de orgánulos individuales, la velocimetría de imágenes de partículas revela el flujo a granel.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-objetivo Cromogénico Todo el montaje<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación para comparar dominios de expresión génica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocolos para la visualización androgénica, órganos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

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Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Imágenes confocales y de superresolución del tráfico intracelular polarizado y la secreción de proteínas de la membrana basal durante la oogénesis de Drosophila

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility in Drosophila

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos (Video) | JoVE 

Inhibición optogenética de la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 junto con la medición de la tensión epitelial en embriones de Drosophila

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

Collection of Drosophila Embryos and Preparing Them for Optogenetic Stimulation

Collection of Drosophila Embryos and Preparing Them for Optogenetic Stimulation (Video) | JoVE 

Recolección de embriones de Drosophila y preparación para estimulación optogenética