Name: visualizing cytoskeleton-dependent trafficking of lipid-containing organelles in drosophila embryos
Uploaded: 2021-12-13T13:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos at JoVE.com

Vi tackar Pakinee Phromsiri, Brian Jencik, Jinghong (James) Tang och Roger White för deras kommentarer till manuskriptet. Vi tackar Patrick Oakes, Stefano Di Talia och Victoria Deneke för att de delar med sig av sin expertis om hur man utför PIV-analys. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidrag F31 HD100127 (till M. D. K.) och R01 GM102155 (till M. A. W.).

<ol>
	<li>Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+organization+and+function+in+the+Drosophila+blastoderm+embryo.">Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).</li><li>Mavor, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab8+directs+furrow+ingression+and+membrane+addition+during+epithelial+formation+in+Drosophila+melanogaster.">Rab8 directs furrow ingression and membrane addition during epithelial formation in Drosophila melanogaster.</a> Development. 143 (5), 892-903 (2016).</li><li>Riggs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeleton+remodeling+during+early+Drosophila+furrow+formation+requires+recycling+endosomal+components+Nuclear-fallout+and+Rab11.">Actin cytoskeleton remodeling during early Drosophila furrow formation requires recycling endosomal components Nuclear-fallout and Rab11.</a> Journal of Cell Biology. 163 (1), 143-154 (2003).</li><li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos:+forces+and+kinetics.">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92 (4), 547-557 (1998).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=As+the+fat+flies:+The+dynamic+lipid+droplets+of+Drosophila+embryos.">As the fat flies: The dynamic lipid droplets of Drosophila embryos.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (9), 1156-1185 (2015).</li><li>Deneke, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+nuclear+positioning+synchronizes+the+cell+cycle+in+Drosophila+embryos.">Self-organized nuclear positioning synchronizes the cell cycle in Drosophila embryos.</a> Cell. 177 (4), 925-941 (2019).</li><li>Welte, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+perilipin+homolog+LSD2.">Regulation of lipid-droplet transport by the perilipin homolog LSD2.</a> Current Biology. 15 (14), 1266-1275 (2005).</li><li>Bailey, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+role+for+lipid+droplets+in+a+stem+cell+niche+of+Drosophila.">Antioxidant role for lipid droplets in a stem cell niche of Drosophila.</a> Cell. 163 (2), 340-353 (2015).</li><li>Johnson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2Av+buffering+via+dynamic+sequestration+to+lipid+droplets+in+Drosophila+embryos.">H2Av buffering via dynamic sequestration to lipid droplets in Drosophila embryos.</a> Elife. 7, 36021 (2018).</li><li>Lowe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+expression+patterns,+subcellular+localisations+and+interaction+partners+of+Drosophila+proteins+using+a+pigP+protein+trap+library.">Analysis of the expression patterns, subcellular localisations and interaction partners of Drosophila proteins using a pigP protein trap library.</a> Development. 141 (20), 3994-4005 (2014).</li><li>Rambold, A. S., Cohen, S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+trafficking+in+starved+cells:+regulation+by+lipid+droplet+lipolysis,+autophagy,+and+mitochondrial+fusion+dynamics.">Fatty acid trafficking in starved cells: regulation by lipid droplet lipolysis, autophagy, and mitochondrial fusion dynamics.</a> Developmental Cell. 32 (6), 678-692 (2015).</li><li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules.">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).</li><li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+centrifugation+of+Drosophila+embryos.">In-vivo centrifugation of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+collection.">Drosophila embryo collection.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li><li>Wieschaus, E., N&#252;sslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).</li><li>. The Interactive Fly: Stages of Development and Mitotic Domains Available from: <a target="_blank" href="https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm">https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm</a> (1999)</li><li>Liberzon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OpenPIV/openpiv-python: OpenPIV - Python (v0.22.2) with a new extended search PIV grid option. , (2020).</li><li>Markow, T. A., Beall, S., Matzkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+size,+embryonic+development+time+and+ovoviviparity+in+Drosophila+species.">Egg size, embryonic development time and ovoviviparity in Drosophila species.</a> Journal of Evolutionary Biology. 22 (2), 430-434 (2009).</li><li>Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein-mediated+cargo+transport+in+vivo.+A+switch+controls+travel+distance.">Dynein-mediated cargo transport in vivo. A switch controls travel distance.</a> Journal of Cell Biology. 148 (5), 945-956 (2000).</li><li>Debarre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+lipid+bodies+in+cells+and+tissues+using+third-harmonic+generation+microscopy.">Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy.</a> Nature Methods. 3 (1), 47-53 (2006).</li><li>Dou, W., Zhang, D., Jung, Y., Cheng, J. X., Umulis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+lipid-droplet+intracellular+motion+in+early+Drosophila+embryos+using+femtosecond-stimulated+Raman+loss+microscopy.">Label-free imaging of lipid-droplet intracellular motion in early Drosophila embryos using femtosecond-stimulated Raman loss microscopy.</a> Biophysical Journal. 102 (7), 1666-1675 (2012).</li><li>Barry, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injecting+Gryllus+bimaculatus+Eggs.">Injecting Gryllus bimaculatus Eggs.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), (2019).</li><li>Le Trionnaire, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+protocol+for+targeted+mutagenesis+with+CRISPR-Cas9+system+in+the+pea+aphid.">An integrated protocol for targeted mutagenesis with CRISPR-Cas9 system in the pea aphid.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 110, 34-44 (2019).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Drosophila-embryot är en kraftfull och bekväm modell för att studera grundläggande frågor inom cell- och organismbiologi. Dess relativa enkelhet, kraftfulla genetik och lilla storlek gör det till ett utmärkt system för avbildning av både cellulära processer och utveckling. Här är ett standardmikroinjektionsprotokoll anpassat för att möjliggöra FP-användning i embryon. Detta tillvägagångssätt möjliggör fluorescerande avbildning av specifika cellulära strukturer utan behov av genetiskt kodade fluoroforer, vilket öppnar många genetiska bakgrunder för avbildning. Genom att kombinera flera färgämnen plus strategiskt utvalda fluorescerande märkta proteiner kan man öppna flerkanalig liveavbildning som spänner över hela spektrumet av synligt ljus.
Kritiska steg i protokollet: Detta protokoll använder BODIPY 493/503 för att märka 1-1-00. Detta tillvägagångssätt kan enkelt anpassas för att markera andra cellulära strukturer. För efterföljande bildanalys är en av de viktigaste faktorerna signal-brusförhållandet, dvs färgämnets ljusstyrka jämfört med bakgrundssignalen. Lysosomer har framgångsrikt avbildats (LysoTracker Red, 1 mM), liksom mitokondrier (Mitoview 633, 200 μM), ER (ER tracker Green, 10 μM) och mikrotubuli (SiR tubulin, 200 nM i DMSO), som visas i figur 2, figur 3, figur 4, figur 5. Dessutom är äggula vesiklar autofluorescent och avger blått ljus vid UV-excitation (bild med 405 nm som excitationsvåglängd (figur 6)). För andra färgämnen, sikta på att färgämneskoncentrationen ska vara 100-1000x av vad som skulle behövas för färgning av odlade celler levande; detta liknar koncentrationen av en stamlösning som skulle spädas ut i cellodlingsmedier. Eftersom detta protokoll kräver en injektion av 100 fL och Drosophila-embryot är ungefär 9 nL i volym18, kommer dessa färgämneskoncentrationer i genomsnitt att uppgår till en intern embryonal koncentration på under 1/100 av vad som finns i cellodlingsmediet. Tillfälligt kommer den lokala koncentrationen att vara högre vid injektionsstället, vilket är mest relevant för FP som inte diffunderar väl (dvs mitokondriella färgämnen och SiR-tubulin). För dessa FP, börja med de rekommenderade höga koncentrationerna; Om oväntad död observeras, späd successivt två gånger tills en acceptabel kompromiss mellan överlevnad och signalstyrka uppnås.
Vid samtidig injektion av flera färgämnen bör båda färgämnena antingen vara i samma lösningsmedel, eller så bör både lösningsmedlen och färgämnena vara kompatibla med blandningen (alkoholkoncentrationer som överstiger ~ 10% rekommenderas inte).
Nålarnas kvalitet är avgörande för att denna procedur ska lyckas, eftersom spetsen måste vara så fin som möjligt. Annars kan skador från injektionssåret äventyra den efterföljande utvecklingen av embryot. Eftersom kommersiella nålavdragare skiljer sig åt är det viktigt att följa tillverkarens förslag och prova flera dragparametrar tills önskad form uppnås. Det är viktigt att utföra kvalitetskontrollsteg 1.1.3 eftersom arbetet med en sprucken, taggig eller stor borrnålspets kommer att göra den framgångsrika injektionen svårare eller till och med omöjlig.
Embryot måste torkas delvis så att ytterligare volymer vätska kan tillsättas under injektionen. Om embryot är undertorkat kommer nålen inte att komma in lätt, och cytoplasman sprutar ut när nålen tränger in eller när lösningen injiceras. Om embryot är övertorkat kommer det att se tömt ut och kommer inte att utvecklas ordentligt. Den exakta torktiden beror på lokala förhållanden, t.ex. luftfuktighet, och kan ändras från dag till dag. Det måste bestämmas empiriskt för varje session.
Embryots förmåga att överleva efter mikroinjektion beror kritiskt på nålens kvalitet, korrekt uttorkning och begränsning av injektionsvolymen till mindre än 1 pL (helst 100 fL). Så länge dessa parametrar är optimerade är ingen signifikant toxicitet uppenbar när de beskrivna färgämnena injiceras i rekommenderade koncentrationer. Om embryon överlever uttorknings- och injektionsstegen utvecklas de vanligtvis framgångsrikt väl till bakteriebandsförlängning, ett undantag är mikrotubuli- och ER-sonderna som orsakade cellulariseringsdefekter vid höga nivåer (100 fL injektion av stamkoncentrationen av varje). Testning fann inga uppenbara utvecklingsfel när DMSO, vatten och blandningar av de två injicerades vid de rekommenderade volymerna, med en embryoöverlevnad genom bakteriebandsförlängning på ~ 75% eller mer. Injektionsvolymer mer än över 1 pL orsakade defekter och embryon injicerade med ~ 4 pL volymer utvecklade under mindre än 1 timme. Därför måste injektionsvolymerna hållas låga, vilket innebär att färgämneskoncentrationerna måste vara höga.
I allmänhet rekommenderas injektioner längs embryots sidokant eftersom de resulterar i minst skada. Injektionsstället kan dock behöva justeras beroende på de diffusiva egenskaperna hos de FPs som används. BODIPY 493/503 och LysoTracker diffunderar snabbare över hela embryot än Lipid Spot 610 (ett annat färgämne för att markera 1-01), medan SiR-Tubulin och Mitoview 633 aldrig diffunderar helt över embryot (avbildning så sent som 7 timmar efter injektion). Således kan injektion i eller nära platsen av intresse vara nödvändig. Vid injektion i de främre eller bakre regionerna rekommenderas en särskilt fin nål.
Bildförvärv bygger på konfokalmikroskopi till optisk sektion och löser små organeller och alla cytoskelettkomponenter. Tekniker som kräver analys av många bilder (t.ex. STORM eller PALM) fungerar inte eftersom det embryonala innehållet är i rörelse och fluoroforerna inte är optimerade för fotoväxling. Epifluorescensmikroskopi saknar lateral och axiell upplösning för att ta fram de flesta organeller och mindre cellulära strukturer. Av dessa skäl rekommenderas det starkt att använda ett konfokalmikroskop eller använda ljusplåtsteknik.
Reproducerbarheten av bildanalysen är i hög grad beroende av konsekventa bilddata. För största chans att lyckas krävs optimering av injektionstekniken och bildförvärv. Att etablera och öva en teknik där färgämnen av intresse, injektionsställe, embryots ålder, injektionsvolym och förvärvsinställning är konsekventa kommer att generera de mest robusta data för bildanalys.
Ändringar och felsökning av metoden Detta protokoll demonstrerar en metod för att analysera bulkflödet av LD i klyvningsstadiumembryon med hjälp av partikelbildsverocimetri. Samma tillvägagångssätt kan användas för andra organeller, andra utvecklingsstadier och andra analysmetoder. Figur 2 visar till exempel analys av LD och sura organeller som flyter i de syncytiella stadierna av embryogenes, visualiserad genom att saminjicera BODIPY 493/503 och LysoTracker Red. Ytterligare framgångsrik avbildning av LD-rörelse i embryon upp till 7 timmar efter befruktning har uppnåtts; dessa embryon behåller injektionssåret men kan utvecklas i flera timmar.
Data som samlats in med hjälp av detta protokoll har använts för partikelbildselocimetri, men många andra analystekniker finns tillgängliga. Till exempel kan partikelspårningsprogram som de som finns i ImageJ, Imaris eller manuell spårning användas för att erhålla hastigheter och riktningar för rörliga strukturer. Observera att de flesta sådana spårningsprogram är byggda för att fungera med data från plana cellodlingssystem och inte alltid anpassar sig bra till 3D-strukturer som Drosophila-embryot . Vidare, för generering av partikelspårningsdata av bästa kvalitet, skulle flera Z-plan behöva avbildas; detta bör vara möjligt om förvärvstiderna för bildstacken är under ~ 2 s. Detta riktmärke bör kunna nås på snurrande skivkonfokal, gitterljusark och senaste laserskanningskonfokalsystem. Genomförbarheten av partikelspårning för rikliga organeller som LD, mitokondrier och lysosomer är dock låg eftersom mängden positiv signal i ett synfält är för hög för de nuvarande spårningsmetoderna. Spårning av mindre rikliga strukturer som kärnor eller äggula vesiklar kan vara möjligt. PIV för flödesanalys fungerar bra för LD och sura organeller i klyvningsstadier eftersom båda organellerna rör sig fritt. Organeller som kärnor, ER och mitokondrier är bundna till andra cellulära strukturer och rör sig därför inte fritt och är inte lämpade för mjukvaruanalys som förutsätter fri rörelse. Utredaren bör välja de tekniker som är bäst lämpade för organellen av intresse.
Under de syncytiella och cellulära blastodermstadierna rör sig LD (liksom några andra organeller) längs radiellt orienterade mikrotubuli5. Det är därför möjligt att hitta tvärsnittsvyer (som i figur 5) där enstaka mikrotubuli är i fokus för långa avstånd, vilket möjliggör partikelspårning i 2D. Eftersom dessa optiska plan är djupt inne i embryot minskar den totala signalstyrkan och signal-brusförhållandet reduceras.
För spårningsanalys kan avbildning så snabbt som möjligt avslöja viktiga detaljer om rörelsen och därmed av det rörliga maskineriet. Till exempel är lipiddropprörelse en blandning av två rörliga tillstånd, långsam kort rörelse (~ 200 nm / s; genomsnittligt reseavstånd ~ 100 nm) och snabb-lång rörelse (~ 450 nm / s; genomsnittligt reseavstånd ~ 1000 nm) 19; Således, om bilder tas varje sekund eller ännu mindre ofta, blir det långsamma korta tillståndet odetekterbart. Emellertid inducerar frekvent avbildning också fluoroforblekning och fototoxicitet. Bildförhållandena måste därför justeras beroende på den exakta frågan som ska behandlas.
Begränsningar av metoden Beroende på önskat färgämne kan metoden begränsas av kompatibiliteten mellan färgämnets löslighet och injektionslösningens toxicitet. Alkoholer som isopropanol och etanol är svåra att hantera i en nål på grund av deras lägre viskositet och verkar skada cellulära komponenter och döda embryot.
Metoden är inte heller väl lämpad för att visualisera de tidigaste stegen i embryogenesen eftersom det tar 30+ minuter att förbereda embryona för injektion. Vid rumstemperatur är embryonets initiala cellcykler bara ~ 10 minuter långa vardera; så även om man skulle välja ett nybefruktat ägg i steg 5.2.3, skulle de första cellcyklerna redan vara färdiga när embryot är klart för avbildning.
Belysning med ljus i UV/blått område är betydligt mer fototoxisk än för längre våglängder. Under sådana förhållanden (t.ex. att följa autofluorescerande äggula vesiklar; Figur 6), man måste begränsa avbildningstiden (vilket leder till kortare tidsserier) eller använda lägre lasereffekt (vilket resulterar i ett minskat signal-brusförhållande).
Efter cellularisering tenderar färgämnen som injiceras på en specifik plats att diffundera dåligt, eftersom de måste korsa många cellmembran. Detta begränsar observationsområdet i senare utvecklingsstadier.
Metodens betydelse med avseende på befintliga/alternativa metoder Rörelsen av LD och andra lipidinnehållande organeller i tidiga embryon kan visualiseras med genetiskt kodade fluoroforer, etikettfria tekniker och genom införande av FP. Det senare kan uppnås genom permeabilisering av vitellinmembranet12 eller mikroinjektionsmetoden som diskuteras här.
Genetiskt kodade fluoroforer är mångsidiga markörer vars nivåer vanligtvis är mycket reproducerbara från embryo till embryo. De har dock lägre kvantutbyten och blekmedel lättare än FP: er. Vanligtvis är de bara tillgängliga i en eller två taggade versioner (t.ex. GFP eller mCherry), vilket begränsar valet av vilka strukturer som kan avbildas samtidigt. FP, å andra sidan, finns ofta i en stor variation; till exempel finns olika lipiddroppsspecifika färgämnen tillgängliga med emissionsspektra från Autodot i UV / blått spektrum till Lipidtox och LipidSpot 610 i det avlägsna röda spektrumet. FP kan också appliceras direkt på alla stammar av intresse och kräver därför inte töjningskonstruktion för att till exempel införa den önskade organellmarkören i en mutant stam av intresse. Denna fördel är särskilt uttalad när flera strukturer ska märkas samtidigt; istället för tidskrävande kors som sträcker sig över flera generationer kan detta uppnås på en enda dag genom att blanda relevanta färgämnen och introducera dem samtidigt. Slutligen, om cellulära processer ska undersökas med farmakologisk hämning, kan läkemedel och färgämnen införas tillsammans.
Etikettfria metoder är mycket kraftfulla metoder för att upptäcka specifika cellulära strukturer. Till exempel kan 1-0-tal detekteras specifikt i tidiga embryon genom tredje harmoniska generationens mikroskopi20 eller genom femtosekund Stimulerad Ramanförlustmikroskopi21. Liksom FP kan dessa metoder tillämpas i vilken genetisk bakgrund som helst, och eftersom de inte orsakar blekning möjliggör de potentiellt snabbare bildförvärv. De är emellertid vanligtvis begränsade till specifika organeller och stöder därför inte i sig multiplexavbildning; de kräver också specialiserade mikroskop.
Det finns två allmänna strategier för att införa små molekyler i embryon. En är mikroinjektionsmetoden som används här; den andra är kemisk (terpen) behandling för att permeabilisera vitellinmembranet. Det senare tillvägagångssättet12 är mindre involverat än mikroinjektion, men också mer variabelt från embryo till embryo. Dessutom, efter permeabilisering, äventyras skyddet från vitellinmembranet och embryot är tillgängligt för det yttre mediet, vilket gör det mer utmanande att hålla det vid liv. Mikroinjektion är mycket mindre sannolikt att spåra embryonal utveckling än permeabilisering. Permeabilisering rekommenderas dock om många embryon behöver övervakas samtidigt, t.ex. för läkemedelsscreening. För att följa rörelsen av cellulära strukturer och erhålla reproducerbara bildserier som är lämpliga för bildanalys är mikroinjektion den valda metoden.
Metodens betydelse och potentiella tillämpningar inom specifika forskningsområden Drosophila-embryot är ett viktigt modellsystem för att studera många cellbiologiska och utvecklingsprocesser 1,5,6. Märkning av organeller med fluorescerande proteiner har gjort stora bidrag till förståelsen av hur det tidiga embryot utvecklas, hur olika organeller trafikerar och hur sådan handel moduleras utvecklingsmässigt och genetiskt. Men deras benägenhet att bleka och utmaningarna med att generera stammar där flera organeller är märkta med olika färger begränsar tillämpningen av detta tillvägagångssätt. Användningen av FP som introduceras av mikroinjektion löser många av dessa utmaningar och kan till och med kombineras med fluorescerande märkta proteiner. Denna teknik möjliggör avbildning av flera organeller, cellstrukturer och cytoskelettkomponenter i vilken genetisk bakgrund som helst. Som ett resultat kan flera genotyper jämföras via levande avbildning, vilket gör det möjligt att bestämma effekten av mutationer på handeln med flera organeller.
Detta protokoll visar FP-injektionsmetoden för embryon av Drosophila melanogaster, men i princip gäller detta tillvägagångssätt för alla insektsägg för vilka mikroinjektionstekniker har fastställts, inklusive andra arter av Drosophila, syrsor22 och bladlöss23.

Vitala färgämnen och molekylära sonder är kraftfulla verktyg för att avbilda specifika cellulära strukturer och organeller levande. I Drosophila-embryot visar många olika organeller cytoskelettdriven lokalisering 1,2,3,4, men appliceringen av dessa små molekyler är utmanande eftersom äggskalet är ogenomträngligt för många av dem. Detta protokoll beskriver en metod för att använda fluorescerande sonder (FP) i levande embryon via mikroinjektion för att upptäcka storskalig handel med organeller. Förfarandet omfattar beredning av injektionslösningen, ägguppsamling och beredning av embryon, mikroinjektion, avbildning och bildanalys.
Dramatiska rumsliga omarrangemang av organeller är vanliga i många djuroocyter, ägg och embryon, delvis på grund av den stora storleken på dessa celler. I Drosophila-embryot rör sig till exempel lipiddroppar (ED) och äggula vesiklar mot embryocentret strax före cellularisering5. Denna rörelse beror på mikrotubuli och lämnar en ~ 40 μm region runt periferin av embryot utarmat av de två organellerna. Under tidigare klyvningsstadier transporteras många organeller av cytoplasmatiska flöden som drivs av aktin-myosinbaserade sammandragningar vid embryoytan6. Även om embryon från många arter uppvisar liknande omarrangemang, är Drosophila-embryot särskilt lämpat för att följa dessa processer genom avbildning eftersom det utvecklas externt vid standard laboratoriets "rumstemperatur", är relativt transparent, tillräckligt liten för att passa på de flesta mikroskopinställningar och kan manipuleras med hjälp av kraftfulla genetiska verktyg.
För vissa organeller finns fluorescerande märkta proteiner tillgängliga som specifikt märker dessa strukturer. Till exempel är LSD-2 (även känd som dPLIN2) ett protein som i embryon specifikt riktar sig mot 1100-talet 7. Flyglinjer finns tillgängliga som bär antingen inducerbara transgener som kodar för en fusion mellan grönt fluorescerande protein (GFP) och LSD-28 eller en genfälla där gult fluorescerande protein (YFP) sätts in i den kodande regionen i den endogena LSD-2-genen 9,10. Detta tillvägagångssätt har emellertid begränsningar, inklusive att dessa fusionsproteiner har låga kvantutbyten och tenderar att bleka lätt. Dessutom kan märkning av flera olika strukturer samtidigt vara utmanande: för många organeller är endast en typ av fluorescerande tagg (ofta GFP eller mCherry) för närvarande tillgänglig, så avbildning av två organeller samtidigt kan kräva nya transgener eller insättningar; Även om kompatibla taggar är tillgängliga kan det krävas tidskrävande kors för att introducera dem i en enda stam. Det gör det också mindre bekvämt att använda de många kraftfulla genetiska resurserna, t.ex. om två organellmarkörer, en Gal4-drivrutin och en inducerbar RNAi-konstruktion alla måste vara närvarande i samma mamma.
I princip kan dessa begränsningar övervinnas med användning av FP, inklusive vitala färgämnen (t.ex. LysoTracker för att markera lysosomer), molekylära sonder (t.ex. SiR-tubulin för att märka mikrotubuli) och fluorescerande märkta biologiska molekyler (t.ex. C12 BODIPY för att undersöka fettsyrametabolism11). Från användning i odlade celler är de vanligtvis väl validerade som kraftfulla verktyg för att undersöka cellbiologi. FP: er är mångsidiga, har överlägsna fotoegenskaper och är kompatibla med fluorescerande proteiner. Flera färgämnen kan blandas och appliceras samtidigt, ofta med fördelarna med separation i de violetta / blå och långröda områdena i spektrumet och små Stokes-skift, vilket förhindrar att kanalen blöder igenom. Små Stokes-skift möjliggör samtidig inspelning av flera bildkanaler, vilket möjliggör spårning av flera organeller samtidigt. Slutligen kan de också tillämpas på märkning av organeller i embryon från andra Drosophila-arter eller till och med andra insekter där inga fluorescerande märkta proteiner kan finnas tillgängliga.
De flesta av dessa FP kan emellertid inte korsa den utarbetade äggskalan hos Drosophila-embryot . Den består av fem lager: tre yttre korionskikt (korion) som förhindrar mekanisk skada plus ett vaxartat skikt som omger vitellinmembranet som skapar en kemisk barriär12. För enkelhetens skull kommer kombinationen av det vaxartade skiktet och vitellinmembranet att kallas "vitellinmembranet" nedan. För att kringgå äggskalet anpassar detta protokoll en etablerad embryomikroinjektionsmetod för att införa FP i Drosophila-embryot . Protokollet beskriver hur man övervakar det cytoplasmatiska flödet av LD i klyvningsstadiet embryon. Det innefattar beredning av injektionsnålar och ägguppsamlingsburar, processen för ägguppsamling och mekaniskt avlägsnande av korionen. Den går igenom hur man mikroinjekerar och avbildar embryona och hur man analyserar bulkflödet av LD med hjälp av partikelbildsverocimetri (PIV, anpassad från6). Den ger råd om felsökning för att säkerställa embryoöverlevnad och skapa det bästa systemet för avbildning. Också diskuterat är hur protokollet kan modifieras för att samtidigt avbilda LD och mikrotubuli eller för att tillämpa det på studier av andra organeller, inklusive lysosomer, mitokondrier, äggula vesiklar och endoplasmatisk retikulum (ER).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AUTODO</td>
			<td>abcepta</td>
			<td>SM1000a</td>
			<td>Stains lipid droplets in violet/blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3922</td>
			<td>Stains lipid droplets in green</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Beads &#8211;Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Company</td>
			<td>21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4350030000000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape</td>
			<td>Scotch (3M)</td>
			<td>-</td>
			<td>Sold by many vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>E34251</td>
			<td>Stains the ER/nuclear envelope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femptotip II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H129354N</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Must be pulled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Buy the appropriate refractive index for your objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane 
			greener alternative 
			anhydrous, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654-1L</td>
			<td>Heptane is considered toxic by the USA&#39;s OSHA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Sp5</td>
			<td>Many different types of confocal microscopes will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidSpot 610</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70069</td>
			<td>Stains lipid droplets in far red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Stains lysosomes in red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoView 633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70055</td>
			<td>Stains mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle loading pipette tips - 20uL microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td># 5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000, Next Generation Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiR-Tubulin</td>
			<td>Cytosketon Inc</td>
			<td>CY-SC014</td>
			<td>Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransferMan</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5178 NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViaFluor 405</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#70064</td>
			<td>Stains microtubules in violet/blue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing cytoskeleton-dependent trafficking of lipid-containing organelles in drosophila embryos

Tidiga Drosophila-embryon är stora celler som innehåller ett stort antal konventionella och embryospecifika organeller. Under de första tre timmarna av embryogenesen genomgår dessa organeller dramatiska rörelser som drivs av aktinbaserad cytoplasmatisk strömning och motordriven handel längs mikrotubuli. Utvecklingen av en mängd små, organellspecifika fluorescerande sonder (FP) gör det möjligt att visualisera ett brett spektrum av olika lipidinnehållande strukturer i vilken genotyp som helst, vilket möjliggör levande avbildning utan att kräva en genetiskt kodad fluorofor. Detta protokoll visar hur man injicerar vitala färgämnen och molekylära sonder i Drosophila-embryon för att övervaka handeln med specifika organeller genom levande avbildning. Detta tillvägagångssätt demonstreras genom märkning av lipiddroppar (LD) och efter deras bulkrörelse med partikelbildsverocimetri (PIV). Detta protokoll ger en strategi som är mottaglig för studier av andra organeller, inklusive lysosomer, mitokondrier, äggula vesiklar och ER, och för att spåra rörelsen hos enskilda LD längs mikrotubuli. Att använda kommersiellt tillgängliga färgämnen ger fördelarna med separation i de violetta / blå och långröda regionerna i spektrumet. Genom multiplex sammärkning av organeller och/eller cytoskelettelement via mikroinjektion är alla genetiska resurser i Drosophila tillgängliga för smugglingsstudier utan att behöva introducera fluorescerande märkta proteiner. Till skillnad från genetiskt kodade fluoroforer, som lätt har låga kvantutbyten och blekmedel, möjliggör många av de tillgängliga färgämnena snabb och samtidig fångst av flera kanaler med höga fotonutbyten.

Efter injektion kommer färgämnet endast att lokaliseras på den plats där nålspetsen sattes in. Färgämnet diffunderar sedan bort från injektionsstället beroende på dess diffusiva egenskaper. Figur 1 visar injektion av BODIPY 493/503, strax efter injektion (panel A) och 24 min senare (panel B). Efter 24 minuter har färgämnet tagit sig till ungefär mittpunkten på embryots långa axel.
Analys av organellmotilitet kan uppnås genom färgämnesinjektioner och time-lapse-avbildning. I figur 2 injicerades ett embryo samtidigt med BODIPY 493/503 (figur 2A) och LysoTracker Red (figur 2B) och avbildades med laser excitation vid 488 respektive 596 nm. Detta embryo avbildades sedan (en ram var 30: e s i 30 min, 5 min analyserades). Tidsserien kördes sedan genom PIV-analys, vars utdata visas via strömlinjeformningar i figur 2A,B. Observera att strömlinjeformningarna inte representerar banan för enskilda partiklar, men det cytoplasmatiska flödet härleds från att analysera alla partiklar i den regionen av cytoplasman. Genom märkning av två oberoende cellulära strukturer (LD och sura organeller) finner PIV-analysen liknande flöden, med båda etiketterna konvergerande på embryots centrala region där cytoplasman strömmar in i embryots inre6.
För närvarande tillgängliga FP tillåter märkning av många andra organeller och cellulära strukturer. Figur 3 visar märkningen av ER via ER tracker Green. ER tracker ger en fin upplösning av kärnhöljet, vilket möjliggör visualisering av större cellcykelsteg. ER tracker Green avbildas med 488 nm excitation.
Märkning av mitokondrierna är knepigt, eftersom de flesta testade färgämnen verkar vara fångade i den första mitokondrien de kommer in i. Å andra sidan upptäcktes inga tecken på färgämnestoxicitet, vilket gjorde det möjligt att följa märkta mitokondrier genom cellularisering och den ectodermala kärncykeln 15. Figur 4 visar en ectodermal cell flera timmar efter injektion med Mitoview 633 (excitationsvåglängd 633 nm).
BODIPY, Lysotracker och LipidSpot är robusta och kan användas för att förvärva ~ 500+ bilder vid 512 x 512, linjegenomsnitt 3, bildhastigheter från 1 / s till 0,1 / s. ER tracker Green, SiR-tubulin och de mitokondriella färgämnena som nämns är mindre robusta och ger ~ 50-200 bilder under samma förhållanden.
Från och med blastodermstadier rör sig LDs dubbelriktat längs mikrotubuli, som drivs av motsatta polaritetsmotorer kinesin-1 och cytoplasmatisk dynein5. Denna rörelse kan visualiseras genom att sammärka 1-10 och mikrotubuli genom att injicera både BODIPY 493/503 och SiR-Tubulin (Figur 5). Eftersom LD ofta vänder sin rörelseriktning (när de växlar mellan kinesin-1 och cytoplasmatisk dynein), fångar högre bildhastigheter under förvärvet bättre kritiska detaljer om LD-motilitet.
Levande avbildning av autofluorescerande äggula vesiklar är möjlig utan någon form av färgämne injektion (Figur 6). Autofluorescensen är emellertid svag och excitationslasern är fototoxisk. Således har levande avbildning av autofluorescerande äggula ett dåligt signal-brusförhållande i förhållande till färgämnesinjektion.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig01.jpg"> Figur 1: Diffusion av BODIPY 493/503 genom embryot. Färgämnet injicerades längs sidokanten mot den främre änden (uppe till höger) och diffunderar från detta injektionsställe till embryot och märker ED. (A) Färgämnet har diffunderats genom delar av embryot intill injektionsstället. (B) Ungefär 24 min/2 kärncykler senare har färgämnet spridit sig förbi embryots mittpunkt. Skalstång: 100 μm. En ram på 1024 x 1024 (linjegenomsnitt 4) förvärvades var 30: e s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig02.jpg"> Figur 2: Partikelbildsvelocimetri (PIV) för LD och sura organeller. Ett embryo injicerades med både BODIPY 493/503 och LysoTracker Red. (A) BODIPY kanal. (B) LysoTracker röd kanal. (A',B') Strömlinjeformade diagram genererade av PIV-analys av de två kanalerna som genereras från 10 sekventiella ramar, inklusive de som visas i A och B. A' motsvarar flödet av LD-er, och B' motsvarar flödet av sura organeller. Observera att både A ' och B' visar en sammanflöde till vänster om mitten där embryonalt innehåll strömmar ut ur synplanet, in i mitten av embryot. Observera också att BODIPY har spridit mer än LysoTracker eftersom olika färgämnen har olika diffusiva egenskaper. Skalstång: 100 μm. En ram på 1024 x 1024 (linjegenomsnitt 4) förvärvades var 30: e s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig03.jpg"> Figur 3: ER tracker etiketter syncytial nuclear divisions. Ett syncytial blastoderm embryo mikroinjicerades med ER tracker och en del av dess yta avbildades över tiden. (A) Spindelmontering under en kärnteknisk uppdelning. (B) Avskärning av kärnhöljet under samma uppdelning. (C) Efterföljande interfas. (D) Början av nästa division indikeras av centrosomutseende (förekomst av cirkulära ER-fria regioner, markerade med pilspetsar). Notera den gradvisa färgblekningen. Excitationsvåglängd: 488 nm. Skalstång: 5 μm. A: initial ram, B: 3 min förfluten tid, C: 10 min förfluten tid, D: 13 min förfluten. En ram på 1024 x 1024 (linjegenomsnitt 4) förvärvades var 30: e s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig04.jpg"> Figur 4: Mitoview 633 märkning av mitokondrier. Ett embryo injicerades med Mitoview 633 under det synkytiella blastodermstadiet och avbildades 4 timmar senare, efter cellularisering. Bilden visar en neuroektodermal cell av ett embryo i bakteriebandsförlängning. Skalstång: 5 μm. En ram på 1024 x 1024 (linjegenomsnitt 4) förvärvades var 30: e s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig05.jpg"> Figur 5: Sammärkning av 1-tal och mikrotubuli. Ett cellulariserande embryo injicerades med en blandning av BODIPY 493/503 (gul A,B,C) och SiR Tubulin (magenta A',B',C'). A'', B'', C'' visar de sammanslagna kanalerna. Panelerna A, A', och A'' visar den ursprungliga ramen, panelerna B, B' och B'' visar ramen efter 5 s och panelerna C, C' och C'' visar ramen efter 10 s. Skalstång: 5 μm. En ram på 512 x 512 (linjegenomsnitt 3) förvärvades var 2,5: e s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig06.jpg"> Figur 6: Avbildning av äggula vesiklar autofluorescens under syncytial klyvningsstadier. (A) I början av förvärvet. (B) Efter 8 min. (C) Efter 16 min. Excitation våglängd: 405 nm. Låg excitationsintensitet användes för att hålla embryot vid liv. Skalstång: 100 μm. En ram på 1024 x 1024 (linjegenomsnitt 4) förvärvades var 30: e s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Kompletterande uppgifter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/PIV_analysis_script_Kilwein_Welte_JoVE_2021.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos at JoVE.com

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

I det tidiga Drosophila-embryot är många organeller rörliga. I princip kan de avbildas live via specifika fluorescerande sonder, men äggskalet förhindrar direkt applicering på embryot. Detta protokoll beskriver hur man introducerar sådana sonder via mikroinjektion och sedan analyserar bulkorganellrörelse via partikelbildsverocimetri.

Visualisering av cytoskelettberoende handel med lipidhaltiga organeller i Drosophila-embryon

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

I det tidiga Drosophila-embryot genomgår många organeller storskalig rörelse. Vårt protokoll beskriver hur man övervakar denna rörelse med fluorescerande färgämnen som utvecklats för cellodling. Jämfört med fluorescerande proteiner är kommersiellt tillgängliga fluorescerande sonder ljusare och spänner över ett bredare spektrum av spektrumet.De möjliggör multiplex colabeling och kan användas i vilken genetisk bakgrund som helst. Det krävs övning och försök och fel för att veta hur länge man ska torka embryon, så att de antingen spricker under injektionen eller torkar upp och slutar utvecklas. Börja med att börja förbereda injektionsnålarna genom att placera kapillären i en kapillärhållare på nålavdragaren och säkra den med vingmuttrar.Rikta in kapillärens mitt mot värmeelementet. Enligt tillverkarens instruktioner väljer du lämpliga inställningar på nålavdragaren. Använd ett dissekerande mikroskop och utför kvalitetskontrolltestet.Tryck in nålarna i kittet horisontellt med nålspetsarna upphängda i luften. Täck nålarna med locket och förvara tills de används. Använd nålladdningsspetsar fästa vid en mikropipett och dra en mikroliter av injektionslösningen i spetsen utan att fånga luftbubblor.Håll nålen i ena handen med spetsen pekande bort med handskar och sätt in laddningsspetsen i den. Fördela vätskan nära nålspetsen, ta bort pipetten och håll nålen vertikalt tills vätskan rinner till spetsen. Täck behållaren med aluminiumfolie utan att skada nålspetsarna för att förhindra blekning av färgämnena.Använd en överföringspipett eller en mikropipetter och placera en liten droppe heptanlim i mitten av en rektangulär täckglidning och låt den avdunsta. För att avlägsna korionen mekaniskt, täck den lämpligt åldrade embryoplattan med ett tunt lager halokarbonolja 27 för att göra äggskalet transparent. Visa plattan under ett dissektionsmikroskop med transbelysning för att bekräfta embryostadiet och välj embryon i klyvningsstadier.Använd fin pincett, plocka upp ett embryo från önskat stadium genom att ta tag i dorsala bilagor och överför det till den förberedda glasskivan täckt med dubbelsidig tejp. Placera embryot på tejpen och minimera överföringen av olja. Rulla embryot försiktigt över tejpens yta genom att knuffa med sidan av pincettens spets utan att peta direkt på den.Fortsätt rulla embryot tills korionen fäster vid tejpen och sprickorna. Efter att korionen har spruckit, fortsätt rulla embryot för att skilja det från korionen, som förblir fast vid tejpen. Rulla tillbaka embryot på korionen, som är mindre vidhäftande än tejpen.Gnid försiktigt embryot med pincetten tills det fäster på pincetten för överföring. Överför sedan embryot till täckslipen och ta det i kontakt med limet för att hålla embryot på plats och separera det från pincetten. Justera embryonets orientering på täckslipen.Låt embryona torktorka i fem till 12 minuter genom att placera locket glida med embryon i uttorkningskammaren och försegla det. Ta av locket från kammaren och lägg en droppe halokarbonolja 700, som täcker embryon för att förhindra ytterligare uttorkning. Undersök dem under dissekeringsomfattningen och fortsätt till mikroinjektion om embryon uttorkades ordentligt.Placera 4X-målet i ljusbanan och justera embryon till fokus med hjälp av fokusknappen på mikroskopet. Flytta embryona horisontellt in i mitten av synfältet med hjälp av scenkontrollerna. Håll embryon vid kanten av synfältet och panorera bort som förberedelse för att sänka nålen.Stanna med samma fokalplan, sänk nålspetsen och se till att den är synlig i synfältet tillsammans med embryon. Kontrollera att nålen fungerar genom att dosera en del av injektionslösningen i halokarbonolja 700. Om det lyckas kommer en bubbla av lösning att visas i oljan nära nålspetsen.Använd scenkontrollerna och flytta embryot mot nålspetsen tills spetsen försiktigt punkterar embryot och går in i det. Samtidigt börjar flödet av injektionslösning tills en övergående klar fläck uppträder på platsen för nålspetsen, vilket indikerar framgångsrik lösningsöverföring till embryot. Fäst täckglidningen på konfokalmikroskopet med glidhållaren.Var försiktig eftersom täckglidningen är ömtålig. Inspektera embryona med hjälp av epifluorescensfunktionen på konfokalmikroskopet med ett 40X-mål och se till att fluor 4 i embryot är synligt innan du fortsätter. För liveavbildning ställer du in bildstorleken på 512 gånger 512 pixlar under de synkytiella stadierna, linjegenomsnittet på tre och en bildhastighet på 0,1 bilder per sekund.Efter att färgämnet BODIPY 493 503 injicerats lokaliserades det på den plats där nålspetsen sattes in och diffunderades sedan intill injektionsstället. Efter 24 minuter har färgämnet diffunderats förbi embryots mittpunkt. Organellmotiliteten övervakades genom att embryot injicerades med BODIPY 493 503 och LysoTracker Red.Partikelbildsverocimetrianalysen avslöjade att det embryonala innehållet konvergerade på embryots centrala region, där cytoplasman strömmar in i embryots inre. Märkning av ER, med ER-Tracker Green, ger en levande upplösning av kärnhöljet, vilket möjliggör visualisering av större cellcykelsteg. Embryot injicerades med MitoView 633 i blastodermstadiet och avbildades fyra timmar senare.Bilden visar en neuroektodermal cell av ett embryo i bakteriebandsförlängning. Ett cellulariserande embryo injicerades med en blandning av BODIPY 493 503 och SiR Tubulin, vilket visar att lipiddropparna rör sig dubbelriktat längs mikrotubuli. Embryot måste vara delvis uttorkat så att vätska kan injiceras.För lite uttorkning kommer att få embryot att läcka när det injiceras, för mycket uttorkning kommer att döda embryot. Videor av rörliga organeller kan karakteriseras via olika bildanalystekniker. Partikelspårning avslöjar beteendet hos enskilda organeller, partikelavbildningsverocimetri avslöjar bulkflödet.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-mål Kromogent Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering för jämförelse Gene Expression domäner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protokoll för Visualisering steroidogena organ och deras interaktiva organ med immunfärgning i fruktflugan<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Upptining, odling och bevarandet Drosophila cellinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods i levande värme stressade Drosophila embryon

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Visualisera effekterna av oxidativ skada på Drosophila äggkammare med levande avbildning

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Konfokal och superupplöst avbildning av polariserad intracellulär handel och utsöndring av källarmembranproteiner under Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility in Drosophila

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos (Video) | JoVE 

Optogenetisk hämning av rho1-medierad aktomyosinkontraktilitet i kombination med mätning av epitelspänning i Drosophila-embryon

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...