Name: induction of intestinal inflammation by adoptive transfer of cbir1 tcr transgenic cd4+ t cells to immunodeficient mice
Uploaded: 2021-12-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health-beurzen DK125011, AI150210 en DK124132, de University of Texas System STARs-prijs (Y.C.) en het James W. McLaughlin Fellowship Fund van the University of Texas Medical Branch in Galveston (W.Y.). Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.

Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens het Comité voor het gebruik en de verzorging van de dieren van de University of Texas Medical Branch. CBir1 TCR Tg-muizen werden geleverd door Dr. Charles Elson van de Universiteit van Alabama in Birmingham. CBir1 TCR Tg-muizen kunnen vrouwelijk of mannelijk zijn, maar moeten 8-12 weken zijn. Rag1-/- muizen op de C57BL/6 achtergrond werden verkregen uit het Jackson Laboratory10. Rag1-/- muizen moeten geslachts-...

<ol>
	<li>Kaplan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+IBD:+From+2015+to+2025.">The global burden of IBD: From 2015 to 2025.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).</li><li>Ananthakrishnan, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+for+IBD.">Epidemiology and risk factors for IBD.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 12 (4), 205-217 (2015).</li><li>Yang, W., Cong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota-derived+metabolites+in+the+regulation+of+host+immune+responses+and+immune-related+inflammatory+diseases.">Gut microbiota-derived metabolites in the regulation of host immune responses and immune-related inflammatory diseases.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 18 (4), 866-877 (2021).</li><li>Pickard, J. M., Zeng, M. Y., Caruso, R., N&#250;&#241;ez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. 279 (1), 70-89 (2017).</li><li>Russler-Germain, E. V., Rengarajan, S., Hsieh, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+regulatory+T-cell+responses+to+intestinal+microbiota.">Antigen-specific regulatory T-cell responses to intestinal microbiota.</a> Mucosal Immunology. 10 (6), 1375-1386 (2017).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+metabolite+butyrate+differentially+regulates+Th1+and+Th17+cells'+differentiation+and+function+in+induction+of+colitis.">Microbiota metabolite butyrate differentially regulates Th1 and Th17 cells' differentiation and function in induction of colitis.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 25 (9), 1450-1461 (2019).</li><li>Cong, Y., Weaver, C. T., Lazenby, A., Elson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial-reactive+T+regulatory+cells+inhibit+pathogenic+immune+responses+to+the+enteric+flora.">Bacterial-reactive T regulatory cells inhibit pathogenic immune responses to the enteric flora.</a> Journal of Immunology. 169 (11), 6112-6119 (2002).</li><li>Lodes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+flagellin+is+a+dominant+antigen+in+Crohn+disease.">Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 113 (9), 1296-1306 (2004).</li><li>Targan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+CBir1+flagellin+define+a+unique+response+that+is+associated+independently+with+complicated+Crohn's+disease.">Antibodies to CBir1 flagellin define a unique response that is associated independently with complicated Crohn's disease.</a> Gastroenterology. 128 (7), 2020-2028 (2005).</li><li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAG-1-deficient+mice+have+no+mature+B+and+T+lymphocytes.">RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes.</a> Cell. 68 (5), 869-877 (1992).</li><li>Charan, J., Kantharia, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+calculate+sample+size+in+animal+studies.">How to calculate sample size in animal studies.</a> Journal of Pharmacology &amp; Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).</li><li>Kwizera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+trypan+blue+stain+in+the+TC20+automated+cell+counter+as+a+point-of-care+for+the+enumeration+of+viable+cryptococcal+cells+in+cerebrospinal+fluid.">Evaluation of trypan blue stain in the TC20 automated cell counter as a point-of-care for the enumeration of viable cryptococcal cells in cerebrospinal fluid.</a> Medical Mycology. 56 (5), 559-564 (2018).</li><li>Boyman, O., L&#233;tourneau, S., Krieg, C., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+proliferation+and+survival+of+na&#239;ve+and+memory+T+cells.">Homeostatic proliferation and survival of na&#239;ve and memory T cells.</a> European Journal of Immunology. 39 (8), 2088-2094 (2009).</li><li>Chai, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells,+derived+from+na&#239;ve+CD4+CD25-+T+cells+by+in+vitro+Foxp3+gene+transfer,+can+induce+transplantation+tolerance.">Regulatory T cells, derived from na&#239;ve CD4+CD25- T cells by in vitro Foxp3 gene transfer, can induce transplantation tolerance.</a> Transplantation. 79 (10), 1310-1316 (2005).</li><li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Swiss-rolling+technique+for+intestinal+tissue+preparation+for+immunohistochemical+and+immunofluorescent+analyses.">Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).</li><li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Swiss-rolling+technique+for+intestinal+tissue+preparation+for+immunohistochemical+and+immunofluorescent+analyses.">Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Erben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+histomorphological+evaluation+of+intestinal+inflammation+in+mouse+models.">A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 7 (8), 4557-4576 (2014).</li><li>Tuijnman, W. B., Van Wichen, D. F., Schuurman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+of+human+IgG+Fc+receptors+CD16,+CD32+and+CD64:+An+immunohistochemical+study.">Tissue distribution of human IgG Fc receptors CD16, CD32 and CD64: An immunohistochemical study.</a> APMIS. 101 (4), 319-329 (1993).</li><li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Intestinal microbiota-derived short-chain fatty acids regulation of immune cell IL-22 production and gut immunity. 11 (1), 4457 (2020).</li><li>Reinoso Webb, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+to+t+cell-induced+colitis+in+mice.+Role+of+the+Intestinal+Microbiota.">Differential susceptibility to t cell-induced colitis in mice. Role of the Intestinal Microbiota.</a> Inflammatory Bowel Disease. 24 (2), 361-379 (2018).</li><li>Bamias, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+intestinal+lymphocyte+activation+and+Th1+cytokine+production+by+antibiotic+therapy+in+a+murine+model+of+Crohn's+disease.">Down-regulation of intestinal lymphocyte activation and Th1 cytokine production by antibiotic therapy in a murine model of Crohn's disease.</a> Journal of Immunology. 169 (9), 5308-5314 (2002).</li><li>Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+murine+intestinal+inflammation+by+adoptive+transfer+of+effector+CD4++CD45RB+high+T+cells+into+immunodeficient+mice.">Induction of murine intestinal inflammation by adoptive transfer of effector CD4+ CD45RB high T cells into immunodeficient mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52533 (2015).</li><li>Atale, N., Gupta, S., Yadav, U. C., Rani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-death+assessment+by+fluorescent+and+nonfluorescent+cytosolic+and+nuclear+staining+techniques.">Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques.</a> Journal of Microscopy. 255 (1), 7-19 (2014).</li><li>Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+in+IBD.">The gut microbiota in IBD.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 9 (10), 599-608 (2012).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota-derived+short-chain+fatty+acids+promote+Th1+cell+IL-10+production+to+maintain+intestinal+homeostasis.">Microbiota-derived short-chain fatty acids promote Th1 cell IL-10 production to maintain intestinal homeostasis.</a> Nature Communications. 9 (1), 3555 (2018).</li><li>Feng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells+induce+colitis+and+promote+Th1+cell+responses+through+IL-17+induction+of+innate+IL-12+and+IL-23+production.">Th17 cells induce colitis and promote Th1 cell responses through IL-17 induction of innate IL-12 and IL-23 production.</a> Journal of Immunology. 186 (11), 6313-6318 (2011).</li><li>Chiaranunt, P., Tometich, J. T., Ji, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> T Cell Proliferation and Colitis Are Initiated by Defined Intestinal Microbes. 201 (1), 243-250 (2018).</li><li>Feng, T., Cao, A. T., Weaver, C. T., Elson, C. O., Cong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-12+converts+Foxp3++regulatory+T+cells+to+interferon-&#947;-producing+Foxp3++T+cells+that+inhibit+colitis.">Interleukin-12 converts Foxp3+ regulatory T cells to interferon-&#947;-producing Foxp3+ T cells that inhibit colitis.</a> Gastroenterology. 140 (7), 2031-2043 (2011).</li></ol>

Hoewel elke stap essentieel is voor de reproduceerbaarheid van dit colitismodel, zijn er verschillende kritieke stappen. De ontvangende Rag-/- muizen moeten voldoende levensvatbare naϊve CD4+ T-cellen krijgen om darmontsteking te induceren. We gebruikten milten voor de isolatie van naïeve CD4+ T-cellen in plaats van MLN's. Omdat de opbrengst van naïeve CD4+ T-cellen in MLN's veel lager is dan in milten. CD62L komt sterk tot expressie in naïeve T-cellen en CD44 en C...

Inflammatoire darmziekten (IBD), voornamelijk waaronder de ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC), worden gekenmerkt door chronische, relapsing-remitting ontsteking van het maagdarmkanaal, die miljoenen wereldwijd treft1. Verschillende factoren zijn betrokken bij de ontwikkeling en pathogenese van IBD, waaronder genetische gevoeligheid, darmmicrobiota, immuunresponsen, dieet en levensstijl2. Het exacte mechanisme van IBD is echter nog steeds niet volledig begrepen.
Een van de bijzondere interesses is de interactie tussen darmmicrobiota en immuunresponsen van de gastheer bij het reguleren van darmontsteking3. Darmmicrobiota biedt een reeks immunostimulerende moleculen en antigenen, die immuunresponsen kunnen activeren4. Hoewel de balans tussen effector T-cellen en regulerende T-cellen (Tregs) van cruciaal belang is bij het handhaven van intestinale homeostase, draagt de overmatige intestinale mucosale CD4 + T-celrespons op darmmicrobiota-antigenen bij aan darmontsteking5,6,7. Als immunodominant darmmicrobiota-antigeen is CBir1 flagellin gerelateerd aan de pathogenese van humaan CD8,9. Bovendien induceert overdracht van CBir1 TCR transgene (Tg) T-cellen darmontsteking bij immuundeficiënte muizen6, die sterk lijken op de menselijke IBD, wat aangeeft dat dit T-celoverdrachtsmodel helpt bij het onderzoeken van de mechanismen van menselijke IBD.
Dit werk beschrijft het gedetailleerde protocol van het induceren van colitis bij Rag1-/- muizen door adoptieve overdracht van CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-cellen en het beoordelen van de ernst van de ziekte. Bovendien worden de verwachte resultaten getoond en worden de kritieke stappen van de procedure en probleemoplossing besproken, wat onderzoekers zal helpen de mechanismen van pathogenese van darmontsteking te onderzoeken en de potentiële geneesmiddelen voor de behandeling van IBD te testen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m vacuum-driven disposable bottle top filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-&#181;m strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-mL Transfer Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-9CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/32</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4-BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD62L-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Foxp3-PE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-5773-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IFN&#947;-FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>506922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>TC20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1600-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tube</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Separation Magnet</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociator Machine</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M, PH 8.0)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSD Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Lamp</td>
			<td>CoverShield</td>
			<td>BR40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) Stain Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab245880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>I24222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SHKE6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A687-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol-12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SH3002702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Arial Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Automatic Processor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>STP120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding/Processing Cassette</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>22048142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>424401</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of intestinal inflammation by adoptive transfer of cbir1 tcr transgenic cd4+ t cells to immunodeficient mice

Met de toename van de incidentie leggen inflammatoire darmziekten (IBD), chronische ziekten die het maagdarmkanaal aantasten, een aanzienlijke gezondheids- en financiële last op individuen en de samenleving. Daarom is het van cruciaal belang om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de pathogenese en ontwikkeling van IBD. Hier wordt een darmmicrobiota-antigeenspecifiek T-celtransfer colitismodel beschreven. CBir1 flagellin is erkend als het immunodominante darmbacteriële antigeen bij experimentele colitis en patiënten met de ziekte van Crohn. CBir1 TCR transgene naϊve CD4+ T-cellen, specifiek voor CBir1 flagellin, kunnen chronische colitis induceren na adoptieve overdracht naar immuun-deficiënte Rag1-/- muizen. De ernst van de ziekte wordt beoordeeld door histopathologie. De CD4+ T-celfenotypen in colon lamina propria worden ook bepaald. Dit model lijkt sterk op de ontwikkeling van IBD, dat een ideaal muizenmodel biedt voor het onderzoeken van de mechanismen die de pathogenese van IBD aansturen en het testen van de potentiële geneesmiddelen voor de behandeling van IBD.

Ongeveer 5 x 106 CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T cellen per milt werden geïsoleerd uit een volwassen CBir1 TCR Tg muis. Overdracht van CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-cellen veroorzaakte chronische colitis bij ontvangende Rag1-/- muizen. Na celoverdracht werden klinische symptomen gecontroleerd om de progressie van darmontsteking te evalueren, waaronder gewichtsverlies, consistentie van de ontlasting en gebogen houding. Zoals verwacht begonnen muizen ongeveer drie weken na de c...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice at JoVE.com

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

In dit protocol wordt een darmmicrobiota-antigeenspecifiek T-cel adoptief transfer colitismodel beschreven. CD4+ T-cellen worden geïsoleerd uit CBir1 TCR transgene muizen. Deze zijn specifiek voor een immunodominant darmmicrobiota-antigeen CBir1 flagellin, dat wordt overgedragen in ontvangende Rag1-/- muizen, wat leidt tot darmontsteking.

Inductie van darmontsteking door adoptieve overdracht van CBir1 TCR transgene CD4 + T-cellen naar immunodeficiënte muizen

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable ...

Inflammatoire darmziekte, of IBD, legt een aanzienlijke gezondheids- en financiële last op individuen en de samenleving. Dit colitismodel is nuttig om de mechanismen van IBD te bestuderen en de behandelingen voor IBD te evalueren. Dit immunodominante Cbir flagellin T-cel-specifieke adoptieve transfer colitis model geeft inzicht in hoe darmbacteriën antigeen T-cel reacties induceert om colitis te induceren.Maak na het euthanaseren van de muis een linker buikincisie van ongeveer een centimeter en trek de huid weg van het buikspierweefsel. Maak vervolgens een incisie van ongeveer drie centimeter in het buikspierweefsel. Verwijder vervolgens de milt met een steriele schaar en tang.Leg de milt in een kweekschaal met vijf milliliter voorgekoelde wasbuffer. Maal de milt met het ruwe oppervlak van twee steriele glasglijbanen. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van 50 milliliter door deze door een celzeef van 100 micrometer te laten gaan.Spoel de glazen glaasjes en kweekschaal af met vijf milliliter voorgekoelde wasbuffer en breng de wasbuffer over in de buis. Centrifugeer de celsuspensie, gooi het supernatant weg en suspend de cellen opnieuw met vijf milliliter voorgewarmde Tris ammoniumchloride lysisbuffer per milt. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Voeg 10 milliliter voorgekoelde wasbuffer toe aan de buis. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie, gooi het supernatant weg en resuspend de cellen met 10 milliliter voorgekoelde isolatiebuffer. Om de cellen te tellen, mengt u 10 microliter elk van de celsuspensie en Trypan blauw grondig en laadt u 10 microliter op een dia.Plaats vervolgens de dia in de geautomatiseerde celteller om het levensvatbare celnummer te verkrijgen. Centrifugeer de resterende celsuspensie en gooi alle supernatant weg. Vortex de anti-muis CD4 magnetische deeltjes, voeg direct 50 microliter van de deeltjes per 10 miljoen cellen toe en meng grondig met celkorrels.Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Breng de celdeeltjessuspensie over in een steriele opvangbuis. Voeg 3,5 milliliter voorgekoelde isolatiebuffer toe aan de buis.Plaats de buis gedurende acht minuten op de celscheidingsmagneet bij kamertemperatuur. Adem vervolgens voorzichtig het supernatant af met een transferpipet van drie milliliter. Verwijder de buis uit de celscheidingsmagneet.Breng de cellen vervolgens opnieuw op met 3,5 milliliter voorgekoelde isolatiebuffer en plaats de buis gedurende vier minuten op kamertemperatuur op de magneet. Aspirateer het supernatant voorzichtig met een pipet van drie milliliter. Ten slotte resuspendeert u de cellen in één milliliter voorgekoelde FACS-buffer.Om de cellen over te brengen naar de ontvangende muizen, resuspend de Cbir1 TCR transgeen-naïeve CD4-positieve T-cellen tot 5 miljoen cellen per milliliter in 1x PBS. Verwarm de muizen onder een warmtelamp en houd de muizen in bedwang met behulp van een muisstabilisator. Injecteer intraveneus 200 microliter van de celsuspensie in de staartader van de muizen.Maak na het euthanaseren van de muis een ventrale middellijnhuidincisie van ongeveer één centimeter. Trek de huid weg van het buikspierweefsel. Maak vervolgens een incisie van drie centimeter in het buikspierweefsel.Identificeer vervolgens het coecum en verwijder de hele dikke darm met een steriele schaar en tang. Maak de dikke darm nat met voorgekoelde PBS in een kweekschaal. Snijd de dikke darm in de lengterichting in en spoel deze af met voorgekoeld PBS.Snijd 1/3 van de dikke darm in de lengterichting. Leg de dubbele darmstrook in een papieren handdoek met de lumenale zijde naar boven gericht. Voer Swiss-rolling uit met behulp van een tandenstoker.Plaats de dikke darm Swiss in een cassette en plaats de cassette gedurende 24 uur in 10% gebufferde formaline. Droog uit en paraffine-embed de dikke darm met een geautomatiseerde processor. Snijd vervolgens weefselsecties van vijf micrometer op een microtoom.Monteer het weefsel op dia's en voer hematoxyline- en eosinekleuring uit. De Rag knockout muizen begonnen gewicht te verliezen ongeveer drie weken na de celoverdracht, en hun gewicht bereikte ongeveer 80 tot 85% van hun oorspronkelijke gewicht zes weken na de celoverdracht. Ontvangende muizen vertoonden een korte colonlengte zes weken na de celoverdracht.De ontvangende muizen vertoonden vier weken na de celoverdracht meer celinfiltratie in de intestinale lamina propria. Ze toonden gobletcelverlies en intestinale epitheelcelhyperplasie vijf weken na celoverdracht, evenals mucosale erosie en ontstekingscelinfiltratie in de submucosa van de dikke darm zes weken na celoverdracht. De histopathologische scores namen aanzienlijk toe van vier tot zes weken.Tegelijkertijd was er geen ontsteking bij Rag knock-out muizen die alleen PBS kregen. Met behulp van deze procedure konden coloncytokineniveaus worden bepaald door ELISA en qPCR.

Research

JoVE Journal

Medicine

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Functionele Evaluatie van darmmotiliteit en de darmwand ontsteking in Knaagdieren: Analyses in een gestandaardiseerd model van Intestinal Manipulatie

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Neo-Islet Vorming in de lever van muizen met diabetes door Helper-afhankelijke adenovirale vector-gemedieerde genoverdracht

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

Generatie van subcutane en Intrahepatic Human Hepatocellular carcinoom Xenografts in immunodeficiënte muizen

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Inductie van Invasieve Transitional Cell blaascarcinoom in Immune Intact Human MUC1 transgene muizen: Een model voor Immunotherapie Ontwikkeling

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Muizen Endoscopie voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Multimodal Imaging van Carcinogenese en Evaluatie van intestinale wondgenezing en ontsteking

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Bile-duct Ligatie in Muizen: Inductie van Inflammatoire leverschade en Fibrosis door Obstructive Cholestase

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

Th17 Ontsteking Model van orofaryngeale candidiasis in Immunodeficient Muizen

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

Dry Powder and Nebulized Aerosol Inhalation of Pharmaceuticals Delivered to Mice Using a Nose-only Exposure System

Droge poeder en Nebulized aërosolinhalatie van farmaceutische producten geleverd aan muizen met behulp van een neus-only Belichtingssysteem

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Fluorescentie-gemedieerde tomografie voor de detectie en kwantificering van macrofaag-gerelateerde lymfkliertest darmontstekingen

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Induction of Nephrotic Syndrome in Mice by Retrobulbar Injection of Doxorubicin and Prevention of Volume Retention by Sustained Release Aprotinin

Inductie van nefrotisch syndroom bij muizen door retrobulbaire injectie van Doxorubicine en preventie van Volume bewaren door aanhoudende Release Aprotinin

Nephrotic syndrome is the most extreme manifestation of proteinuric kidney disease and characterized by heavy proteinuria, hypoalbuminemia, and edema due ...