Name: induction of intestinal inflammation by adoptive transfer of cbir1 tcr transgenic cd4+ t cells to immunodeficient mice
Uploaded: 2021-12-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice at JoVE.com

Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health Grants DK125011, AI150210 und DK124132, den University of Texas System STARs Award (Y.C.) und den James W. McLaughlin Fellowship Fund der University of Texas Medical Branch in Galveston (W.Y.) unterstützt. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.

Alle Tierprozeduren wurden gemäß dem Ausschuss für die Verwendung und Pflege der Tiere der University of Texas Medical Branch durchgeführt. CBir1 TCR Tg Mäuse wurden von Dr. Charles Elson von der University of Alabama in Birmingham zur Verfügung gestellt. CBir1 TCR Tg Mäuse können weiblich oder männlich sein, sollten aber nach 8-12 Wochen sein. Rag1-/- Mäuse auf dem C57BL/6-Hintergrund wurden aus dem Jackson Laboratory10 gewonnen. Rag1-/- Mäuse m...

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	<li>Kaplan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+IBD:+From+2015+to+2025.">The global burden of IBD: From 2015 to 2025.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).</li><li>Ananthakrishnan, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+for+IBD.">Epidemiology and risk factors for IBD.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 12 (4), 205-217 (2015).</li><li>Yang, W., Cong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota-derived+metabolites+in+the+regulation+of+host+immune+responses+and+immune-related+inflammatory+diseases.">Gut microbiota-derived metabolites in the regulation of host immune responses and immune-related inflammatory diseases.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 18 (4), 866-877 (2021).</li><li>Pickard, J. M., Zeng, M. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+regulatory+T-cell+responses+to+intestinal+microbiota.">Antigen-specific regulatory T-cell responses to intestinal microbiota.</a> Mucosal Immunology. 10 (6), 1375-1386 (2017).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+metabolite+butyrate+differentially+regulates+Th1+and+Th17+cells'+differentiation+and+function+in+induction+of+colitis.">Microbiota metabolite butyrate differentially regulates Th1 and Th17 cells' differentiation and function in induction of colitis.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 25 (9), 1450-1461 (2019).</li><li>Cong, Y., Weaver, C. T., Lazenby, A., Elson, C. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells,+derived+from+na&#239;ve+CD4+CD25-+T+cells+by+in+vitro+Foxp3+gene+transfer,+can+induce+transplantation+tolerance.">Regulatory T cells, derived from na&#239;ve CD4+CD25- T cells by in vitro Foxp3 gene transfer, can induce transplantation tolerance.</a> Transplantation. 79 (10), 1310-1316 (2005).</li><li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Swiss-rolling+technique+for+intestinal+tissue+preparation+for+immunohistochemical+and+immunofluorescent+analyses.">Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).</li><li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Swiss-rolling+technique+for+intestinal+tissue+preparation+for+immunohistochemical+and+immunofluorescent+analyses.">Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. 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Role of the Intestinal Microbiota.</a> Inflammatory Bowel Disease. 24 (2), 361-379 (2018).</li><li>Bamias, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+intestinal+lymphocyte+activation+and+Th1+cytokine+production+by+antibiotic+therapy+in+a+murine+model+of+Crohn's+disease.">Down-regulation of intestinal lymphocyte activation and Th1 cytokine production by antibiotic therapy in a murine model of Crohn's disease.</a> Journal of Immunology. 169 (9), 5308-5314 (2002).</li><li>Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. 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C., Rani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-death+assessment+by+fluorescent+and+nonfluorescent+cytosolic+and+nuclear+staining+techniques.">Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques.</a> Journal of Microscopy. 255 (1), 7-19 (2014).</li><li>Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+in+IBD.">The gut microbiota in IBD.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 9 (10), 599-608 (2012).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota-derived+short-chain+fatty+acids+promote+Th1+cell+IL-10+production+to+maintain+intestinal+homeostasis.">Microbiota-derived short-chain fatty acids promote Th1 cell IL-10 production to maintain intestinal homeostasis.</a> Nature Communications. 9 (1), 3555 (2018).</li><li>Feng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells+induce+colitis+and+promote+Th1+cell+responses+through+IL-17+induction+of+innate+IL-12+and+IL-23+production.">Th17 cells induce colitis and promote Th1 cell responses through IL-17 induction of innate IL-12 and IL-23 production.</a> Journal of Immunology. 186 (11), 6313-6318 (2011).</li><li>Chiaranunt, P., Tometich, J. T., Ji, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> T Cell Proliferation and Colitis Are Initiated by Defined Intestinal Microbes. 201 (1), 243-250 (2018).</li><li>Feng, T., Cao, A. T., Weaver, C. T., Elson, C. O., Cong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-12+converts+Foxp3++regulatory+T+cells+to+interferon-&#947;-producing+Foxp3++T+cells+that+inhibit+colitis.">Interleukin-12 converts Foxp3+ regulatory T cells to interferon-&#947;-producing Foxp3+ T cells that inhibit colitis.</a> Gastroenterology. 140 (7), 2031-2043 (2011).</li></ol>

Obwohl jeder Schritt für die Reproduzierbarkeit dieses Colitis-Modells unerlässlich ist, gibt es mehrere kritische Schritte. Die Empfänger-Rag-/- Mäuse sollten ausreichend lebensfähige naϊve CD4+ T-Zellen erhalten, um eine Darmentzündung auszulösen. Wir verwendeten Milz für die Isolierung von naiven CD4+ T-Zellen anstelle von MLNs. Weil die Ausbeute an naiven CD4+ T-Zellen in MLNs viel geringer ist als in Milzen. CD62L wird in naiven T-Zellen hoch exprimiert, ...

Entzündliche Darmerkrankungen (IBD), vor allem Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC), sind durch chronische, schubförmig remittierende Entzündungen des Magen-Darm-Traktes gekennzeichnet, von denen weltweit Millionen betroffen sind1. Mehrere Faktoren wurden an der Entwicklung und Pathogenese von IBD beteiligt, darunter genetische Anfälligkeit, Darmmikrobiota, Immunantworten, Ernährung und Lebensstil2. Der genaue Mechanismus von IBD ist jedoch noch nicht vollständig verstanden.
Eines der besonderen Interessen ist die Wechselwirkung zwischen Darmmikrobiota und Wirtsimmunantworten bei der Regulierung von Darmentzündungen3. Die Darmmikrobiota liefert eine Reihe von immunstimulierenden Molekülen und Antigenen, die Immunantworten aktivieren können4. Während das Gleichgewicht zwischen Effektor-T-Zellen und regulatorischen T-Zellen (Tregs) für die Aufrechterhaltung der Darmhomöostase entscheidend ist, trägt die übermäßige CD4+ T-Zell-Reaktion der Darmschleimhaut auf Darmmikrobiota-Antigene zur Darmentzündung bei5,6,7. Als immundominantes Darmmikrobiota-Antigen wurde CBir1-Flagellin mit der Pathogenese des menschlichen CD8,9 in Verbindung gebracht. Darüber hinaus induziert der Transfer von transgenen (Tg) CBir1 TCR-T-Zellen bei immundefizienten Mäusen6 eine Darmentzündung, die der menschlichen IBD sehr ähnlich ist, was darauf hindeutet, dass dieses T-Zell-Transfermodell dazu beiträgt, die Mechanismen der menschlichen IBD zu untersuchen.
Diese Arbeit beschreibt das detaillierte Protokoll der Induktion von Kolitis in Rag1-/- Mäusen durch adoptive Übertragung von CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-Zellen und die Beurteilung der Schwere der Erkrankung. Außerdem werden die erwarteten Ergebnisse gezeigt und die kritischen Schritte des Verfahrens und der Fehlerbehebung diskutiert, die den Forschern helfen werden, die Mechanismen der Pathogenese von Darmentzündungen zu untersuchen und die potenziellen Medikamente zur Behandlung von IBD zu testen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m vacuum-driven disposable bottle top filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-&#181;m strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-mL Transfer Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-9CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/32</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4-BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD62L-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Foxp3-PE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-5773-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IFN&#947;-FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>506922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>TC20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1600-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tube</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Separation Magnet</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociator Machine</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M, PH 8.0)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSD Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Lamp</td>
			<td>CoverShield</td>
			<td>BR40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) Stain Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab245880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>I24222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SHKE6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A687-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol-12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SH3002702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Arial Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Automatic Processor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>STP120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding/Processing Cassette</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>22048142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>424401</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of intestinal inflammation by adoptive transfer of cbir1 tcr transgenic cd4+ t cells to immunodeficient mice

Mit der Zunahme der Inzidenz stellen entzündliche Darmerkrankungen (IBD), bei denen es sich um chronische Erkrankungen des Magen-Darm-Trakts handelt, eine erhebliche gesundheitliche und finanzielle Belastung für den Einzelnen und die Gesellschaft dar. Daher ist es wichtig, die Mechanismen zu untersuchen, die der Pathogenese und Entwicklung von IBD zugrunde liegen. Hier wird ein Darmmikrobiota-Antigen-spezifisches T-Zell-Transfer-Kolitis-Modell beschrieben. CBir1 Flagellin wurde als immundominantes bakterielles Darmantigen bei experimenteller Kolitis und Patienten mit Morbus Crohn anerkannt. CBir1 TCR transgene naϊve CD4+ T-Zellen, spezifisch für CBir1-Flagellin, können nach adoptivem Transfer in immundefizierende Rag1-/- Mäuse eine chronische Kolitis induzieren. Der Schweregrad der Erkrankung wird durch Histopathologie beurteilt. Die CD4+ T-Zell-Phänotypen in der Kolonlamina propria werden ebenfalls bestimmt. Dieses Modell ähnelt stark der Entwicklung von IBD, die ein ideales mausines Modell für die Untersuchung der Mechanismen bietet, die die Pathogenese von IBD antreiben, und das Testen der potenziellen Medikamente zur Behandlung von IBD.

Etwa 5 x 106 CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-Zellen pro Milz wurden aus einer adulten CBir1 TCR Tg Maus isoliert. Der Transfer von CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-Zellen induzierte chronische Kolitis in Empfänger-Rag1-/- Mäusen. Nach dem Zelltransfer wurden klinische Symptome überwacht, um das Fortschreiten der Darmentzündung zu bewerten, einschließlich Gewichtsverlust, Stuhlkonsistenz und gebeugter Haltung. Wie erwartet, begannen Mäuse etwa drei Wochen nach dem Zelltransf...

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Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

In diesem Protokoll wird ein Darmmikrobiota-Antigen-spezifisches T-Zell-Adoptivtransfer-Kolitis-Modell beschrieben. CD4+ T-Zellen werden aus transgenen CBir1 TCR-Mäusen isoliert. Diese sind spezifisch für ein immundominantes Darmmikrobiota-Antigen CBir1 Flagellin, das in Empfänger-Rag1-/- Mäuse übertragen wird, was zu einer Darmentzündung führt.

Induktion von Darmentzündungen durch adoptive Übertragung von CBir1 TCR transgenen CD4+ T-Zellen auf immundefiziente Mäuse

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable ...

Entzündliche Darmerkrankungen oder IBD stellen eine erhebliche gesundheitliche und finanzielle Belastung für den Einzelnen und die Gesellschaft dar. Dieses Colitis-Modell ist hilfreich, um die Mechanismen von IBD zu untersuchen und die Behandlungen für IBD zu bewerten. Dieses immundominante Cbir-Flagellin-T-Zell-spezifische adoptive Transferkolitis-Modell liefert Einblicke in die Art und Weise, wie das Antigen von Darmbakterien T-Zell-Reaktionen induziert, um Kolitis zu induzieren.Nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben, machen Sie einen etwa einen Zentimeter langen linken Bauchschnitt und ziehen Sie die Haut vom Bauchmuskelgewebe weg. Machen Sie dann einen etwa drei Zentimeter langen Schnitt im Bauchmuskelgewebe. Als nächstes entfernen Sie die Milz mit steriler Schere und Pinzette.Legen Sie die Milz in eine Kulturschale mit fünf Millilitern vorgekühltem Waschpuffer. Schleifen Sie die Milz mit der rauen Oberfläche von zwei sterilen Glasobjektträgern. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, indem Sie sie durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb führen.Glasobjektträger und Kulturschale mit fünf Millilitern vorgekühltem Waschpuffer abspülen und in das Röhrchen geben. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension, verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Zellen mit fünf Millilitern vorgewärmtem Tris-Ammoniumchlorid-Lysepuffer pro Milz. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.10 Milliliter vorgekühlten Waschpuffer in das Röhrchen geben. Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension, verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Zellen mit 10 Millilitern vorgekühltem Isolationspuffer. Um die Zellen zu zählen, mischen Sie jeweils 10 Mikroliter Zellsuspension und Trypanblau gründlich und laden Sie 10 Mikroliter auf einen Objektträger.Führen Sie dann den Schieber in den automatisierten Zellzähler ein, um die lebensfähige Zellnummer zu erhalten. Zentrifugieren Sie die verbleibende Zellsuspension und verwerfen Sie alle Überstände. Wirbeln Sie die Anti-Maus-CD4-Magnetpartikel, fügen Sie direkt 50 Mikroliter der Partikel pro 10 Millionen Zellen hinzu und mischen Sie sie gründlich mit Zellpellets.Die Mischung 30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Die Zellpartikelsuspension in ein steriles Sammelröhrchen überführen. 3,5 Milliliter vorgekühlten Isolationspuffer in das Rohr geben.Legen Sie das Röhrchen acht Minuten bei Raumtemperatur auf den Zelltrennmagneten. Dann den Überstand vorsichtig mit einer Drei-Milliliter-Transferpipette absaugen. Entfernen Sie das Rohr vom Zelltrennmagneten.Anschließend werden die Zellen mit 3,5 Millilitern vorgekühltem Isolationspuffer wieder eingependelt und das Rohr für vier Minuten bei Raumtemperatur auf den Magneten gelegt. Den Überstand vorsichtig mit einer Drei-Milliliter-Pipette absaugen. Schließlich resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter vorgekühlten FACS-Puffer.Um die Zellen in die Empfängermäuse zu übertragen, resuspendieren Sie die Cbir1 TCR transgen-naiven CD4-positiven T-Zellen auf 5 Millionen Zellen pro Milliliter in 1x PBS. Erwärmen Sie die Mäuse unter einer Wärmelampe und halten Sie die Mäuse mit einem Mausfessel zurück. Intravenös 200 Mikroliter der Zellsuspension in die Schwanzvene der Mäuse injizieren.Nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben, machen Sie einen etwa einen Zentimeter großen ventralen Mittellinien-Hautschnitt. Ziehen Sie die Haut vom Bauchmuskelgewebe weg. Machen Sie dann einen drei Zentimeter langen Schnitt im Bauchmuskelgewebe.Als nächstes identifizieren Sie das Coecum und entfernen Sie den gesamten Dickdarm mit steriler Schere und Pinzette. Befeuchten Sie den Dickdarm mit vorgekühltem PBS in einer Kulturschale. Schneiden Sie den Dickdarm der Länge nach ein und spülen Sie ihn mit vorgekühltem PBS aus.Schneiden Sie 1/3 des Dickdarms längs ab. Legen Sie den Dickdarmstreifen in ein Papiertuch mit der Lumenalseite nach oben. Führen Sie Swiss-Rolling mit einem Zahnstocher durch.Legen Sie den Doppelpunkt Swiss in eine Kassette und legen Sie die Kassette für 24 Stunden in 10% gepuffertes Formalin. Dehydrieren und paraffinen Sie den Dickdarm mit einem automatisierten Prozessor ein. Schneiden Sie dann fünf Mikrometer schwere Gewebeschnitte auf einem Mikrotom.Montieren Sie das Gewebe auf Objektträgern und führen Sie eine Hämatoxylin- und Eosinfärbung durch. Die Rag-Knockout-Mäuse begannen etwa drei Wochen nach dem Zelltransfer an Gewicht zu verlieren, und ihr Gewicht erreichte sechs Wochen nach dem Zelltransfer etwa 80 bis 85% ihres ursprünglichen Gewichts. Empfängermäuse zeigten sechs Wochen nach dem Zelltransfer eine kurze Dickdarmlänge.Die Empfängermäuse zeigten vier Wochen nach dem Zelltransfer mehr Zellinfiltration in der Intestinallamina propria. Sie zeigten Kelchzellverlust und intestinale Epithelzellhyperplasie fünf Wochen nach dem Zelltransfer sowie Schleimhauterosion und entzündliche Zellinfiltration in der Submukosa des Dickdarms sechs Wochen nach dem Zelltransfer. Die histopathologischen Scores stiegen erheblich von vier auf sechs Wochen.Gleichzeitig gab es keine Entzündung bei Rag-Knockout-Mäusen, die PBS allein erhielten. Mit diesem Verfahren konnten die Kolonzytokinspiegel mittels ELISA und qPCR bestimmt werden.

Research

JoVE Journal

Medicine

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Functional Assessment of Darmmotilität und Darmwand Entzündung in Nagetiere: Analysen in einem standardisierten Modell der intestinalen Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Forschung

Medizin

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Neo-Islet Formation in Leber der diabetischen Mäuse von Helper-abhängigen Adenovirus-Vektor-vermittelten Gentransfer

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

Generierung von subkutanen und Intrahepatische Menschenleberzellkarzinom Xenografts in immundefizienten Mäusen

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Induktion von Invasive Transitional Handy Blasenkarzinom in Immune intakte menschliche MUC1 transgenen Mäusen: Ein Modell für Immuntherapie Entwicklung

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoskopie für<em&gt; In Vivo</em&gt; Multimodale Bildgebung der Krebsentstehung und Bewertung der Darm Wundheilung und Entzündung

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Gallengang-Ligation in Mice: Induktion von Entzündungsleber-Verletzung und Fibrose von obstruktiver Cholestase

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

Th17 Entzündung Modell Oropharyngeale Candidiasis in immundefizienten Mäusen

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

Dry Powder and Nebulized Aerosol Inhalation of Pharmaceuticals Delivered to Mice Using a Nose-only Exposure System

Trockenpulver und Vernebelte Aerosol Inhalation von Arzneimitteln geliefert an Mäusen Mit einem Nose-only Belichtungssystem

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Fluoreszenz-vermittelten Tomographie für die Erkennung und Quantifizierung von murinen Makrophagen bedingte Darmentzündung

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Induction of Nephrotic Syndrome in Mice by Retrobulbar Injection of Doxorubicin and Prevention of Volume Retention by Sustained Release Aprotinin

Induktion eines nephrotischen Syndroms bei Mäusen durch retrobulbären Injektion von Doxorubicin und Verhinderung von Volume Retention von verzögerter Freisetzung Aprotinin

Nephrotic syndrome is the most extreme manifestation of proteinuric kidney disease and characterized by heavy proteinuria, hypoalbuminemia, and edema due ...