Name: induction of intestinal inflammation by adoptive transfer of cbir1 tcr transgenic cd4+ t cells to immunodeficient mice
Uploaded: 2021-12-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health grants DK125011, AI150210 og DK124132, University of Texas System STARs award (Y.C.), og James W. McLaughlin Fellowship Fund fra University of Texas Medical Branch ved Galveston (W.Y.). Figur 1 ble opprettet med BioRender.com.

Alle dyreprosedyrer ble utført i henhold til University of Texas Medical Branch's Committee on the Use and Care of the animals. CBir1 TCR Tg mus ble levert av Dr. Charles Elson ved University of Alabama i Birmingham. CBir1 TCR Tg mus kan være kvinnelige eller mannlige, men bør være på 8-12 uker. Rag1-/- mus på C57BL/6-bakgrunn ble hentet fra Jackson Laboratory10. Rag1-/- mus må være kjønn og alderstilpasset, og enten mann eller kvinne kan brukes, m...

<ol>
	<li>Kaplan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+IBD:+From+2015+to+2025.">The global burden of IBD: From 2015 to 2025.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).</li><li>Ananthakrishnan, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+for+IBD.">Epidemiology and risk factors for IBD.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 12 (4), 205-217 (2015).</li><li>Yang, W., Cong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota-derived+metabolites+in+the+regulation+of+host+immune+responses+and+immune-related+inflammatory+diseases.">Gut microbiota-derived metabolites in the regulation of host immune responses and immune-related inflammatory diseases.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 18 (4), 866-877 (2021).</li><li>Pickard, J. M., Zeng, M. Y., Caruso, R., N&#250;&#241;ez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. 279 (1), 70-89 (2017).</li><li>Russler-Germain, E. V., Rengarajan, S., Hsieh, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+regulatory+T-cell+responses+to+intestinal+microbiota.">Antigen-specific regulatory T-cell responses to intestinal microbiota.</a> Mucosal Immunology. 10 (6), 1375-1386 (2017).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+metabolite+butyrate+differentially+regulates+Th1+and+Th17+cells'+differentiation+and+function+in+induction+of+colitis.">Microbiota metabolite butyrate differentially regulates Th1 and Th17 cells' differentiation and function in induction of colitis.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 25 (9), 1450-1461 (2019).</li><li>Cong, Y., Weaver, C. T., Lazenby, A., Elson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial-reactive+T+regulatory+cells+inhibit+pathogenic+immune+responses+to+the+enteric+flora.">Bacterial-reactive T regulatory cells inhibit pathogenic immune responses to the enteric flora.</a> Journal of Immunology. 169 (11), 6112-6119 (2002).</li><li>Lodes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+flagellin+is+a+dominant+antigen+in+Crohn+disease.">Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 113 (9), 1296-1306 (2004).</li><li>Targan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+CBir1+flagellin+define+a+unique+response+that+is+associated+independently+with+complicated+Crohn's+disease.">Antibodies to CBir1 flagellin define a unique response that is associated independently with complicated Crohn's disease.</a> Gastroenterology. 128 (7), 2020-2028 (2005).</li><li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAG-1-deficient+mice+have+no+mature+B+and+T+lymphocytes.">RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes.</a> Cell. 68 (5), 869-877 (1992).</li><li>Charan, J., Kantharia, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+calculate+sample+size+in+animal+studies.">How to calculate sample size in animal studies.</a> Journal of Pharmacology &amp; Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).</li><li>Kwizera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+trypan+blue+stain+in+the+TC20+automated+cell+counter+as+a+point-of-care+for+the+enumeration+of+viable+cryptococcal+cells+in+cerebrospinal+fluid.">Evaluation of trypan blue stain in the TC20 automated cell counter as a point-of-care for the enumeration of viable cryptococcal cells in cerebrospinal fluid.</a> Medical Mycology. 56 (5), 559-564 (2018).</li><li>Boyman, O., L&#233;tourneau, S., Krieg, C., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+proliferation+and+survival+of+na&#239;ve+and+memory+T+cells.">Homeostatic proliferation and survival of na&#239;ve and memory T cells.</a> European Journal of Immunology. 39 (8), 2088-2094 (2009).</li><li>Chai, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells,+derived+from+na&#239;ve+CD4+CD25-+T+cells+by+in+vitro+Foxp3+gene+transfer,+can+induce+transplantation+tolerance.">Regulatory T cells, derived from na&#239;ve CD4+CD25- T cells by in vitro Foxp3 gene transfer, can induce transplantation tolerance.</a> Transplantation. 79 (10), 1310-1316 (2005).</li><li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Swiss-rolling+technique+for+intestinal+tissue+preparation+for+immunohistochemical+and+immunofluorescent+analyses.">Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).</li><li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Swiss-rolling+technique+for+intestinal+tissue+preparation+for+immunohistochemical+and+immunofluorescent+analyses.">Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Erben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+histomorphological+evaluation+of+intestinal+inflammation+in+mouse+models.">A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 7 (8), 4557-4576 (2014).</li><li>Tuijnman, W. B., Van Wichen, D. F., Schuurman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+of+human+IgG+Fc+receptors+CD16,+CD32+and+CD64:+An+immunohistochemical+study.">Tissue distribution of human IgG Fc receptors CD16, CD32 and CD64: An immunohistochemical study.</a> APMIS. 101 (4), 319-329 (1993).</li><li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Intestinal microbiota-derived short-chain fatty acids regulation of immune cell IL-22 production and gut immunity. 11 (1), 4457 (2020).</li><li>Reinoso Webb, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+to+t+cell-induced+colitis+in+mice.+Role+of+the+Intestinal+Microbiota.">Differential susceptibility to t cell-induced colitis in mice. Role of the Intestinal Microbiota.</a> Inflammatory Bowel Disease. 24 (2), 361-379 (2018).</li><li>Bamias, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+intestinal+lymphocyte+activation+and+Th1+cytokine+production+by+antibiotic+therapy+in+a+murine+model+of+Crohn's+disease.">Down-regulation of intestinal lymphocyte activation and Th1 cytokine production by antibiotic therapy in a murine model of Crohn's disease.</a> Journal of Immunology. 169 (9), 5308-5314 (2002).</li><li>Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+murine+intestinal+inflammation+by+adoptive+transfer+of+effector+CD4++CD45RB+high+T+cells+into+immunodeficient+mice.">Induction of murine intestinal inflammation by adoptive transfer of effector CD4+ CD45RB high T cells into immunodeficient mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52533 (2015).</li><li>Atale, N., Gupta, S., Yadav, U. C., Rani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-death+assessment+by+fluorescent+and+nonfluorescent+cytosolic+and+nuclear+staining+techniques.">Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques.</a> Journal of Microscopy. 255 (1), 7-19 (2014).</li><li>Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+in+IBD.">The gut microbiota in IBD.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 9 (10), 599-608 (2012).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota-derived+short-chain+fatty+acids+promote+Th1+cell+IL-10+production+to+maintain+intestinal+homeostasis.">Microbiota-derived short-chain fatty acids promote Th1 cell IL-10 production to maintain intestinal homeostasis.</a> Nature Communications. 9 (1), 3555 (2018).</li><li>Feng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells+induce+colitis+and+promote+Th1+cell+responses+through+IL-17+induction+of+innate+IL-12+and+IL-23+production.">Th17 cells induce colitis and promote Th1 cell responses through IL-17 induction of innate IL-12 and IL-23 production.</a> Journal of Immunology. 186 (11), 6313-6318 (2011).</li><li>Chiaranunt, P., Tometich, J. T., Ji, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> T Cell Proliferation and Colitis Are Initiated by Defined Intestinal Microbes. 201 (1), 243-250 (2018).</li><li>Feng, T., Cao, A. T., Weaver, C. T., Elson, C. O., Cong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-12+converts+Foxp3++regulatory+T+cells+to+interferon-&#947;-producing+Foxp3++T+cells+that+inhibit+colitis.">Interleukin-12 converts Foxp3+ regulatory T cells to interferon-&#947;-producing Foxp3+ T cells that inhibit colitis.</a> Gastroenterology. 140 (7), 2031-2043 (2011).</li></ol>

Selv om hvert trinn er viktig for reproduserbarheten til denne kolittmodellen, er det flere kritiske trinn. Mottakeren Rag-/- mus bør få tilstrekkelig levedyktige naϊve CD4+ T-celler for å indusere tarmbetennelse. Vi brukte milt til isolering av naive CD4+ T-celler i stedet for MLNer. Fordi utbyttet av naive CD4+ T-celler i MLNer er mye lavere enn i milter. CD62L er sterkt uttrykt i naive T-celler, og CD44 og CD25 er aktiveringsmarkørene til T-ce...

Inflammatoriske tarmsykdommer (IBD), hovedsakelig inkludert Crohns sykdom (CD) og ulcerøs kolitt (UC), er preget av kronisk, relapsing-remitterende betennelse i mage-tarmkanalen, som påvirker millioner over hele verden1. Flere faktorer har vært involvert i utviklingen og patogenesen av IBD, inkludert genetisk følsomhet, tarmmikrobiota, immunresponser, kosthold og livsstil2. Imidlertid er den eksakte mekanismen til IBD fortsatt ikke helt forstått.
En av de spesielle interessene er samspillet mellom tarmmikrobiota og vertsimmuneresponser ved regulering av tarmbetennelse3. Tarmmikrobiota gir en rekke immunostimulatoriske molekyler og antigener, som kan aktivere immunresponser4. Mens balansen mellom effektor T-celler og regulatoriske T-celler (Tregs) er avgjørende for å opprettholde intestinal homeostase, bidrar overdreven intestinal slimhinne CD4 + T cellerespons på tarmmikrobiotaantigener til tarmbetennelse5,6,7. Som et immunodominant tarmmikrobiota-antigen har CBir1 flagellin vært relatert til patogenesen av menneskelig CD8,9. Videre induserer overføring av CBir1 TCR transgene (Tg) T-celler tarmbetennelse hos immundefektende mus6, som ligner den menneskelige IBD, noe som indikerer at denne T-celleoverføringsmodellen bidrar til å undersøke mekanismene til menneskelig IBD.
Dette arbeidet beskriver den detaljerte protokollen for å indusere kolitt i Rag1-/- mus ved adoptivoverføring av CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-celler og vurdere alvorlighetsgraden av sykdommen. Dessuten vises de forventede resultatene, og de kritiske trinnene i prosedyren og feilsøkingen diskuteres, noe som vil hjelpe forskere med å undersøke mekanismene for patogenese av tarmbetennelse og teste de potensielle stoffene for behandling av IBD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m vacuum-driven disposable bottle top filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-&#181;m strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-mL Transfer Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-9CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/32</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4-BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD62L-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Foxp3-PE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-5773-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IFN&#947;-FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>506922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>TC20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1600-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tube</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Separation Magnet</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociator Machine</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M, PH 8.0)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSD Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Lamp</td>
			<td>CoverShield</td>
			<td>BR40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) Stain Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab245880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>I24222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SHKE6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A687-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol-12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SH3002702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Arial Fusion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Automatic Processor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>STP120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding/Processing Cassette</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>22048142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>424401</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of intestinal inflammation by adoptive transfer of cbir1 tcr transgenic cd4+ t cells to immunodeficient mice

Med økningen av forekomst pålegger inflammatoriske tarmsykdommer (IBD), som er kroniske sykdommer som påvirker mage-tarmkanalen, en betydelig helse og økonomisk byrde på enkeltpersoner og samfunn. Derfor er det viktig å undersøke mekanismene som ligger til grunn for patogenesen og utviklingen av IBD. Her er en tarmmikrobiota antigenspesifikk T-celleoverføring kolittmodell beskrevet. CBir1 flagellin har blitt anerkjent som immunodominant tarmbakteriell antigen i eksperimentell kolitt og pasienter med Crohns sykdom. CBir1 TCR forbigående naϊve CD4+ T-celler, spesifikke for CBir1 flagellin, kan indusere kronisk kolitt etter adoptivoverføring til immundefektende Rag1-/- mus. Sykdommens alvorlighetsgrad vurderes av histopatologi. CD4+ T cellefenotyper i koloniske lamina propria bestemmes også. Denne modellen ligner på utviklingen av IBD, som gir en ideell murine modell for å undersøke mekanismene som driver patogenesen til IBD og tester de potensielle stoffene for behandling av IBD.

Omtrent 5 x 106 CBir1 TCR Tg-naϊve CD4+ T-celler per milt ble isolert fra en voksen CBir1 TCR Tg-mus. Overføring av CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-celler induserte kronisk kolitt hos mottaker Rag1-/- mus. Etter celleoverføring ble kliniske tegn overvåket for å evaluere progresjonen av tarmbetennelse, inkludert vekttap, avføringskonsistens og hakket holdning. Som forventet begynte mus å gå ned i vekt rundt tre uker etter celleoverføring, og vekten nådde rundt 80% ...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice at JoVE.com

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

I denne protokollen er en tarmmikrobiota antigenspesifikk T-celle adoptivoverførings kolittmodell beskrevet. CD4+ T-celler er isolert fra CBir1 TCR-transgene mus. Disse er spesifikke for en immunodominant tarmmikrobiota antigen CBir1 flagellin, som overføres til mottaker Rag1-/- mus, noe som fører til tarmbetennelse.

Induksjon av tarmbetennelse ved adoptivoverføring av CBir1 TCR transgene CD4+ T-celler til immunodeficient mus

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable ...

Inflammatorisk tarmsykdom, eller IBD, pålegger enkeltpersoner og samfunnet en betydelig helse- og økonomisk byrde. Denne kolittmodellen er nyttig for å studere mekanismene til IBD og evaluere behandlingene for IBD. Denne immunodominante Cbir flagellin T-celle-spesifikke adoptivoverføring kolitt modellen gir innsikt i hvordan tarmbakterier antigen induserer T-celle responser for å indusere kolitt.Etter euthanizing musen, lage en ca en centimeter venstre abdominal snitt og trekke huden bort fra bukmuskelen vev. Deretter gjør du et omtrent tre centimeter snitt i bukmuskelvevet. Deretter fjerner du milten med steril saks og tang.Legg milten i en kulturrett som inneholder fem milliliter forkjølet vaskebuffer. Slip milten med den grove overflaten av to sterile glasssklier. Overfør cellefjæringen til et 50 milliliter sentrifugerør ved å sende det gjennom en 100-mikrometer cellesil.Skyll glasssklier og kulturfat med fem milliliter forkjølt vaskebuffer, og overfør vaskebufferen inn i røret. Sentrifuger celleopphenget, kast supernatanten og resuspender cellene med fem milliliter forhåndsvarslet Tris ammoniumklorid lysisbuffer per milt. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur.Tilsett 10 milliliter forkjølt vaskebuffer til røret. Deretter sentrifugerer du celleopphenget, kaster bort supernatanten og bruker cellene på nytt med 10 milliliter forkjølt isolasjonsbuffer. For å telle cellene blander du 10 mikroliter hver cellefjæring og Trypan blå grundig, og laster 10 mikroliter på et lysbilde.Deretter setter du inn lysbildet i den automatiserte celletelleren for å hente det levedyktige cellenummeret. Sentrifuger den gjenværende cellefjæringen og kast alle supernatanter. Virvel anti-mus CD4 magnetiske partikler, direkte legge til 50 mikroliter av partiklene per 10 millioner celler, og bland med cellepellets grundig.Inkuber blandingen i 30 minutter ved fire grader Celsius. Overfør cellepartikkelfjæringen til et sterilt oppsamlingsrør. Tilsett 3,5 milliliter forkjølt isolasjonsbuffer i røret.Plasser røret på celleseparasjonsmagneten i åtte minutter ved romtemperatur. Deretter aspirerer du forsiktig av supernatanten med en tre milliliter overføring pipette. Fjern røret fra celleseparasjonsmagneten.Deretter bruker du cellene på nytt med 3,5 milliliter forkjølt isolasjonsbuffer og legger røret på magneten i fire minutter ved romtemperatur. Aspirer forsiktig supernatanten med en tre milliliter pipette. Til slutt, resuspend cellene i en milliliter av pre-avkjølt FACS buffer.For å overføre cellene til mottakermusene, resuspend Cbir1 TCR transgen-naive CD4-positive T-celler til 5 millioner celler per milliliter i 1x PBS. Varm musene under en varmelampe og hold musene fast ved hjelp av en musebeherskelse. Injiser intravenøst 200 mikroliter av cellefjæringen i musenes haleåre.Etter euthanizing musen, lage en ca en centimeter ventral midtlinje hud snitt. Trekk huden bort fra magemuskelvevet. Deretter gjør du et tre centimeter snitt i bukmuskelvevet.Deretter identifiserer du koecumet og fjerner hele tykktarmen med steril saks og tang. Fukt tykktarmen med forkjølt PBS i en kulturrett. Øk tykktarmen på langs, og skyll den med forkjølt PBS.Klipp 1/3 av tykktarmen langsgående. Plasser kolonstripen i et papirhåndkle med lumenalsiden vendt oppover. Utfør sveitsisk-rullende ved hjelp av en tannpirker.Plasser tykktarmen Swiss i en kassett, og legg kassetten i 10% bufret formalin i 24 timer. Dehydrer og parafin-bygg inn tykktarmen med en automatisert prosessor. Klipp deretter fem mikrometer vevsseksjoner på en mikrotom.Monter vevet på lysbilder og utfør hematoksylin og eosinfarging. Rag knockout-musene begynte å gå ned i vekt rundt tre uker etter celleoverføring, og vekten nådde rundt 80 til 85% av sin opprinnelige vekt seks uker etter celleoverføring. Mottakermus viste kort kolonlengde seks uker etter celleoverføring.Mottakermusene viste mer celleinfiltrasjon i tarm lamina propria fire uker etter celleoverføring. De viste begercelletap og intestinal epitelcellehyperplasi fem uker etter celleoverføring, samt slimhinneerosjon og inflammatorisk celleinfiltrasjon i submucosa i tykktarmen seks uker etter celleoverføring. De histopatologiske skårene økte betydelig fra fire til seks uker.Samtidig var det ingen betennelse i Rag knockout mus som fikk PBS alene. Ved hjelp av denne prosedyren kan koloniske cytokinnivåer bestemmes av ELISA og qPCR.

Research

JoVE Journal

Medicine

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Funksjonell Vurdering av intestinal motilitet og tarmveggen Betennelse i Gnagere: Analyser i en standardisert modell for Intestinal Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Neo-Islet Dannelse i leverskader av diabetiske mus med Helper-avhengig adenovirusvektor-mediert genoverføring

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

Generering av Subkutan og Intrahepatisk menneskeleverkreft xenografts i immunodeficient Mus

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Induksjon av Invasive Transitional Cell blære carcinoma in Immune Intakt Menneskelige MUC1 transgene mus: En modell for Immunterapi Development

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoskopi for<em&gt; In Vivo</em&gt; Multimodal Imaging av Carcinogenesis og vurdering av Intestinal sårheling og Betennelse

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Gallegang Ligation i Mus: Induksjon av inflammatorisk Leverskade og fibrose av obstruktiv Kolestase

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

Th17 Betennelse Modell av orofaryngeal candidiasis i immunodeficient Mus

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

Dry Powder and Nebulized Aerosol Inhalation of Pharmaceuticals Delivered to Mice Using a Nose-only Exposure System

Pulver og forstøvet Aerosol Innånding av Pharmaceuticals Levert til Mus Ved hjelp av en nese-bare Eksponeringssystem

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Fluorescens-mediert tomografi av kvantifisering av Macrophage-relaterte Murine intestinale betennelsen

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Induction of Nephrotic Syndrome in Mice by Retrobulbar Injection of Doxorubicin and Prevention of Volume Retention by Sustained Release Aprotinin

Induksjon av IELTS i mus Retrobulbar injeksjon av doksorubicin og forebygging av volum oppbevaring av vedvarende Release Aprotinin

Nephrotic syndrome is the most extreme manifestation of proteinuric kidney disease and characterized by heavy proteinuria, hypoalbuminemia, and edema due ...