Name: culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system
Uploaded: 2022-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

يتم دعم هذا العمل من قبل وكالة الفضاء الكندية (CSA) ، منحة بحثية (17ILSRA3 ، الملف المناعي). يود المؤلفون أن يشكروا وشكروا الدكتورة روكسان فورنييه (جامعة تورنتو) والدكتور راندال جريج (جامعة لينكولن التذكارية) وبريتيش ميلاباثولا (جامعة أريزونا) على مساعدتهم في استكشاف الأخطاء وإصلاحها الأولية لهذا البروتوكول.

ملاحظة: يجب إكمال الخطوات التالية داخل خزانة أمان بيولوجي معقمة.
1. إعداد الأوعية لزراعة الخلايا
<ol><li>أخرج أوعية الاستزراع من العبوة البلاستيكية. قم بتسمية كل وعاء على الحافة وفقا لنوع / خط الخلية المستخدم ، سواء كان التحكم (1G) أو العلاج (SMG) ، وأي معلومات أخرى ذات صلة...

<ol>
	<li>ElGindi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+the+force+be+with+you+(or+not):+the+immune+system+under+microgravity.">May the force be with you (or not): the immune system under microgravity.</a> Cells. 10 (8), 1941 (2021).</li><li>Chouk&#232;r, A., Ullrich, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+system+dysregulation+during+spaceflight:+potential+countermeasures+for+deep+space+exploration+missions.">Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Countermeasures-based+improvements+in+stress,+immune+system+dysregulation+and+latent+herpesvirus+reactivation+onboard+the+International+Space+Station+-+relevance+for+deep+space+missions+and+terrestrial+medicine.">Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine.</a> Neuroscience &amp; Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).</li><li>Herranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground-based+facilities+for+simulation+of+microgravity:+organism-specific+recommendations+for+their+use,+and+recommended+terminology.">Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology.</a> Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).</li><li>Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+current+microgravity+platforms+for+space+biology+research.">Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research.</a> Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).</li><li>Murphy, K., Weaver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Janeway's Immunobiology 9th Edition. , (2016).</li><li>Dedolph, R. R., Dipert, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+gravity+stimulus+nullification+by+clinostat+rotation.">The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation.</a> Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).</li><li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+suspension+culture:+the+rotating-wall+vessel.">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).</li><li>Crabb&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+proteomic+responses+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+to+spaceflight+conditions+involve+Hfq+regulation+and+reveal+a+role+for+oxygen.">Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).</li><li>Ulbrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+simulated+and+real+microgravity+on+bone+cells+and+mesenchymal+stem+cells.">The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells.</a> BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).</li><li>Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+and+simulated+microgravity+cause+a+significant+reduction+of+key+gene+expression+in+early+T-cell+activation.">Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).</li><li>Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+cell+line+(NK-92)+with+phenotypical+and+functional+characteristics+of+activated+natural+killer+cells.">Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.</a> Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).</li><li>Williams, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+NK-92+cells+for+refractory+hematological+malignancies+relapsing+after+autologous+hematopoietic+cell.">A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell.</a> Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).</li><li>Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol">https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol</a> (2022)</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2022)</li><li>Mylabathula, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+disarms+human+NK-cells+and+inhibits+anti-tumor+cytotoxicity+in+vitro.">Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro.</a> Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+simulated+microgravity+on+primary+human+NK+cells.">Effects of simulated microgravity on primary human NK cells.</a> Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).</li><li>Shao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+effect+of+simulated+microgravity+on+the+cytotoxicity+of+NK+cells+following+the+DNA+methylation+of+NKG2D+and+the+expression+of+DAP10.">Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10.</a> Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).</li><li>Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+attachment-independent+biofilm+formation+and+repression+of+hfq+expression+by+low-fluid-shear+culture+of+Staphylococcus+aureus.">Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).</li><li>Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air+bubble-isolating+rotating+wall+vessel+bioreactor+for+improved+spheroid/organoid+formation.">An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).</li></ol>

بينما تستعد البشرية لبعثات فضائية أطول إلى القمر والمريخ ، يجب إجراء المزيد من الأبحاث للتخفيف من المخاطر الصحية الخطيرة على رواد الفضاء. ومن الجوانب الرئيسية للبيئة الفضائية التي تؤثر على فسيولوجيا الإنسان الجاذبية الصغرى. هنا ، تم وصف طريقة زراعة الخلايا لإخضاع الخلايا الليمفاوية لرش?...

لقد ثبت أن رحلات الفضاء تؤثر على العديد من جوانب علم وظائف الأعضاء البشرية ، بما في ذلك جهاز المناعة. أظهرت العديد من الدراسات أدلة على عدم التنظيم المناعي نتيجة لرحلات الفضاء في الجسم الحي والتعرض لمحاكاة الجاذبية الصغرى (SMG) في المختبر1،2،3،4. ومن الجوانب الرئيسية للبيئة الفضائية التي تؤثر على فسيولوجيا الإنسان الجاذبية الصغرى. تشير الجاذبية الصغرى إلى "انعدام الوزن" الذي يحدث بسبب قوى الجاذبية المنخفضة في بيئة الفضاء5. بينما تستعد البشرية لبعثات فضائية أطول إلى القمر والمريخ ، يجب إجراء المزيد من الأبحاث للتخفيف من المخاطر الصحية الخطيرة على رواد الفضاء.
ويمكن تحقيق ظروف الجاذبية الصغرى الحقيقية للبحث العلمي في الفضاء على متن محطة الفضاء الدولية (ISS) أو في السواتل النانوية التي تطلق في المدار؛ ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه الخيارات مكلفة للغاية ومعقدة للتنسيق. بالنظر إلى القيود الحالية لإجراء البحوث البيولوجية في الفضاء ، توجد عدة خيارات لإحداث جاذبية صغيرة حقيقية و SMG على الأرض. توجد عمليات واسعة النطاق يمكن أن تنتج فترات قصيرة من الجاذبية الصغرى الحقيقية على الأرض ، بما في ذلك أبراج الإسقاط ، والطيران المكافئ ، وصواريخ السبر. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق ليست مناسبة بشكل مفرط لدراسة آثار الجاذبية الصغرى على النظم البيولوجية ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى فترات قصيرة من معالجة الجاذبية الصغرى (أي ثوان إلى 20 دقيقة). تتم مناقشة هذه الأساليب بمزيد من التفصيل في مكان آخر 5,6. تشمل الخيارات المناسبة لزراعة الخلايا البيولوجية الأجهزة الصغيرة الحجم مثل 2D clinostats أو أجهزة وعاء الجدار الدوار (RWV) و clinostats 3D أو آلات تحديد المواقع العشوائية (RPM). يمكن إعداد هذه الأجهزة داخل حاضنات زراعة الخلايا التي يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، وتقوم بتدوير ثقافة الخلية إما على محور أفقي (2D) أو على محورين عموديين (3D) 5. ومع ذلك ، من المهم التأكيد على أن طرق الاستزراع هذه تنتج رشاشات صغيرة بدلا من الجاذبية الصغرى الحقيقية ، والتي يتم تحقيقها بشكل عملي في الفضاء لسياقات البحث البيولوجي.
الهدف من الورقة الحالية هو تحديد خطوات إخضاع الخلايا الليمفاوية ل SMG باستخدام جهاز RWV المتاح تجاريا (جدول المواد) ، والذي يندرج تحت تصنيف clinostat 2D. على الرغم من وجود بروتوكول عام متاح من الشركة المصنعة لتشغيل هذا الجهاز ، تهدف المقالة الحالية إلى تغطية خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتحسين بمزيد من التفصيل. تغطي هذه المقالة أيضا النظرية الكامنة وراء كيفية عمل هذا الجهاز لإنتاج SMG في ثقافة الخلايا المعلقة ، وتحديدا مع الخلايا الليمفاوية. في هذا السياق ، تشير زراعة الخلايا المعلقة إلى الخلايا التي تنمو بحرية في وسائط الاستزراع التكميلية ، دون الالتزام بأي سقالات إضافية. تزرع العديد من أنواع الخلايا في زراعة الخلايا المعلقة ، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية. الخلايا الليمفاوية هي خلايا الجهاز المناعي ، بما في ذلك الخلايا التائية والبائية والقاتلة الطبيعية (NK) ، الموجودة في الأعضاء اللمفاوية ومجرى الدم7.
يعمل كلينستات RWV 2D الموصوف هنا على مبدأ إبطال متجه الجاذبية متوسط الوقت5،6،8،9 ، حيث يتم اختيار متجه الجاذبية بشكل عشوائي من خلال دوران ثقافة الخلية على محور أفقي. يتم تحقيق ذلك من خلال مطابقة سرعة دوران وعاء الاستزراع مع سرعة ترسيب الخلايا. وطالما أن سرعة دوران وعاء الاستزراع تتطابق بشكل جيد مع سرعة ترسيب الخلايا، فإن الخلايا تظل في حالة سقوط حر وغير قادرة على الترسب، كما حدث في بيئة الفضاء. بعد مرحلة التسريع الأولية ، تصل الوسائط في وعاء الاستزراع في النهاية إلى "دوران الجسم الصلب" بمرور الوقت. يحفز هذا الدوران الأفقي أيضا التدفق الصفحي في وعاء زراعة الخلايا. هذا يخلق بيئة "قص منخفضة" ، بالنظر إلى أن إجهاد القص الناجم عن الخلايا عن طريق التدفق الصفحي أقل بكثير من التدفق المضطرب. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن clinostat ليس نظاما مثاليا ، فهناك بعض حركات السوائل الصفائحية الصغيرة التي يتم إدخالها ، والتي تسبب الحد الأدنى من إجهاد القص على الخلايا. على هذا النحو ، يتم سحب الخلايا المعلقة في الوسائط بواسطة هذا التدفق أثناء الدوران. أثناء الدوران الأفقي، يؤثر متجه الجاذبية على الخلايا ويضعها في مسار متذبذب، كما هو موضح في الشكل 1. مصدر صغير آخر لإجهاد القص ناتج عن "سقوط" الخلايا عبر الوسائط ، مما يتسبب في تدفق رقائقي حول الخلايا. عندما يدور وعاء الاستزراع على محور أفقي ، يدور ناقل الجاذبية الذي تتعرض له الخلايا أيضا. بمرور الوقت ، يقترب متوسط ناقل الجاذبية الدوار هذا من الصفر. تسمى هذه الظاهرة إبطال ناقل الجاذبية المتوسط الزمني وتؤدي إلى حالة SMG5،6،8،9. تم استخدام هذا الجهاز لدراسة آثار SMG على العديد من أنواع الخلايا ، والتي يتم تغطية بعضها في المراجع10،11،12. يمكن العثور على المزيد من الأمثلة على موقع الشركة المصنعة للجهاز.
يستخدم جهاز RWV هذا "أوعية ذات نسبة عرض إلى ارتفاع عالية" (HARVs) متخصصة متوفرة من خلال الشركة المصنعة للجهاز. تحتوي هذه HARVs على 10 مل من زراعة الخلايا لكل منها. ومع ذلك ، تتوفر أيضا 50 مل من HARVs. يمكن استخدام 10 مل أو 50 مل HARVs اعتمادا على عدد الخلايا اللازمة لإكمال أي فحوصات تجريبية نهائية ، والتي تم توضيحها بمزيد من التفصيل في قسم المناقشة. تصنع HARVs من البولي كربونات وتشمل غشاء أكسجة السيليكون للسماح بتبادل الغازات أثناء زراعة الخلايا. وهذا يحافظ على الأس الهيدروجيني للوسائط الخلوية ويسمح بالتنفس الخلوي بكفاءة. يوجد منفذ تعبئة رئيسي ومنفذي حقنة مغطاة على وجه الوعاء (الشكل 2 أ). بعد تحميل مزرعة الخلية من خلال منفذ التعبئة الرئيسي ، يتم تحميل حقنتين على الوعاء للمساعدة في إزالة الفقاعة. عند استخدام الأوعية سعة 10 مل ، تعمل حقنتان سعة 3 مل بشكل جيد. يتم توصيل حقنة واحدة بالجهاز فارغة ، مع الضغط التام على المحقنة ، والأخرى متصلة مملوءة ب 3 مل من زراعة الخلايا (الشكل 2E). يتم استخدامها معا لإزالة الفقاعات من الوعاء ، وهو أمر مهم للحفاظ على علاج SMG. بشكل عام ، ينصح بإعداد عنصري تحكم سلبيين ، يمكن الإشارة إليهما باسم عنصر التحكم "Flask" وعنصر التحكم "1G". يتوافق عنصر التحكم "القارورة" مع الخلايا التي تزرع في قارورة ثقافة الخلايا المعلقة T25 القياسية. يتوافق عنصر التحكم 1G مع الخلايا التي تزرع في وعاء الاستزراع المتخصص سعة 10 مل ، والذي يتم وضعه ببساطة في الحاضنة (أي دون التعرض لعلاج SMG). يرجى الاطلاع على قسم المناقشة للحصول على مزيد من التفاصيل حول عناصر التحكم.
الطريقة الموصوفة هنا مناسبة لأي باحث يتطلع إلى دراسة آثار SMG على الخلايا الليمفاوية ، مع التركيز بشكل خاص على الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام خط الخلية NK9213. قد تساعدنا نتائج هذه الدراسات على فهم أفضل وتخفيف الآثار الضارة لرحلات الفضاء على جهاز المناعة البشري.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>D-410</td>
			<td>Gamma sterilized culture vessels (4/box)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok tip syringes (3 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>For attaching to the 10 mL HARVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92 Cell-line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4D</td>
			<td>Rotating wall vessel device; 2D clinostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 suspension culture flasks</td>
			<td>Sarsedt</td>
			<td>83.3910.502</td>
			<td>For flask control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system

بالنظر إلى القيود الحالية لإجراء البحوث البيولوجية في الفضاء ، توجد بعض الخيارات لإخضاع زراعة الخلايا لمحاكاة الجاذبية الصغرى (SMG) على الأرض. تختلف هذه الخيارات في أساليبها ومبادئها ومدى ملاءمتها للاستخدام مع مزرعة الخلايا المعلقة. هنا ، يتم وصف طريقة زراعة الخلايا لإخضاع الخلايا الليمفاوية لمحاكاة الجاذبية الصغرى باستخدام نظام زراعة الخلايا الدوارة المتاح تجاريا ، والمعروف أيضا باسم clinostat 2D أو جهاز وعاء الجدار الدوار (RWV). تستخدم طريقة زراعة الخلايا هذه مبدأ إبطال ناقل الجاذبية المتوسط زمنيا لمحاكاة الجاذبية الصغرى عن طريق تدوير الخلايا على محور أفقي. يمكن حصاد الخلايا المستزرعة في هذا النظام واستخدامها في العديد من المقايسات التجريبية المختلفة لتقييم آثار محاكاة الجاذبية الصغرى على الوظيفة الخلوية وعلم وظائف الأعضاء. قد تختلف تقنية الاستزراع قليلا اعتمادا على نوع الخلية أو الخط المستخدم ، ولكن يمكن تطبيق الطريقة الموضحة هنا على أي مزرعة خلية من نوع التعليق.

تعتبر طريقة الاستزراع هذه ناجحة إذا 1) كان تكاثر الخلايا متسقا تقريبا عبر المجموعات الضابطة (ومن الناحية المثالية جميع المجموعات التجريبية) ، 2) كان الانتشار مناسبا نظرا لكثافة البذر وطول المعالجة ووقت مضاعفة نوع / خط الخلية ، و 3) كانت صلاحية الخلايا المحصودة 85٪ أو أعلى (الجدول 1 ). م...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System

هذا دليل خطوة بخطوة لاستخدام نظام زراعة الخلايا الدوارة المتاح تجاريا لزرع الخلايا الليمفاوية في محاكاة الجاذبية الصغرى باستخدام أوعية استزراع متخصصة يمكن التخلص منها. يمكن تطبيق طريقة الاستزراع هذه على أي مزرعة خلايا من نوع التعليق.

زراعة الخلايا الليمفاوية في محاكاة الجاذبية الصغرى باستخدام نظام زراعة الخلايا الدوارة

Given the current limitations of conducting biological research in space, a few options exist for subjecting cell culture to simulated microgravity (SMG) ...

تسمح لنا هذه التقنية بدراسة آثار محاكاة الجاذبية الصغرى على الخلايا المناعية لمساعدتنا على فهم أفضل لكيفية تأثير جوانب البيئة الفضائية على فسيولوجيا الإنسان على المستوى الجزيئي. هذه التقنية مجدية اقتصاديا وسهلة الإعداد والصيانة نسبيا مقارنة بإرسال مزرعة الخلايا إلى الفضاء أو طرق أخرى لإخضاع زراعة الخلايا لمحاكاة الجاذبية الصغرى على الأرض. يوصى بالسير ببطء أثناء ملء الأوعية لتجنب الفائض والانسكاب.بعد إزالة الفقاعة الأولية ، تأكد من امتلاء الأوعية تماما باستخدام المحاقن. هذا سوف يقلل من فرص تشكيل فقاعة كبيرة طوال فترة العلاج. ابدأ بإخراج أوعية الاستزراع من العبوة البلاستيكية.قم بتسمية كل وعاء على الحافة وفقا لنوع الخلية أو الخط المستخدم سواء كان في التحكم أو العلاج وأي معلومات أخرى ذات صلة. قم بتثبيت الوعاء وافتح منفذ التعبئة بعناية دون لمس ربط غطاء منفذ التعبئة أو الحلقة O. ضع الغطاء على وسادة الإيثانول بحيث يكون الوتد أو الحلقة O متجهة لأعلى أثناء ملء الوعاء.لا تقم بإزالة الأغطية من منافذ الحقن. قم بتحميل الوعاء ب 10 مل من الوسائط الكاملة المناسبة لثقافة الخلية باستخدام ماصة مصلية معقمة ، وضع الغطاء بعناية على منفذ التعبئة. تأكد من إغلاق أغطية منافذ الحقن ومنفذ التعبئة بإحكام.بعد ذلك ، ضع الأوعية المملوءة في حاضنة أثناء تنفيذ الخطوات اللاحقة لتجهيز الأوعية لزراعة الخلايا. استرجاع الأوعية المعدة للوسائط من الحاضنة. للتحكم في القارورة ، قم بتحميل دورق ثقافة التعليق T25 ب 10 مل من زراعة الخلايا من المخزون المحضر أعلاه.أضف 10 مل من زراعة خلايا المخزون إلى أنبوب مخروطي منفصل سعة 15 مل ، والذي سيتم استخدامه لتحميل المحاقن. قم بفك أغطية منفذ المحقنة لإزالتها من السفينة وتأكد من أن محبس المخزون في وضع الفتح. قم بتثبيت الوعاء وافتح منفذ التعبئة بعناية دون لمس ربط غطاء منفذ التعبئة أو الحلقة O.ضع الغطاء على وسادة الإيثانول بحيث يكون الوتد أو الحلقة O متجهة لأعلى أثناء ملء الوعاء. تأكد من أن المحبس في وضع الفتح. يمكن تفريغ الوعاء عن طريق سكب الوسائط من الوعاء في حاوية نفايات باستخدام ماصة مصلية.بدلا من ذلك ، قم بشفط الوسائط باستخدام زجاج معقم بعد الماصة المتصلة بنظام التفريغ. أثناء استخدام ماصة أو نظام التفريغ ، تأكد من عدم لمس غشاء الأوكسجين لأن ذلك قد يؤدي إلى إتلافه وجعل الوعاء غير قابل للاستخدام. أغلق بإحكام الأنبوب المخروطي سعة 50 مل الذي يحتوي على مزرعة خلايا المخزون المحضرة واقلبه برفق عدة مرات لخلط المحتويات جيدا.ارسم 10 مل من مخزون زراعة الخلايا من أنبوب 50 مل باستخدام ماصة مصلية معقمة جديدة. التقط الوعاء وقم بإمالته ، بحيث يكون منفذ التعبئة باتجاه الأعلى. ثم قم بتوزيع مخزون زراعة الخلايا بعناية في الوعاء من خلال منفذ التعبئة.املأ الوعاء مباشرة إلى طرف منفذ التعبئة ، مع إمالة الوعاء لأسفل لتجنب الانسكاب. احرص على عدم لمس غشاء الأوكسجين بالماصة لأنه هش للغاية. بمجرد تحميل السفينة ، ضع غطاء منفذ التعبئة بعناية مرة أخرى دون لمس الحلقة O.قم بإزالة أول حقنة سعة 3 مل من عبوتها وضخها عدة مرات لفكها. ثم قم بتوصيل المحقنة بأحد منافذ الحقن ، مع التأكد من أن المحقنة مكتئبة تماما. أغلق بإحكام الأنبوب المخروطي سعة 15 مل الذي يحتوي على 10 مل من مزرعة خلايا القسمة ، واقلبه برفق عدة مرات لخلط المحتويات جيدا.وبالمثل ، قم بإزالة المحقنة الثانية سعة 3 مل من عبوتها وضخها عدة مرات. ثم شبه مغمورة بعناية هذه الحقنة في ثقافة الخلية من أنبوب مخروطي 15 مل ورسم بعض الثقافة. قلل من فقاعات الهواء عن طريق توزيع المحقنة بالكامل في الأنبوب وسحب 3 مل من الثقافة.قم بتوصيل المحقنة المملوءة بمنفذ الحقنة المتبقي ، وقم بتعقيم المحاقن بعناية وحول منفذ التعبئة باستخدام وسادة الإيثانول. لا تحصل على الإيثانول على غشاء الأكسجين. كرر العملية للأوعية المتبقية.إذا لم يتبق سوى القليل من زراعة الخلايا في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل للوعاء الأخير، فاسترجع الكمية المتبقية من الأنبوب المخروطي سعة 15 مل المستخدم لتحميل المحاقن. تأكد من إغلاق محبس منفذ المحاقن للحد من هجرة الخلايا والفقاعات من المحاقن إلى الأوعية. اقلب الوعاء رأسا على عقب واضربه جانبا عدة مرات لجمع الفقاعات الأولية.اقلب الوعاء بسرعة للخلف ليواجه لأعلى ، ثم بزاوية طفيفة متجهة بعيدا ، بحيث تطفو جميع الفقاعات إلى الجانب العلوي من الوعاء. قم بمناورة الفقاعات الموجودة أسفل المنفذ باستخدام المحقنة الفارغة ، وشاهدها تبدأ في الدخول إلى المنفذ. افتح كلا من محبس منفذ الحقنة.اضرب الوعاء برفق لتشجيع الفقاعات على الطفو في المحقنة الفارغة. تمتص ببطء الفقاعات الكبيرة باستخدام المحقنة الفارغة مع الضغط بعناية على المحقنة الكاملة للحفاظ على الضغط في الوعاء ، حتى لا ينفجر غشاء الأكسجين. كرر هذه العملية عدة مرات لضمان إزالة جميع الفقاعات.عندما تتم إزالة الفقاعات بشكل فعال ، أغلق محبس منفذ المحقنة. حافظ على تشغيل المحاقن أثناء العلاج للسماح بإزالة الفقاعات اللاحقة ، مع التأكد من أن الحجم في كلتا الحقنتين متساو تقريبا. امسح بعناية سطح القاعدة الدوارة وكابل الشريط باستخدام 70٪ إيثانول.تأكد من توصيل كبل الشريط بمصدر الطاقة. ضع القاعدة الدوارة في الحاضنة ، وقم بتوصيل كابل الشريط بالقاعدة. ضع مصدر الطاقة بالقرب من الحاضنة ، ولكن خارجها.قم بتوصيل وعاء معالجة SMG عن طريق اصطفاف خيوط الوعاء بالوتد الدوار وتدوير الوتد الدوار برفق على القاعدة عكس اتجاه عقارب الساعة. تأكد من توصيل السفينة بإحكام. الحفاظ على الحاضنة في حوالي 100٪ الرطوبة عن طريق ملء صينية المياه مع الأوتوكلاف RO المياه.اضبط سرعة دوران الحاضنة لتتناسب مع سرعة ترسيب الخلايا ، بحيث لا تسقط الخلايا عبر الوسائط. في اليوم الأول من إعداد العلاج ، تحقق من تكوين الفقاعات كل بضع ساعات كما هو موضح في المخطوطة النصية. قم بإزالة الفقاعات مرة واحدة على الأقل يوميا للمضي قدما حتى نهاية مدة العلاج المطلوبة.بمجرد انقضاء طول العلاج المخطط ، أوقف الدوران وفك الجهاز. قم بإزالة وعاء المعالجة عن طريق تثبيت الوعاء برفق أثناء تدوير الوتد الدوار للجهاز في اتجاه عقارب الساعة. أحضر دورق التحكم والتحكم والوعاء المعالج إلى خزانة أمان بيولوجي معقمة.خذ كل وعاء باستثناء قارورة التحكم واقلبه ، بحيث يواجه لأسفل. ثم اضربه برفق لتعليق جميع الخلايا. ثم أدر الوعاء على جانبه مع منفذ التعبئة نحو الأسفل ، واضربه مرة أخرى لتوجيه الخلايا نحو منفذ التعبئة من أجل الشفط الفعال.تعامل مع كل سفينة على حدة. قم بفك المحاقن من المنفذين وتوزيعها في النفايات البيولوجية. افتح محبس على منافذ الحقن.قم بإزالة غطاء منفذ التعبئة بعناية وارسم المحتويات باستخدام ماصة مصلية معقمة سعة 10 مل ، مع إمالة الوعاء أثناء إفراغه. قم بتوزيع محتويات جميع مجموعات التحكم والعلاج في أنابيب مخروطية سعة 15 مل تحمل علامات فردية. أغلق كل أنبوب واقلبه برفق عدة مرات للتأكد من خلطه بشكل صحيح.استخدم الطريقة المفضلة لتحديد تركيز وصلاحية ثقافة الخلية الناتجة للتحضير للمقايسات التجريبية اللاحقة. تمت مقارنة صلاحية بدء خط الخلايا NK-92 وكثافات الجلوس بقابلية البقاء النهائية والتركيزات النهائية الناتجة. بعد علاج رشاش الرشاش لمدة 72 ساعة ، تمت مقارنة حالتين من النتائج السلبية والإيجابية.وعلى سبيل المقارنة، كان نطاق التركيز الأمثل لخط خلايا NK-92 المستخدم يتراوح بين 0.3 إلى 1.2 مليون خلية لكل ملليلتر مع وقت مضاعفة يبلغ حوالي يومين إلى ثلاثة أيام. كان الانتشار في مجموعة علاج SMG متساويا تقريبا عبر مجموعات التحكم والعلاج. كانت هذه المعلمات ضرورية للنجاح التجريبي في المراحل النهائية والخلايا الناتجة من المجموعتين الضابطتين كان أداؤها مشابها في المقايسات التجريبية النهائية.من الأهمية بمكان مراقبة وحساب تكوين الفقاعات طوال فترة العلاج ، خاصة في مزرعة الخلايا التي تتعرض لمحاكاة الجاذبية الصغرى. يمكن أن يتسبب تكوين الفقاعات الكبيرة في تعطيل ديناميكيات السوائل داخل الوعاء ، وهذا سينفي بشكل أساسي حالة الجاذبية الصغرى المحاكاة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

والثقافة الخلية العصبية الأولية نظام لدراسة فيروس العقبول البسيط الكمون وإعادة تنشيط

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

الخلايا الدبقية الصغيرة زراعة من الجهاز العصبي المركزي حديثي الولادة والكبار

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

العزلة والتمايز TH17 من السذاجة CD4 T الخلايا اللمفاوية

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

تقييم الفطرية الاستشعار من HIV-1 CD4 المصابة<sup&gt; +</sup&gt; T الخلايا عن طريق الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; المشارك ثقافة النظام.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

التصور من الخلايا اللمفاوية معربا-22-IL عن طريق الفئران مراسل

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

إنتشار الجزيئي في أغشية البلازما الخلايا اللمفاوية الابتدائية تقاس الإسفار الارتباط الطيفي

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

زيكا الفيروسات نظام المعدية خلية الثقافة و<em&gt; في المختبر</em&gt; وقائية تأثير الانترفيرونات

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

الكمي السريع لمأرمي يسببها Mitogen في اللمفاويات التائية لتحديد الأدوية المناعية

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس صغيرة المعوية المناعي

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...