Name: culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system
Uploaded: 2022-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

Dette arbejde er støttet af Canadian Space Agency (CSA), forskningsbevilling (17ILSRA3, Immuno Profile). Forfattere vil gerne anerkende og takke Dr. Roxanne Fournier (University of Toronto), Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial University) og Preteesh Mylabathula (University of Arizona) for deres hjælp med den indledende fejlfinding af denne protokol.

BEMÆRK: Følgende trin skal udføres inde i et sterilt biologisk sikkerhedsskab.
1. Forberedelse af skibe til cellekultur
<ol><li>Tag kulturbeholderne ud af plastemballagen. Mærk hvert fartøj på kanten i henhold til hvilken celletype/linje der bruges, om det er kontrol (1G) eller behandling (SMG) og andre relevante oplysninger.</li>
	<li>Stabiliser beholderen, og åbn påfyldningsporten forsigtigt uden at røre ved påfyldningsportens hættepløk/O-ring. Placer hætten p...

<ol>
	<li>ElGindi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+the+force+be+with+you+(or+not):+the+immune+system+under+microgravity.">May the force be with you (or not): the immune system under microgravity.</a> Cells. 10 (8), 1941 (2021).</li><li>Chouk&#232;r, A., Ullrich, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+system+dysregulation+during+spaceflight:+potential+countermeasures+for+deep+space+exploration+missions.">Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Countermeasures-based+improvements+in+stress,+immune+system+dysregulation+and+latent+herpesvirus+reactivation+onboard+the+International+Space+Station+-+relevance+for+deep+space+missions+and+terrestrial+medicine.">Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine.</a> Neuroscience &amp; Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).</li><li>Herranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground-based+facilities+for+simulation+of+microgravity:+organism-specific+recommendations+for+their+use,+and+recommended+terminology.">Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology.</a> Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).</li><li>Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+current+microgravity+platforms+for+space+biology+research.">Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research.</a> Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).</li><li>Murphy, K., Weaver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Janeway's Immunobiology 9th Edition. , (2016).</li><li>Dedolph, R. R., Dipert, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+gravity+stimulus+nullification+by+clinostat+rotation.">The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation.</a> Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).</li><li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+suspension+culture:+the+rotating-wall+vessel.">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).</li><li>Crabb&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+proteomic+responses+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+to+spaceflight+conditions+involve+Hfq+regulation+and+reveal+a+role+for+oxygen.">Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).</li><li>Ulbrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+simulated+and+real+microgravity+on+bone+cells+and+mesenchymal+stem+cells.">The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells.</a> BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).</li><li>Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+and+simulated+microgravity+cause+a+significant+reduction+of+key+gene+expression+in+early+T-cell+activation.">Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).</li><li>Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+cell+line+(NK-92)+with+phenotypical+and+functional+characteristics+of+activated+natural+killer+cells.">Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.</a> Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).</li><li>Williams, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+NK-92+cells+for+refractory+hematological+malignancies+relapsing+after+autologous+hematopoietic+cell.">A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell.</a> Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).</li><li>Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol">https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol</a> (2022)</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2022)</li><li>Mylabathula, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+disarms+human+NK-cells+and+inhibits+anti-tumor+cytotoxicity+in+vitro.">Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro.</a> Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+simulated+microgravity+on+primary+human+NK+cells.">Effects of simulated microgravity on primary human NK cells.</a> Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).</li><li>Shao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+effect+of+simulated+microgravity+on+the+cytotoxicity+of+NK+cells+following+the+DNA+methylation+of+NKG2D+and+the+expression+of+DAP10.">Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10.</a> Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).</li><li>Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+attachment-independent+biofilm+formation+and+repression+of+hfq+expression+by+low-fluid-shear+culture+of+Staphylococcus+aureus.">Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).</li><li>Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air+bubble-isolating+rotating+wall+vessel+bioreactor+for+improved+spheroid/organoid+formation.">An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).</li></ol>

Da menneskeheden forbereder sig på længere rummissioner til Månen og Mars, skal der udføres mere forskning for at afbøde alvorlige sundhedsrisici hos astronauter. Et vigtigt aspekt af rummiljøet, der påvirker menneskelig fysiologi, er mikrogravity. Her er der beskrevet en cellekulturmetode til at udsætte lymfocytter for SMG ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt roterende cellekultursystem.
Denne protokol indeholder et par kritiske trin, der muligvis skal optimeres afhængigt af de...

Rumflyvning har vist sig at påvirke mange aspekter af menneskelig fysiologi, herunder immunsystemet. Mange undersøgelser har vist tegn på immundysregulering som følge af rumflyvning in vivo og eksponering for simuleret mikrogravitation (SMG) in vitro 1,2,3,4. Et vigtigt aspekt af rummiljøet, der påvirker menneskelig fysiologi, er mikrogravity. Mikrogravitation refererer til den "vægtløshed", der opleves på grund af lave tyngdekræfter i rummiljøet5. Da menneskeheden forbereder sig på længere rummissioner til Månen og Mars, skal der udføres mere forskning for at afbøde alvorlige sundhedsrisici hos astronauter.
Der kan opnås reelle betingelser for mikrotyngdekraft for videnskabelig forskning i rummet ombord på Den Internationale Rumstation (ISS) eller i nanosatellitter, der sendes i kredsløb; Disse muligheder kan dog være utroligt dyre og komplekse at orkestrere. I betragtning af de nuværende begrænsninger ved at udføre biologisk forskning i rummet findes der flere muligheder for at fremkalde reel mikrogravitation og SMG på Jorden. Der findes store operationer, der kan producere korte perioder med reel mikrogravitation på Jorden, herunder droptårne, parabolflyvning og lydende raketter. Disse metoder er imidlertid ikke alt for egnede til at studere virkningerne af mikrogravitation på biologiske systemer, hovedsageligt på grund af deres korte perioder med mikrogravitybehandling (dvs. sekunder til 20 minutter). Disse metoder behandles mere detaljeret andetsteds 5,6. Valgmuligheder, der er egnede til biologisk cellekultur, omfatter små enheder såsom 2D-klinostater eller roterende vægbeholder (RWV) enheder og 3D-klinostater eller tilfældige positioneringsmaskiner (RPM). Disse enheder kan opstilles inde i cellekulturinkubatorer, der opretholdes ved 37 °C og 5% CO2, og de roterer cellekulturen enten på en vandret akse (2D) eller på to vinkelrette akser (3D)5. Det er dog vigtigt at understrege, at disse dyrkningsmetoder producerer SMG i modsætning til reel mikrogravitation, som mest gennemførligt opnås i rum til biologiske forskningssammenhænge.
Målet med det nuværende papir er at skitsere trinene til at udsætte lymfocytter for SMG ved hjælp af en kommercielt tilgængelig RWV-enhed (materialetabel), der falder ind under 2D-clinostatklassifikationen. Selvom der er en generel protokol tilgængelig fra producenten til betjening af denne enhed, har den aktuelle artikel til formål at dække fejlfindings- og optimeringstrinnene mere detaljeret. Denne artikel dækker også teorien bag, hvordan denne enhed fungerer til at producere SMG i suspensionscellekultur, specifikt med lymfocytter. I denne sammenhæng henviser suspensionscellekultur til celler, der vokser frit i supplerede kulturmedier uden at klæbe til yderligere stilladser. Mange celletyper dyrkes i suspensionscellekultur, herunder lymfocytter. Lymfocytter er celler i immunsystemet, herunder T, B og Natural Killer (NK) celler, der befinder sig i lymfoide organer og blodbanen7.
RWV 2D clinostaten beskrevet her fungerer på princippet om tidsgennemsnitlig gravitationsvektor nullificering 5,6,8,9, hvorved tyngdekraftsvektoren randomiseres gennem rotation af cellekulturen på en vandret akse. Dette opnås ved at matche kulturbeholderens rotationshastighed med cellernes sedimentationshastighed. Så længe kulturbeholderens rotationshastighed er godt tilpasset cellernes sedimentationshastighed, opretholdes cellerne i frit fald og er ude af stand til at sedimentere, som det opleves i rummiljøet. Efter en indledende hastighedsfase når mediet i kulturbeholderen til sidst "solid kropsrotation" over tid. Denne vandrette rotation inducerer også laminær strømning i cellekulturbeholderen. Dette skaber et "lavt forskydningsmiljø", da forskydningsspændingen induceret på cellerne af laminær strømning er meget mindre end den turbulente strømning. Men da clinostaten ikke er et perfekt system, introduceres der nogle små, laminære væskebevægelser, som påfører cellerne minimal forskydningsbelastning. Som sådan trækkes cellerne, der er suspenderet i mediet, med af denne strøm under rotation. Under vandret rotation virker tyngdekraftsvektoren på cellerne og bringer dem ind i en oscillerende bane, som visualiseret i figur 1. En anden lille kilde til forskydningsstress er forårsaget af, at cellerne "falder" gennem medierne, hvilket forårsager laminær strømning omkring cellerne. Når kulturbeholderen roterer på en vandret akse, roterer tyngdekraftsvektoren, som cellerne oplever, også. Over tid nærmer denne roterende tyngdekraftsvektor sig i gennemsnit nul; dette fænomen kaldes tidsgennemsnitlig gravitationsvektor nullificering og inducerer en tilstand af SMG 5,6,8,9. Denne enhed er blevet brugt til at studere virkningerne af SMG på mange typer celler, hvoraf nogle er dækket af referencer10,11,12. Du kan finde flere eksempler på enhedsproducentens websted.
Denne RWV-enhed bruger specialiserede "high aspect ratio vessels" (HARVs), der er tilgængelige via enhedsproducenten. Disse HARV'er indeholder 10 ml cellekultur hver; dog er 50 ml HARV'er også tilgængelige. Enten 10 ml eller 50 ml HARV'er kan bruges afhængigt af hvor mange celler der er nødvendige for at fuldføre eventuelle downstream eksperimentelle assays, som er skitseret yderligere i diskussionsafsnittet. HARV'erne er lavet af polycarbonat og inkluderer en silikoneoxygeneringsmembran for at muliggøre gasudveksling under cellekultur. Dette opretholder cellemediets pH og giver mulighed for effektiv cellulær respiration. Der er en hovedpåfyldningsport og to sprøjteporte med låg på beholderens overflade (figur 2A). Efter lastning af cellekulturen gennem hovedpåfyldningsporten lægges to sprøjter på beholderen for at hjælpe med fjernelse af bobler. Når du bruger beholderne på 10 ml, fungerer to 3 ml sprøjter godt. Den ene sprøjte er fastgjort til enheden tom, med sprøjten helt trykket ned, og den anden er fastgjort fyldt med 3 ml cellekultur (figur 2E). Disse bruges i kombination til at fjerne bobler fra beholderen, hvilket er vigtigt for at opretholde SMG-behandlingen. Generelt anbefales det at oprette to negative kontroller, der kan betegnes som "Flask" -kontrollen og "1G" -kontrollen. "Kolbekontrollen" svarer til celler, der dyrkes i en standard T25-suspensionscellekulturkolbe. 1G-kontrollen svarer til celler, der dyrkes i den specialiserede 10 ml kulturbeholder, som simpelthen placeres i inkubatoren (dvs. uden at blive udsat for SMG-behandlingen). Se afsnittet Diskussion for at få flere oplysninger om kontrolelementer.
Metoden beskrevet her er passende for enhver forsker, der ønsker at studere virkningerne af SMG på lymfocytter, med et specifikt fokus på NK-celler ved hjælp af NK92-cellelinje13. Resultaterne fra disse undersøgelser kan hjælpe os med bedre at forstå og afbøde de negative virkninger af rumflyvning på det menneskelige immunsystem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>D-410</td>
			<td>Gamma sterilized culture vessels (4/box)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok tip syringes (3 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>For attaching to the 10 mL HARVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92 Cell-line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4D</td>
			<td>Rotating wall vessel device; 2D clinostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 suspension culture flasks</td>
			<td>Sarsedt</td>
			<td>83.3910.502</td>
			<td>For flask control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system

I betragtning af de nuværende begrænsninger ved at udføre biologisk forskning i rummet findes der nogle få muligheder for at udsætte cellekultur for simuleret mikrogravitation (SMG) på Jorden. Disse muligheder varierer i deres metoder, principper og egnethed til brug med suspensionscellekultur. Her beskrives en cellekulturmetode til at udsætte lymfocytter for simuleret mikrogravitation ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt roterende cellekultursystem, også kendt som en 2D clinostat eller en roterende vægbeholder (RWV) enhed. Denne cellekulturmetode anvender princippet om tidsgennemsnitlig gravitationsvektorannullering til at simulere mikrogravitation ved at rotere cellerne på en vandret akse. De celler, der dyrkes i dette system, kan høstes og anvendes i mange forskellige eksperimentelle assays for at vurdere virkningerne af simuleret mikrogravitation på cellulær funktion og fysiologi. Dyrkningsteknikken kan variere lidt afhængigt af den celletype eller linje, der anvendes, men metoden beskrevet her kan anvendes på enhver suspensionscellekultur.

Denne dyrkningsmetode betragtes som vellykket, hvis 1) spredningen af cellerne er omtrent konsistent på tværs af kontrolgrupperne (og ideelt set alle eksperimentelle grupper), 2) spredningen er passende i betragtning af såtætheden, behandlingslængden og fordoblingstiden for celletypen / linjen og 3) levedygtigheden af de høstede celler er 85% eller højere (tabel 1 ). Ideelt set bør de resulterende celler være lige så sunde, som de ville være i standardcellekultur, især til brug i efterfølgen...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System

Dette er en trinvis vejledning til brug af et kommercielt tilgængeligt roterende cellekultursystem til dyrkning af lymfocytter i simuleret mikrogravitation ved hjælp af specialiserede engangskulturbeholdere. Denne dyrkningsmetode kan anvendes på enhver cellekultur af suspensionstypen.

Dyrkning af lymfocytter i simuleret mikrogravitation ved hjælp af et roterende cellekultursystem

Given the current limitations of conducting biological research in space, a few options exist for subjecting cell culture to simulated microgravity (SMG) ...

Denne teknik giver os mulighed for at studere virkningerne af simuleret mikrogravitation på immunceller for at hjælpe os med bedre at forstå, hvordan aspekter af rummiljøet påvirker menneskelig fysiologi på molekylært niveau. Denne teknik er økonomisk gennemførlig og er relativt let at oprette og vedligeholde sammenlignet med at sende cellekultur til rummet eller andre metoder til at udsætte cellekultur for simuleret mikrogravitation på jorden. Det anbefales at gå langsomt, mens du fylder beholderne for at undgå overløb og spild.Efter den første fjernelse af boblen skal du sikre dig, at karrene er helt fulde ved hjælp af sprøjterne. Dette vil minimere chancerne for dannelse af store bobler under hele behandlingen. Start med at tage kulturbeholderne ud af plastemballagen.Mærk hvert fartøj på kanten i henhold til den celletype eller linje, der bruges, uanset om det er i kontrol eller behandling og andre relevante oplysninger. Stabiliser beholderen, og åbn påfyldningsporten forsigtigt uden at røre ved påfyldningsportens hættepind eller O-ringen. Placer hætten på en ethanolpude med pinden eller O-ringen opad, mens beholderen er fyldt.Fjern ikke hætterne fra sprøjteportene. Beholderen fyldes med 10 ml af det korrekte komplette medie til cellekulturen ved hjælp af en steril serologisk piper, og hætten anbringes forsigtigt på påfyldningsporten. Sørg for, at hætterne på sprøjten og påfyldningsporten er forsvarligt lukket.Placer derefter de fyldte kar i en inkubator, mens du udfører de efterfølgende trin for at prime karrene til cellekultur. Hent de mediegrundede kar fra inkubatoren. Til kolbekontrol fyldes en T25-suspensionskolbe med 10 ml cellekultur fra ovennævnte lager.Tilsæt 10 ml stamcellekultur til et separat 15 ml konisk rør, som vil blive brugt til at fylde sprøjterne. Skru hætterne til sprøjteporten af for at fjerne dem fra beholderen, og sørg for, at lagerstophanerne er i åben position. Stabiliser beholderen, og åbn påfyldningsporten forsigtigt uden at røre ved påfyldningsportens hættepind eller O-ringen.Placer hætten på en ethanolpude med pinden eller O-ringen opad, mens beholderen fyldes. Sørg for, at stophanerne er i åben position. Beholderen kan tømmes ved at hælde mediet fra beholderen i en affaldsbeholder ved hjælp af en serologisk pipette.Alternativt kan du aspirere mediet ved hjælp af et sterilt glas forbi din pipette, der er fastgjort til et vakuumsystem. Når du bruger en pipette eller vakuumsystemet, skal du sørge for ikke at røre ved iltningsmembranen, da dette kan beskadige den og gøre beholderen ubrugelig. Luk det 50 ml koniske rør, der indeholder den fremstillede stamcellekultur, tæt, og vend det forsigtigt et par gange for at blande indholdet grundigt.Der trækkes 10 ml cellekulturmateriale op af 50 ml røret med en frisk steril serologisk pipet. Tag beholderen op og vip den, så påfyldningsporten er mod toppen. Fordel derefter forsigtigt cellekulturstammen i beholderen gennem påfyldningsporten.Fyld beholderen helt til spidsen af påfyldningsporten, mens du vipper beholderen ned igen for at undgå spild. Pas på ikke at røre iltningsmembranen med pipetten, da den er meget skrøbelig. Når fartøjet er lastet, skal du forsigtigt sætte påfyldningsportens hætte på igen uden at røre O-ringen.Fjern den første 3 ml sprøjte fra pakningen og pump den et par gange for at løsne den. Fastgør derefter sprøjten til en af sprøjteportene, og sørg for, at sprøjten er helt trykket ned. Luk det 15 ml koniske rør indeholdende 10 ml alikvote cellekultur tæt, og vend det forsigtigt et par gange for at blande indholdet grundigt.På samme måde skal du fjerne den anden 3 ml sprøjte fra pakningen og pumpe den et par gange. Derefter nedsænkes denne sprøjte forsigtigt halvt i cellekulturen fra det 15 ml koniske rør og trækker noget kultur op. Minimer luftbobler ved at hælde sprøjten helt tilbage i tuben og trække 3 ml kultur op.Fastgør den fyldte sprøjte til den resterende sprøjteport, og desinficer forsigtigt sprøjterne og omkring påfyldningsporten med en ethanolpude. Få ikke ethanol på iltningsmembranen. Gentag processen for de resterende fartøjer.Hvis der er en lidt utilstrækkelig cellekultur tilbage i det 50 ml koniske rør til det sidste kar, skal du genvinde den resterende mængde fra det 15 ml koniske rør, der bruges til at fylde sprøjterne. Sørg for, at stophanerne til sprøjteporten er lukket for at begrænse migreringen af celler og bobler fra sprøjterne til karrene. Vend fartøjet på hovedet og slå det side et par gange for at samle de første bobler.Vend hurtigt fartøjet tilbage for at vende opad og derefter i en lille vinkel vendt væk, så boblerne alle flyder til den opadgående side af fartøjet. Manøvrer boblerne under porten med den tomme sprøjte, og se dem begynde at komme ind i havnen. Åbn begge stophaner til sprøjteporten.Slå forsigtigt på beholderen for at tilskynde boblerne til at flyde op i den tomme sprøjte. Sug langsomt de større bobler op med den tomme sprøjte, mens du forsigtigt trykker den fulde sprøjte ned for at opretholde trykket i beholderen, så iltningsmembranen ikke brister. Gentag denne proces et par gange for at sikre, at alle bobler fjernes.Når boblerne er fjernet effektivt, lukkes stophanerne til sprøjteporten. Hold sprøjterne tændt under behandlingen for at muliggøre efterfølgende fjernelse af bobler, og sørg for, at volumen i begge sprøjter er omtrent ens. Tør forsigtigt overfladen af den roterende base og båndkablet af med 70 % ethanol.Sørg for, at båndkablet er tilsluttet strømforsyningen. Placer den roterende base i inkubatoren, og fastgør båndkablet til bunden. Placer strømforsyningen i nærheden, men uden for inkubatoren.Fastgør SMG-behandlingsbeholderen ved at stille beholderens gevind op til den roterende pind og forsigtigt dreje den roterende pind på basen mod uret. Sørg for, at fartøjet er fastgjort sikkert. Hold inkubatoren på ca. 100%fugtighed ved at fylde vandbakken med autoklave RO-vand.Juster inkubatorens rotationshastighed, så den passer til cellernes sedimentationshastighed, så cellerne ikke falder gennem mediet. På den første dag efter opsætning af behandlingen skal du kontrollere for bobledannelse hvert par timer som beskrevet i tekstmanuskriptet. Fjern boblerne mindst en gang om dagen fremadrettet indtil slutningen af den ønskede behandlingslængde.Når den planlagte behandlingslængde er gået, skal du stoppe rotationen og adskille apparatet. Fjern behandlingsbeholderen ved forsigtigt at holde beholderen stille, mens du drejer enhedens roterende pind med uret. Kontrolkolben, kontrolbeholderen og den behandlede beholder anbringes i et sterilt biologisk sikkerhedsskab.Tag hvert fartøj undtagen kontrolkolben, og vend den, så den vender nedad. Slå derefter forsigtigt på den for at bringe alle cellerne i suspension. Drej derefter beholderen på siden med påfyldningsporten mod bunden, og slå den igen for at lede cellerne mod påfyldningsporten for effektiv aspiration.Håndter hvert fartøj individuelt. Skru sprøjterne af fra de to porte, og fordel dem i det biofarlige affald. Åbn stophanerne på sprøjteportene.Fjern forsigtigt påfyldningsportens hætte, og træk indholdet op ved hjælp af en steril 10 ml serologisk pipette, vip beholderen, når den tømmes. Dispenser indholdet af alle kontrol- og behandlingsgrupperne i individuelt mærkede 15 ml koniske rør. Luk hvert rør og vend dem forsigtigt et par gange for at sikre, at de blandes korrekt.Brug den foretrukne metode til bestemmelse af koncentrationen og levedygtigheden af den resulterende cellekultur til forberedelse af efterfølgende eksperimentelle assays. NK-92-cellelinjens startlevedygtighed og siddetætheder blev sammenlignet med den resulterende slutlevedygtighed og slutkoncentrationer. Efter en 72-timers SMG-behandling blev to tilfælde af negative og positive resultater sammenlignet.Til sammenligning var det optimale koncentrationsområde for den anvendte NK-92-cellelinje mellem 0,3 og 1,2 millioner celler pr. milliliter med en fordoblingstid på omkring to til tre dage. Spredning i SMG-behandlingsgruppen var omtrent ens på tværs af kontrol- og behandlingsgrupperne. Disse parametre var afgørende for downstream eksperimentel succes, og de resulterende celler fra de to kontrolgrupper udførte ens i downstream eksperimentelle assays.Det er afgørende at overvåge og redegøre for bobledannelse i løbet af behandlingen, især i cellekulturen, der udsættes for simuleret mikrogravitation. Stor bobledannelse kan forårsage forstyrrelse af væskedynamikken i beholderen, og dette vil i det væsentlige ophæve den simulerede mikrogravitationstilstand.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primær Neuron Kultur System for Studiet af Herpes Simplex Virus Latency og genaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Ændring af primære humane T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Dyrkning Mikroglia fra Neonatal og Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolering og Th17 Differentiering af Naïve CD4 T-lymfocytter

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Vurdering af Innate Sensing af HIV-1 inficerede CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler ved plasmacytoide dendritiske celler ved hjælp af en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-dyrkningssystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Visualisering af IL-22-udtrykkende Lymfocytter Brug Reporter Mus

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Molekylær diffusion i plasma Membraner af primær lymfocytter målt ved fluorescenskorrelationsspektroskopi

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infektiøs Cell Culture System og<em&gt; In vitro</em&gt; Profylaktiske virkning af interferoner

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Hurtig Kvantificering af mitogen-induceret blastogenese i T-lymfocytter til Identifikation Immunmodulerende narkotika

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolere lymfocytter fra mus Small Intestinal immunsystemet

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...