Name: culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system
Uploaded: 2022-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door de Canadian Space Agency (CSA), onderzoeksbeurs (17ILSRA3, Immuno Profile). De auteurs willen Dr. Roxanne Fournier (University of Toronto), Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial University) en Preteesh Mylabathula (University of Arizona) bedanken voor hun hulp bij het oplossen van dit protocol.

OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een steriele biologische veiligheidskast.
1. Voorbereiding van vaten voor celkweek
<ol><li>Haal de kweekvaten uit de plastic verpakking. Label elk vat op de rand op basis van welk celtype/lijn wordt gebruikt, of het nu gaat om de controle (1G) of behandeling (SMG) en alle andere relevante informatie.</li>
	<li>Stabiliseer het vat en open de vulpoort voorzichtig, zonder de doppen/O-ring van de vulpoort aan te raken. P...

<ol>
	<li>ElGindi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+the+force+be+with+you+(or+not):+the+immune+system+under+microgravity.">May the force be with you (or not): the immune system under microgravity.</a> Cells. 10 (8), 1941 (2021).</li><li>Chouk&#232;r, A., Ullrich, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+system+dysregulation+during+spaceflight:+potential+countermeasures+for+deep+space+exploration+missions.">Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Countermeasures-based+improvements+in+stress,+immune+system+dysregulation+and+latent+herpesvirus+reactivation+onboard+the+International+Space+Station+-+relevance+for+deep+space+missions+and+terrestrial+medicine.">Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine.</a> Neuroscience &amp; Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).</li><li>Herranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground-based+facilities+for+simulation+of+microgravity:+organism-specific+recommendations+for+their+use,+and+recommended+terminology.">Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology.</a> Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).</li><li>Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+current+microgravity+platforms+for+space+biology+research.">Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research.</a> Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).</li><li>Murphy, K., Weaver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Janeway's Immunobiology 9th Edition. , (2016).</li><li>Dedolph, R. R., Dipert, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+gravity+stimulus+nullification+by+clinostat+rotation.">The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation.</a> Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).</li><li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+suspension+culture:+the+rotating-wall+vessel.">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).</li><li>Crabb&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+proteomic+responses+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+to+spaceflight+conditions+involve+Hfq+regulation+and+reveal+a+role+for+oxygen.">Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).</li><li>Ulbrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+simulated+and+real+microgravity+on+bone+cells+and+mesenchymal+stem+cells.">The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells.</a> BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).</li><li>Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+and+simulated+microgravity+cause+a+significant+reduction+of+key+gene+expression+in+early+T-cell+activation.">Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).</li><li>Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+cell+line+(NK-92)+with+phenotypical+and+functional+characteristics+of+activated+natural+killer+cells.">Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.</a> Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).</li><li>Williams, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+NK-92+cells+for+refractory+hematological+malignancies+relapsing+after+autologous+hematopoietic+cell.">A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell.</a> Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).</li><li>Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol">https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol</a> (2022)</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2022)</li><li>Mylabathula, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+disarms+human+NK-cells+and+inhibits+anti-tumor+cytotoxicity+in+vitro.">Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro.</a> Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+simulated+microgravity+on+primary+human+NK+cells.">Effects of simulated microgravity on primary human NK cells.</a> Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).</li><li>Shao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+effect+of+simulated+microgravity+on+the+cytotoxicity+of+NK+cells+following+the+DNA+methylation+of+NKG2D+and+the+expression+of+DAP10.">Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10.</a> Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).</li><li>Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+attachment-independent+biofilm+formation+and+repression+of+hfq+expression+by+low-fluid-shear+culture+of+Staphylococcus+aureus.">Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).</li><li>Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air+bubble-isolating+rotating+wall+vessel+bioreactor+for+improved+spheroid/organoid+formation.">An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).</li></ol>

Terwijl de mensheid zich voorbereidt op langere ruimtemissies naar de maan en Mars, moet er meer onderzoek worden gedaan om ernstige gezondheidsrisico's bij astronauten te beperken. Een belangrijk aspect van de ruimteomgeving dat de menselijke fysiologie beïnvloedt, is microzwaartekracht. Hier is een celkweekmethode beschreven voor het onderwerpen van lymfocyten aan SMG met behulp van een in de handel verkrijgbaar roterend celkweeksysteem.
Dit protocol bevat een paar kritieke stappen die moge...

Van ruimtevaart is aangetoond dat het vele aspecten van de menselijke fysiologie beïnvloedt, waaronder het immuunsysteem. Veel studies hebben bewijs aangetoond van immuunontregeling als gevolg van ruimtevluchten in vivo en blootstelling aan gesimuleerde microzwaartekracht (SMG) in vitro 1,2,3,4. Een belangrijk aspect van de ruimteomgeving dat de menselijke fysiologie beïnvloedt, is microzwaartekracht. Microzwaartekracht verwijst naar de "gewichtloosheid" die wordt ervaren als gevolg van lage zwaartekrachten in de ruimteomgeving5. Terwijl de mensheid zich voorbereidt op langere ruimtemissies naar de maan en Mars, moet er meer onderzoek worden gedaan om ernstige gezondheidsrisico's bij astronauten te beperken.
Echte microzwaartekrachtcondities voor wetenschappelijk onderzoek kunnen worden bereikt in de ruimte aan boord van het International Space Station (ISS) of in nanosatellieten die in een baan om de aarde worden gelanceerd; Deze opties kunnen echter ongelooflijk duur en complex zijn om te orkestreren. Gezien de huidige beperkingen van het uitvoeren van biologisch onderzoek in de ruimte, bestaan er verschillende opties voor het induceren van echte microzwaartekracht en SMG op aarde. Er bestaan grootschalige operaties die korte perioden van echte microzwaartekracht op aarde kunnen produceren, waaronder valtorens, parabolische vluchten en klinkende raketten. Deze methoden zijn echter niet overdreven geschikt voor het bestuderen van de effecten van microzwaartekracht op biologische systemen, grotendeels vanwege hun korte perioden van microzwaartekrachtbehandeling (d.w.z. seconden tot 20 minuten). Deze methoden worden elders nader besproken 5,6. Opties die geschikt zijn voor biologische celkweek zijn kleinschalige apparaten zoals 2D-clinostaten of rwv-apparaten (rotating wall vat) en 3D-clinostaten of random positioning machines (RPM). Deze apparaten kunnen worden opgesteld in celkweekincubatoren die op 37 °C en 5% CO2 worden gehouden, en ze roteren de celcultuur op een horizontale as (2D) of op twee loodrechte assen (3D)5. Het is echter belangrijk om te benadrukken dat deze kweekmethoden SMG produceren in tegenstelling tot echte microzwaartekracht, die het meest haalbaar is in de ruimte voor biologische onderzoekscontexten.
Het doel van dit artikel is om de stappen te schetsen voor het onderwerpen van lymfocyten aan SMG met behulp van een in de handel verkrijgbaar RWV-apparaat (Table of Materials), dat onder de 2D-clinostatclassificatie valt. Hoewel er een algemeen protocol beschikbaar is van de fabrikant voor het gebruik van dit apparaat, is het huidige artikel bedoeld om de stappen voor probleemoplossing en optimalisatie in meer detail te behandelen. Dit artikel behandelt ook de theorie achter hoe dit apparaat werkt om SMG te produceren in suspensiecelcultuur, met name met lymfocyten. In deze context verwijst suspensiecelcultuur naar cellen die vrij groeien in aangevulde kweekmedia, zonder zich te hechten aan extra steigers. Veel celtypen worden gekweekt in suspensiecelcultuur, waaronder lymfocyten. Lymfocyten zijn cellen van het immuunsysteem, waaronder T-, B- en Natural Killer (NK) -cellen, die zich in lymfoïde organen en de bloedbaan bevinden7.
De hier beschreven RWV 2D-clinostaat werkt volgens het principe van tijdgemiddelde zwaartekrachtvector-nullificatie 5,6,8,9, waarbij de zwaartekrachtvector wordt gerandomiseerd door rotatie van de celcultuur op een horizontale as. Dit wordt bereikt door de rotatiesnelheid van het kweekvat af te stemmen op de sedimentatiesnelheid van de cellen. Zolang de rotatiesnelheid van het kweekvat goed is afgestemd op de sedimentatiesnelheid van de cellen, worden de cellen in vrije val gehouden en kunnen ze niet bezinken, zoals ervaren in de ruimteomgeving. Na een eerste versnellingsfase bereiken de media in het kweekvat uiteindelijk na verloop van tijd "vaste lichaamsrotatie". Deze horizontale rotatie induceert ook laminaire stroming in het celkweekvat. Dit creëert een "low shear" -omgeving, aangezien de schuifspanning die door laminaire stroming op de cellen wordt veroorzaakt, veel minder is dan die van turbulente stroming. Aangezien de clinostaat echter geen perfect systeem is, zijn er enkele kleine, laminaire vloeistofbewegingen geïntroduceerd, die minimale schuifspanning op de cellen veroorzaken. Als zodanig worden de cellen die in de media zweven tijdens de rotatie door deze stroom meegesleurd. Tijdens horizontale rotatie werkt de zwaartekrachtvector op de cellen en brengt ze in een oscillerende baan, zoals gevisualiseerd in figuur 1. Een andere kleine bron van schuifspanning wordt veroorzaakt doordat de cellen door de media "vallen", waardoor laminaire stroming rond de cellen ontstaat. Terwijl het kweekvat om een horizontale as draait, roteert ook de zwaartekrachtvector die de cellen ervaren. Na verloop van tijd nadert deze roterende zwaartekrachtvector gemiddeld nul; dit fenomeen wordt tijdgemiddelde zwaartekrachtvector-nullificatie genoemd en induceert een toestand van SMG 5,6,8,9. Dit apparaat is gebruikt om de effecten van SMG op vele soorten cellen te bestuderen, waarvan sommige worden behandeld in referenties10,11,12. Meer voorbeelden zijn te vinden op de website van de fabrikant van het apparaat.
Dit RWV-apparaat maakt gebruik van gespecialiseerde "high aspect ratio vessels" (HARV's) die beschikbaar zijn via de fabrikant van het apparaat. Deze HARV's bevatten elk 10 ml celkweek; er zijn echter ook 50 ml HARV's beschikbaar. 10 ml of 50 ml HARV's kunnen worden gebruikt, afhankelijk van het aantal cellen dat nodig is om eventuele downstream experimentele assays te voltooien, wat verder wordt beschreven in de discussiesectie. De HARV's zijn gemaakt van polycarbonaat en bevatten een siliconen oxygenatiemembraan om gasuitwisseling tijdens celkweek mogelijk te maken. Dit handhaaft de pH van de celmedia en zorgt voor een efficiënte cellulaire ademhaling. Er is een hoofdvulpoort en twee afgedekte spuitpoorten aan de voorkant van het vat (figuur 2A). Na het laden van de celcultuur door de hoofdvulpoort, worden twee spuiten op het vat geladen om te helpen bij het verwijderen van de luchtbel. Bij gebruik van de vaten van 10 ml werken twee spuiten van 3 ml goed. Eén spuit is leeg aan het apparaat bevestigd, met de spuit volledig ingedrukt, en de andere is gevuld met 3 ml celkweek (figuur 2E). Deze worden in combinatie gebruikt om bubbels uit het vat te verwijderen, wat belangrijk is voor het behoud van de SMG-behandeling. Over het algemeen wordt geadviseerd om twee negatieve controles in te stellen, die kunnen worden aangeduid als de "Flask" -controle en de "1G" -controle. De "Kolf"-regeling komt overeen met cellen die worden gekweekt in een standaard T25-suspensiecelkweekkolf. De 1G-controle komt overeen met cellen die worden gekweekt in het gespecialiseerde kweekvat van 10 ml, dat eenvoudig in de couveuse wordt geplaatst (d.w.z. zonder te worden onderworpen aan de SMG-behandeling). Zie het gedeelte Discussie voor meer informatie over besturingselementen.
De hier beschreven methode is geschikt voor elke onderzoeker die de effecten van SMG op lymfocyten wil bestuderen, met een specifieke focus op NK-cellen met behulp van de NK92-cellijn13. De resultaten van deze studies kunnen ons helpen de nadelige effecten van ruimtevaart op het menselijk immuunsysteem beter te begrijpen en te verzachten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>D-410</td>
			<td>Gamma sterilized culture vessels (4/box)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok tip syringes (3 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>For attaching to the 10 mL HARVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92 Cell-line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4D</td>
			<td>Rotating wall vessel device; 2D clinostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 suspension culture flasks</td>
			<td>Sarsedt</td>
			<td>83.3910.502</td>
			<td>For flask control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system

Gezien de huidige beperkingen van het uitvoeren van biologisch onderzoek in de ruimte, bestaan er een paar opties voor het onderwerpen van celcultuur aan gesimuleerde microzwaartekracht (SMG) op aarde. Deze opties variëren in hun methoden, principes en geschiktheid voor gebruik met suspensiecelcultuur. Hier wordt een celkweekmethode beschreven voor het onderwerpen van lymfocyten aan gesimuleerde microzwaartekracht met behulp van een in de handel verkrijgbaar roterend celkweeksysteem, ook bekend als een 2D-clinostaat of een rotating wall vessel (RWV) -apparaat. Deze celkweekmethode maakt gebruik van het principe van tijdgemiddelde zwaartekrachtvector-nullificatie om microzwaartekracht te simuleren door de cellen op een horizontale as te roteren. De cellen die in dit systeem worden gekweekt, kunnen worden geoogst en gebruikt in veel verschillende experimentele testen om de effecten van gesimuleerde microzwaartekracht op de cellulaire functie en fysiologie te beoordelen. De kweektechniek kan enigszins variëren, afhankelijk van het celtype of de lijn die wordt gebruikt, maar de hier beschreven methode kan worden toegepast op elke celcultuur van het suspensietype.

Deze kweekmethode wordt als succesvol beschouwd als 1) de proliferatie van de cellen ongeveer consistent is tussen de controlegroepen (en idealiter alle experimentele groepen), 2) de proliferatie geschikt is gezien de zaaidichtheid, de duur van de behandeling en de verdubbelingstijd van het celtype / de lijn, en 3) de levensvatbaarheid van de geoogste cellen 85% of hoger is (tabel 1 ). Idealiter zouden de resulterende cellen net zo gezond moeten zijn als in standaard celcultuur, vooral voor gebruik in la...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System

Dit is een stapsgewijze handleiding voor het gebruik van een in de handel verkrijgbaar roterend celkweeksysteem om lymfocyten te kweken in gesimuleerde microzwaartekracht met behulp van gespecialiseerde wegwerpkweekvaten. Deze kweekmethode kan worden toegepast op elke celcultuur van het suspensietype.

Het kweken van lymfocyten in gesimuleerde microzwaartekracht met behulp van een roterend celkweeksysteem

Given the current limitations of conducting biological research in space, a few options exist for subjecting cell culture to simulated microgravity (SMG) ...

Deze techniek stelt ons in staat om de effecten van gesimuleerde microzwaartekracht op immuuncellen te bestuderen om ons te helpen beter te begrijpen hoe aspecten van de ruimteomgeving de menselijke fysiologie op moleculair niveau beïnvloeden. Deze techniek is economisch haalbaar en is relatief eenvoudig op te zetten en te onderhouden in vergelijking met het sturen van celcultuur naar de ruimte of andere methoden om celcultuur te onderwerpen aan gesimuleerde microzwaartekracht op aarde. Het wordt aanbevolen om langzaam te gaan tijdens het vullen van de vaten om overloop en morsen te voorkomen.Zorg er na het verwijderen van de eerste bubbel voor dat de vaten volledig vol zijn door de spuiten te gebruiken. Dit minimaliseert de kans op grote bubbelvorming tijdens de behandeling. Begin met het verwijderen van de kweekvaten uit de plastic verpakking.Label elk vat op de rand op basis van het celtype of de lijn die wordt gebruikt, of het nu in de controle of behandeling is en andere relevante informatie. Stabiliseer het vat en open de vulpoort voorzichtig zonder de dop van de vulpoort of de O-ring aan te raken. Plaats de dop op een ethanolpad met de pen of O-ring naar boven gericht terwijl het vat is gevuld.Verwijder de doppen niet van de spuitpoorten. Laad het vat met 10 ml van de juiste volledige media voor de celkweek met behulp van een steriel serologisch pipet en plaats de dop voorzichtig op de vulpoort. Zorg ervoor dat de doppen van de spuitpoort en de vulpoort goed gesloten zijn.Plaats vervolgens de gevulde vaten in een incubator terwijl u de volgende stappen uitvoert om de vaten voor te bereiden op celkweek. Haal de media geprimeerde vaten uit de incubator. Voor een kolfregeling laadt u een T25-suspensiekweekkolf met 10 ml celkweek uit de hierboven bereide voorraad.Voeg 10 ml stamcelcultuur toe aan een aparte conische buis van 15 ml, die zal worden gebruikt om de spuiten te laden. Schroef de doppen van de spuitpoort los om ze uit het vat te verwijderen en zorg ervoor dat de voorraadstopkranen in de open positie staan. Stabiliseer het vat en open de vulpoort voorzichtig zonder de dop van de vulpoort of de O-ring aan te raken.Plaats de dop op een ethanolpad met de pen of O-ring naar boven gericht terwijl het vat wordt gevuld. Zorg ervoor dat de stopkranen in de open stand staan. Het vat kan worden geleegd door de media uit het vat in een afvalcontainer te gieten met behulp van een serologische pipet.U kunt de media ook opzuigen met een steriel glas langs uw pipet die aan een vacuümsysteem is bevestigd. Zorg er tijdens het gebruik van een pipet of het vacuümsysteem voor dat u het oxygenatiemembraan niet aanraakt, omdat dit het kan beschadigen en het vat onbruikbaar kan maken. Sluit de conische buis van 50 ml met de bereide stamcelcultuur goed af en keer deze een paar keer voorzichtig om om de inhoud grondig te mengen.Trek 10 ml celkweekbouillon uit de buis van 50 ml met een verse steriele serologisch pipet. Pak het vat op en kantel het, zodat de vulpoort naar boven is. Doseer vervolgens voorzichtig de celkweekvoorraad in het vat via de vulpoort.Vul het vat tot aan de punt van de vulpoort, terwijl u het vat weer naar beneden kantelt om morsen te voorkomen. Zorg ervoor dat u het oxygenatiemembraan niet aanraakt met de pipet, omdat deze erg kwetsbaar is. Zodra het vat is geladen, plaatst u de dop van de vulpoort voorzichtig terug zonder de O-ring aan te raken.Verwijder de eerste spuit van 3 ml uit de verpakking en pomp deze een paar keer om deze los te maken. Bevestig vervolgens de spuit aan een van de spuitpoorten en zorg ervoor dat de spuit volledig wordt ingedrukt. Sluit de conische buis van 15 ml met 10 ml aliquote celcultuur goed af en keer deze een paar keer voorzichtig om om de inhoud grondig te mengen.Verwijder op dezelfde manier de tweede spuit van 3 ml uit de verpakking en pomp deze een paar keer af. Vervolgens deze spuit voorzichtig half ondergedompeld in de celkweek uit de 15 ml conische buis en wat cultuur opzuigen. Minimaliseer luchtbellen door de spuit volledig terug in de buis te doseren en 3 ml cultuur op te zuigen.Bevestig de gevulde spuit aan de resterende spuitpoort en ontsmet de spuiten en rond de vulpoort zorgvuldig met een ethanolpad. Krijg geen ethanol op het oxygenatiemembraan. Herhaal het proces voor de resterende vaten.Als er een iets onvoldoende celcultuur overblijft in de conische buis van 50 ml voor het laatste vat, haal dan de resterende hoeveelheid terug uit de conische buis van 15 ml die wordt gebruikt om de spuiten te laden. Zorg ervoor dat de stopkranen van de spuitpoort gesloten zijn om de migratie van cellen en bubbels van de spuiten naar de vaten te beperken. Draai het vat ondersteboven en sla het een paar keer opzij om de eerste bubbels te verzamelen.Draai het vat snel terug naar boven en dan in een lichte hoek naar buiten, zodat de bellen allemaal naar de opwaartse kant van het vat drijven. Manoeuvreer de bubbels onder de poort met de lege spuit en kijk hoe ze de poort beginnen binnen te komen. Open beide stopkranen van de spuitpoort.Sla zachtjes op het vat om de bubbels aan te moedigen om in de lege spuit te drijven. Zuig langzaam de grotere bubbels op met de lege spuit terwijl u de volle spuit voorzichtig indrukt om de druk in het vat te behouden, zodat het oxygenatiemembraan niet barst. Herhaal dit proces een paar keer om ervoor te zorgen dat alle bubbels worden verwijderd.Wanneer de bubbels effectief zijn verwijderd, sluit u de stopkranen van de spuitpoort. Houd de spuiten tijdens de behandeling aan om de daaropvolgende bubbel te kunnen verwijderen en zorg ervoor dat het volume in beide spuiten ongeveer gelijk is. Veeg het oppervlak van de roterende basis en lintkabel voorzichtig af met 70% ethanol.Zorg ervoor dat de lintkabel is aangesloten op de voeding. Plaats de roterende basis in de incubator en bevestig de lintkabel aan de basis. Plaats de voeding dichtbij, maar buiten de incubator.Bevestig het SMG-behandelingsvat door de vaatdraden op de roterende pen te zetten en de roterende pen op de basis voorzichtig tegen de klok in te draaien. Zorg ervoor dat het vat stevig is bevestigd. Houd de incubator op ongeveer 100% luchtvochtigheid door de waterbak te vullen met autoclaaf RO-water.Pas de rotatiesnelheid van de incubator aan de sedimentatiesnelheid van de cellen aan, zodat de cellen niet door de media vallen. Controleer op de eerste dag van het opzetten van de behandeling om de paar uur op bubbelvorming zoals beschreven in het tekstmanuscript. Verwijder de bubbels minstens één keer per dag tot het einde van de gewenste behandelingsduur.Zodra de geplande behandelingslengte is verstreken, stopt u de rotatie en demonteert u het apparaat. Verwijder het behandelingsvat door het vat voorzichtig stil te houden terwijl u de roterende pen van het apparaat met de klok mee draait. Breng de regelkolf, de controle en het behandelde vat in een steriele biologische veiligheidskast.Neem elk vat met uitzondering van de regelkolf en draai het om, zodat het naar beneden is gericht. Sla er vervolgens zachtjes op om alle cellen in suspensie te brengen. Draai vervolgens het vat op zijn kant met de vulpoort naar de bodem en sla het opnieuw om de cellen naar de vulpoort te leiden voor efficiënte aspiratie.Behandel elk schip afzonderlijk. Schroef de spuiten los van de twee poorten en doseer ze in het biogevaarlijke afval. Open de stopkranen op de spuitpoorten.Verwijder voorzichtig de dop van de vulpoort en zuig de inhoud op met behulp van een steriele serologische pipet van 10 ml, waarbij u het vat kantelt terwijl het wordt geleegd. Doseer de inhoud van alle controle- en behandelingsgroepen in individueel gelabelde conische buisjes van 15 ml. Sluit elke buis en keer ze een paar keer voorzichtig om om ervoor te zorgen dat ze goed gemengd zijn.Gebruik de voorkeursmethode voor het bepalen van de concentratie en levensvatbaarheid van de resulterende celcultuur om u voor te bereiden op latere experimentele tests. De NK-92 cellijn start levensvatbaarheid en zitdichtheden werden vergeleken met de resulterende einde levensvatbaarheid en eindconcentraties. Na een SMG-behandeling van 72 uur werden twee gevallen van negatieve en positieve uitkomsten vergeleken.Ter vergelijking: het optimale concentratiebereik van de gebruikte NK-92-cellijn lag tussen 0,3 en 1,2 miljoen cellen per milliliter met een verdubbelingstijd van ongeveer twee tot drie dagen. De proliferatie in de SMG-behandelingsgroep was ongeveer gelijk in de controle- en behandelingsgroepen. Deze parameters waren essentieel voor het downstream experimentele succes en de resulterende cellen uit de twee controlegroepen presteerden op dezelfde manier in downstream experimentele assays.Het is van cruciaal belang om de vorming van bellen tijdens de behandeling te controleren en te verantwoorden, vooral in de celcultuur die wordt onderworpen aan gesimuleerde microzwaartekracht. Grote bubbelvorming kan verstoring van de vloeistofdynamica in het vat veroorzaken, en dit zal in wezen de gesimuleerde microzwaartekrachtconditie tenietdoen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Een primaire Neuron Cultuurstelsel voor de Studie van Herpes Simplex Virus latentie en reactivatie

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Kweken Microglia van de neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolatie en Th17 Differentiatie van naïeve CD4 T-lymfocyten

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Het beoordelen van de Aangeboren Sensing van HIV-1 geïnfecteerde CD4<sup&gt; +</sup&gt; T cellen door plasmacytoïde dendritische cellen gebruiken een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultuur systeem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Visualisatie van IL-22-uiting van lymfocyten Met behulp van Reporter Muizen

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Moleculaire Diffusion in de plasmamembraan van Primary lymfocyten gemeten met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylactisch effect van interferonen

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Rapid Kwantificering van Mitogen geïnduceerde blastogenesereactie in T-lymfocyten voor het vaststellen van Immuunmodulerende Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...