Name: culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system
Uploaded: 2022-08-25T12:30:00
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Ces travaux sont financés par une subvention de recherche de l’Agence spatiale canadienne (ASC) (17ILSRA3, Immuno-Profile). Les auteurs aimeraient remercier la Dre Roxanne Fournier (Université de Toronto), le Dr Randal Gregg (Université Lincoln Memorial) et Preteesh Mylabathula (Université de l’Arizona) pour leur aide dans le dépannage initial de ce protocole.

REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être effectuées à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique stérile.
1. Préparation des récipients pour la culture cellulaire
<ol><li>Sortez les récipients de culture de l’emballage en plastique. Étiquetez chaque récipient sur le bord en fonction du type de cellule ou de la lignée utilisée, qu’il s’agisse du témoin (1G) ou du traitement (SMG) et de toute autre information pertinente.</li>
	<li>Stabilis...

<ol>
	<li>ElGindi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+the+force+be+with+you+(or+not):+the+immune+system+under+microgravity.">May the force be with you (or not): the immune system under microgravity.</a> Cells. 10 (8), 1941 (2021).</li><li>Chouk&#232;r, A., Ullrich, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+system+dysregulation+during+spaceflight:+potential+countermeasures+for+deep+space+exploration+missions.">Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Countermeasures-based+improvements+in+stress,+immune+system+dysregulation+and+latent+herpesvirus+reactivation+onboard+the+International+Space+Station+-+relevance+for+deep+space+missions+and+terrestrial+medicine.">Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine.</a> Neuroscience &amp; Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).</li><li>Herranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground-based+facilities+for+simulation+of+microgravity:+organism-specific+recommendations+for+their+use,+and+recommended+terminology.">Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology.</a> Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).</li><li>Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+current+microgravity+platforms+for+space+biology+research.">Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research.</a> Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).</li><li>Murphy, K., Weaver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Janeway's Immunobiology 9th Edition. , (2016).</li><li>Dedolph, R. R., Dipert, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+gravity+stimulus+nullification+by+clinostat+rotation.">The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation.</a> Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).</li><li>Hammond, T. G., Hammond, J. 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M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+and+simulated+microgravity+cause+a+significant+reduction+of+key+gene+expression+in+early+T-cell+activation.">Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).</li><li>Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+cell+line+(NK-92)+with+phenotypical+and+functional+characteristics+of+activated+natural+killer+cells.">Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.</a> Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).</li><li>Williams, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+NK-92+cells+for+refractory+hematological+malignancies+relapsing+after+autologous+hematopoietic+cell.">A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell.</a> Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).</li><li>Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol">https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol</a> (2022)</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2022)</li><li>Mylabathula, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+disarms+human+NK-cells+and+inhibits+anti-tumor+cytotoxicity+in+vitro.">Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro.</a> Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+simulated+microgravity+on+primary+human+NK+cells.">Effects of simulated microgravity on primary human NK cells.</a> Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).</li><li>Shao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+effect+of+simulated+microgravity+on+the+cytotoxicity+of+NK+cells+following+the+DNA+methylation+of+NKG2D+and+the+expression+of+DAP10.">Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10.</a> Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).</li><li>Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+attachment-independent+biofilm+formation+and+repression+of+hfq+expression+by+low-fluid-shear+culture+of+Staphylococcus+aureus.">Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).</li><li>Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air+bubble-isolating+rotating+wall+vessel+bioreactor+for+improved+spheroid/organoid+formation.">An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).</li></ol>

Alors que l’humanité se prépare à des missions spatiales plus longues vers la Lune et Mars, davantage de recherches doivent être menées pour atténuer les risques graves pour la santé des astronautes. Un aspect majeur de l’environnement spatial qui a un impact sur la physiologie humaine est la microgravité. Ici, une méthode de culture cellulaire a été décrite pour soumettre les lymphocytes à l’ASG à l’aide d’un système de culture cellulaire rotative disponible dans le commerce.
<p class="jove_...

Il a été démontré que les vols spatiaux ont un impact sur de nombreux aspects de la physiologie humaine, y compris le système immunitaire. De nombreuses études ont démontré des signes de dérégulation immunitaire à la suite de vols spatiaux in vivo et d’exposition à la microgravité simulée (SMG) in vitro 1,2,3,4. Un aspect majeur de l’environnement spatial qui a un impact sur la physiologie humaine est la microgravité. La microgravité fait référence à « l’apesanteur » ressentie en raison des faibles forces gravitationnelles dans l’environnement spatial5. Alors que l’humanité se prépare à des missions spatiales plus longues vers la Lune et Mars, davantage de recherches doivent être menées pour atténuer les risques graves pour la santé des astronautes.
Des conditions réelles de microgravité pour la recherche scientifique peuvent être obtenues dans l’espace à bord de la Station spatiale internationale (ISS) ou dans des nanosatellites lancés en orbite; Cependant, ces options peuvent être incroyablement coûteuses et complexes à orchestrer. Compte tenu des limites actuelles de la recherche biologique dans l’espace, plusieurs options existent pour induire une microgravité réelle et SMG sur Terre. Il existe des opérations à grande échelle qui peuvent produire de courtes périodes de microgravité réelle sur Terre, y compris des tours de largage, des vols paraboliques et des fusées-sondes. Cependant, ces méthodes ne sont pas trop adaptées à l’étude des effets de la microgravité sur les systèmes biologiques, en grande partie en raison de leurs courtes périodes de traitement en microgravité (c.-à-d. de quelques secondes à 20 minutes). Ces méthodes sont examinées plus en détail ailleurs 5,6. Les options adaptées à la culture cellulaire biologique comprennent des dispositifs à petite échelle tels que des clinostats 2D ou des dispositifs à cuve à paroi rotative (RWV) et des clinostats 3D ou des machines de positionnement aléatoire (RPM). Ces dispositifs peuvent être installés à l’intérieur d’incubateurs de culture cellulaire maintenus à 37 °C et 5% de CO2, et ils font tourner la culture cellulaire soit sur un axe horizontal (2D), soit sur deux axes perpendiculaires (3D)5. Cependant, il est important de souligner que ces méthodes de culture produisent du SMG par opposition à la microgravité réelle, qui est la plus réalisable dans l’espace pour les contextes de recherche biologique.
L’objectif du présent article est de décrire les étapes à suivre pour soumettre les lymphocytes à l’ASG à l’aide d’un dispositif RWV (Table of Materials) disponible dans le commerce, qui relève de la classification clinostat 2D. Bien qu’il existe un protocole général disponible auprès du fabricant pour l’utilisation de cet appareil, le présent article vise à couvrir les étapes de dépannage et d’optimisation plus en détail. Cet article couvre également la théorie derrière la façon dont ce dispositif fonctionne pour produire du SMG en culture cellulaire en suspension, en particulier avec des lymphocytes. Dans ce contexte, la culture cellulaire en suspension fait référence aux cellules qui se développent librement dans des milieux de culture supplémentés, sans adhérer à un échafaudage supplémentaire. De nombreux types de cellules sont cultivés en culture cellulaire en suspension, y compris les lymphocytes. Les lymphocytes sont des cellules du système immunitaire, y compris les cellules T, B et Natural Killer (NK), qui résident dans les organes lymphoïdes et la circulation sanguine7.
Le clinostat RWV 2D décrit ici fonctionne sur le principe de l’annulation du vecteur de gravité moyenné dans le temps 5,6,8,9, selon lequel le vecteur de gravité est randomisé par rotation de la culture cellulaire sur un axe horizontal. Ceci est réalisé en faisant correspondre la vitesse de rotation du récipient de culture à la vitesse de sédimentation des cellules. Tant que la vitesse de rotation du récipient de culture correspond bien à la vitesse de sédimentation des cellules, les cellules sont maintenues en chute libre et incapables de sédimenter, comme c’est le cas dans l’environnement spatial. Après une phase initiale d’accélération, le milieu dans le récipient de culture atteint finalement la « rotation du corps solide » au fil du temps. Cette rotation horizontale induit également un écoulement laminaire dans le récipient de culture cellulaire. Cela crée un environnement de « faible cisaillement », étant donné que la contrainte de cisaillement induite sur les cellules par l’écoulement laminaire est bien inférieure à celle de l’écoulement turbulent. Cependant, étant donné que le clinostat n’est pas un système parfait, de petits mouvements de fluide laminaire sont introduits, qui infligent une contrainte de cisaillement minimale aux cellules. En tant que telles, les cellules en suspension dans le milieu sont entraînées par ce flux pendant la rotation. Pendant la rotation horizontale, le vecteur de gravité agit sur les cellules et les amène dans une trajectoire oscillante, comme le montre la figure 1. Une autre petite source de contrainte de cisaillement est causée par les cellules qui « tombent » à travers le milieu, provoquant un flux laminaire autour des cellules. Lorsque le récipient de culture tourne sur un axe horizontal, le vecteur de gravité subi par les cellules tourne également. Au fil du temps, ce vecteur gravitationnel rotatif se rapproche de zéro; ce phénomène est appelé nullification du vecteur de gravité moyen dans le temps et induit un état de SMG 5,6,8,9. Ce dispositif a été utilisé pour étudier les effets du SMG sur de nombreux types de cellules, dont certaines sont couvertes dans les références10,11,12. Vous trouverez d’autres exemples sur le site Web du fabricant de l’appareil.
Cet appareil RWV utilise des « vaisseaux à rapport d’aspect élevé » (HARV) spécialisés disponibles auprès du fabricant de l’appareil. Ces HARV contiennent 10 mL de culture cellulaire chacun; cependant, des VHR de 50 mL sont également disponibles. Des HARV de 10 mL ou de 50 mL peuvent être utilisés selon le nombre de cellules nécessaires pour effectuer les essais expérimentaux en aval, ce qui est décrit plus en détail dans la section de discussion. Les HARV sont faits de polycarbonate et comprennent une membrane d’oxygénation en silicone pour permettre l’échange gazeux pendant la culture cellulaire. Cela maintient le pH du milieu cellulaire et permet une respiration cellulaire efficace. Il y a un orifice de remplissage principal et deux orifices de seringue bouchés sur la face du navire (figure 2A). Après le chargement de la culture cellulaire par l’orifice de remplissage principal, deux seringues sont chargées sur le récipient pour aider à l’élimination des bulles. Lors de l’utilisation des vaisseaux de 10 mL, deux seringues de 3 mL fonctionnent bien. Une seringue est fixée au dispositif vide, la seringue est complètement enfoncée et l’autre est fixée remplie de 3 mL de culture cellulaire (figure 2E). Ceux-ci sont utilisés en combinaison pour éliminer les bulles du récipient, ce qui est important pour maintenir le traitement SMG. En général, il est conseillé de mettre en place deux contrôles négatifs, que l’on peut appeler le contrôle « Flask » et le contrôle « 1G ». Le témoin « Flask » correspond aux cellules cultivées dans un ballon de culture cellulaire en suspension standard T25. Le contrôle 1G correspond aux cellules qui sont cultivées dans le récipient de culture spécialisé de 10 mL, qui est simplement placé dans l’incubateur (c’est-à-dire sans être soumis au traitement SMG). Veuillez consulter la section Discussion pour plus de détails sur les contrôles.
La méthode décrite ici convient à tout chercheur cherchant à étudier les effets du SMG sur les lymphocytes, en mettant l’accent sur les cellules NK en utilisant la lignée cellulaire NK9213. Les résultats de ces études pourraient nous aider à mieux comprendre et atténuer les effets néfastes des vols spatiaux sur le système immunitaire humain.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>D-410</td>
			<td>Gamma sterilized culture vessels (4/box)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok tip syringes (3 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>For attaching to the 10 mL HARVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92 Cell-line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4D</td>
			<td>Rotating wall vessel device; 2D clinostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 suspension culture flasks</td>
			<td>Sarsedt</td>
			<td>83.3910.502</td>
			<td>For flask control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system

Compte tenu des limites actuelles de la recherche biologique dans l’espace, il existe quelques options pour soumettre la culture cellulaire à la microgravité simulée (SMG) sur Terre. Ces options varient dans leurs méthodes, leurs principes et leur aptitude à être utilisées avec la culture cellulaire en suspension. Ici, une méthode de culture cellulaire est décrite pour soumettre les lymphocytes à une microgravité simulée à l’aide d’un système de culture cellulaire rotative disponible dans le commerce, également connu sous le nom de clinostat 2D ou de dispositif de récipient à paroi rotative (RWV). Cette méthode de culture cellulaire utilise le principe de l’annulation du vecteur de gravité moyenné dans le temps pour simuler la microgravité en faisant tourner les cellules sur un axe horizontal. Les cellules cultivées dans ce système peuvent être récoltées et utilisées dans de nombreux tests expérimentaux différents pour évaluer les effets de la microgravité simulée sur la fonction cellulaire et la physiologie. La technique de culture peut varier légèrement selon le type de cellule ou la lignée utilisée, mais la méthode décrite ici peut être appliquée à toute culture cellulaire de type suspension.

Cette méthode de culture est considérée comme efficace si 1) la prolifération des cellules est approximativement constante dans tous les groupes témoins (et idéalement dans tous les groupes expérimentaux), 2) la prolifération est appropriée compte tenu de la densité d’ensemencement, de la durée du traitement et du temps de doublement du type ou de la lignée cellulaire, et 3) la viabilité des cellules récoltées est de 85 % ou plus (tableau 1). ). Idéalement, les cellules résultantes dev...

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Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System

Il s’agit d’un guide étape par étape pour l’utilisation d’un système de culture cellulaire rotative disponible dans le commerce pour cultiver des lymphocytes en microgravité simulée à l’aide de récipients de culture jetables spécialisés. Cette méthode de culture peut être appliquée à toute culture cellulaire de type suspension.

Culture de lymphocytes en microgravité simulée à l’aide d’un système de culture cellulaire rotatif

Given the current limitations of conducting biological research in space, a few options exist for subjecting cell culture to simulated microgravity (SMG) ...

Cette technique nous permet d’étudier les effets de la microgravité simulée sur les cellules immunitaires pour nous aider à mieux comprendre comment les aspects de l’environnement spatial affectent la physiologie humaine au niveau moléculaire. Cette technique est économiquement réalisable et est relativement facile à mettre en place et à entretenir par rapport à l’envoi de cultures cellulaires dans l’espace ou à d’autres méthodes de soumission de la culture cellulaire à la microgravité simulée sur Terre. Il est recommandé d’aller lentement pendant le remplissage des récipients afin d’éviter les débordements et les déversements.Après le retrait initial des bulles, assurez-vous que les vaisseaux sont complètement pleins à l’aide des seringues. Cela minimisera les risques de formation de grosses bulles tout au long du traitement. Commencez par retirer les récipients de culture de l’emballage en plastique.Étiquetez chaque récipient sur le bord en fonction du type de cellule ou de la lignée utilisée, qu’il s’agisse du témoin ou du traitement, et de toute autre information pertinente. Stabilisez le récipient et ouvrez l’orifice de remplissage avec précaution sans toucher la cheville du bouchon de l’orifice de remplissage ou le joint torique. Placez le bouchon sur un tampon d’éthanol avec la cheville ou le joint torique vers le haut pendant que le récipient est rempli.Ne retirez pas les capuchons des orifices de la seringue. Charger le récipient avec 10 mL du milieu complet approprié pour la culture cellulaire à l’aide d’une pipette sérologique stérile et placer soigneusement le bouchon sur l’orifice de remplissage. Assurez-vous que les bouchons de l’orifice de la seringue et l’orifice de remplissage sont bien fermés.Ensuite, placez les récipients remplis dans un incubateur tout en effectuant les étapes suivantes pour amorcer les vaisseaux pour la culture cellulaire. Récupérez les récipients amorcés du média de l’incubateur. Pour un témoin en fiole, charger une fiole de culture en suspension T25 avec 10 mL de culture cellulaire provenant du stock préparé ci-dessus.Ajouter 10 mL de culture cellulaire mère dans un tube conique séparé de 15 mL, qui sera utilisé pour charger les seringues. Dévissez les bouchons d’orifice de la seringue pour les retirer du navire et vous assurer que les robinets d’arrêt d’origine sont en position ouverte. Stabilisez le récipient et ouvrez l’orifice de remplissage avec précaution sans toucher la cheville du bouchon de l’orifice de remplissage ou le joint torique.Placez le bouchon sur un tampon d’éthanol avec la cheville ou le joint torique vers le haut pendant que le récipient est rempli. Assurez-vous que les robinets d’arrêt sont en position ouverte. Le récipient peut être vidé en versant le fluide du récipient dans un conteneur à déchets à l’aide d’une pipette sérologique.Vous pouvez également aspirer le média à l’aide d’un verre stérile au-delà de votre pipette fixée à un système de vide. Lorsque vous utilisez une pipette ou le système de vide, assurez-vous de ne pas toucher la membrane d’oxygénation, car cela pourrait l’endommager et rendre le récipient inutilisable. Fermez hermétiquement le tube conique de 50 ml contenant la culture cellulaire mère préparée et retournez-le doucement plusieurs fois pour bien mélanger le contenu.Prélever 10 mL de stock de culture cellulaire à partir du tube de 50 ml avec une pipette sérologique fraîchement stérile. Ramassez le récipient et inclinez-le, de sorte que l’orifice de remplissage soit vers le haut. Ensuite, distribuez soigneusement le stock de culture cellulaire dans le récipient par l’orifice de remplissage.Remplissez le récipient jusqu’à l’extrémité de l’orifice de remplissage, tout en inclinant le récipient vers le bas pour éviter les déversements. Attention à ne pas toucher la membrane d’oxygénation avec la pipette car elle est très fragile. Une fois le navire chargé, remettez soigneusement le bouchon de l’orifice de remplissage sans toucher le joint torique.Retirez la première seringue de 3 ml de son emballage et pompez-la plusieurs fois pour la desserrer. Ensuite, fixez la seringue à l’un des orifices de la seringue, en vous assurant que la seringue est complètement enfoncée. Fermez hermétiquement le tube conique de 15 mL contenant 10 mL de culture cellulaire aliquote et retournez-le doucement plusieurs fois pour bien mélanger le contenu.De même, retirez la deuxième seringue de 3 mL de son emballage et pompez-la plusieurs fois. Ensuite, semi immergé soigneusement cette seringue dans la culture cellulaire à partir du tube conique de 15 ml et prélever une culture. Minimisez les bulles d’air en redistribuant entièrement la seringue dans le tube et en aspirant 3 ml de culture.Fixez la seringue remplie au port de seringue restant et désinfectez soigneusement les seringues et autour de l’orifice de remplissage avec un tampon d’éthanol. Ne pas mettre d’éthanol sur la membrane d’oxygénation. Répétez le processus pour les navires restants.S’il reste une culture cellulaire légèrement insuffisante dans le tube conique de 50 ml pour le dernier vaisseau, récupérez la quantité restante du tube conique de 15 ml utilisé pour charger les seringues. Assurez-vous que les robinets d’arrêt de l’orifice de la seringue sont fermés pour limiter la migration des cellules et des bulles des seringues dans les vaisseaux. Retournez le récipient à l’envers et frappez-le plusieurs fois sur le côté pour recueillir les bulles initiales.Retournez rapidement le navire vers l’arrière, puis sur un léger angle vers l’extérieur, de sorte que les bulles flottent toutes vers le haut du navire. Manœuvrez les bulles sous le port avec la seringue vide et regardez-les commencer à entrer dans le port. Ouvrez les deux robinets d’arrêt de l’orifice de la seringue.Frappez doucement le récipient pour encourager les bulles à flotter dans la seringue vide. Aspirez lentement les grosses bulles avec la seringue vide tout en appuyant soigneusement sur la seringue pleine pour maintenir la pression dans le récipient, de sorte que la membrane d’oxygénation n’éclate pas. Répétez ce processus plusieurs fois pour vous assurer que toutes les bulles sont éliminées.Lorsque les bulles ont été efficacement éliminées, fermez les robinets d’arrêt de l’orifice de la seringue. Gardez les seringues pendant le traitement pour permettre l’élimination ultérieure des bulles, en veillant à ce que le volume dans les deux seringues soit approximativement égal. Essuyez soigneusement la surface de la base rotative et du câble ruban avec de l’éthanol à 70%.Assurez-vous que le câble ruban est connecté au bloc d’alimentation. Placez la base rotative dans l’incubateur et fixez le câble ruban à la base. Placez le bloc d’alimentation à proximité, mais à l’extérieur de l’incubateur.Fixez la cuve de traitement SMG en alignant les filetages de la cuve à la cheville rotative et en tournant doucement la cheville rotative sur la base dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Assurez-vous que le navire est bien attaché. Maintenez l’incubateur à environ 100% d’humidité en remplissant le bac à eau avec de l’eau autoclave RO.Ajustez la vitesse de rotation de l’incubateur pour qu’elle corresponde à la vitesse de sédimentation des cellules, de sorte que les cellules ne tombent pas à travers le milieu. Le premier jour de la mise en place du traitement, vérifiez la formation de bulles toutes les quelques heures, comme décrit dans le manuscrit du texte. Retirez les bulles au moins une fois par jour jusqu’à la fin de la durée de traitement souhaitée.Une fois la durée de traitement prévue écoulée, arrêtez la rotation et démontez l’appareil. Retirez le récipient de traitement en maintenant doucement le récipient immobile tout en tournant la cheville rotative de l’appareil dans le sens des aiguilles d’une montre. Amener la fiole de contrôle, la force de contrôle et le récipient traité dans une enceinte de sécurité biologique stérile.Prenez chaque récipient à l’exception de la fiole de commande et retournez-le de manière à ce qu’il soit orienté vers le bas. Puis frappez-le doucement pour mettre toutes les cellules en suspension. Ensuite, tournez le récipient sur le côté avec l’orifice de remplissage vers le bas et frappez-le à nouveau pour guider les cellules vers l’orifice de remplissage pour une aspiration efficace.Manipulez chaque navire individuellement. Dévissez les seringues des deux orifices et distribuez-les dans les déchets présentant un risque biologique. Ouvrez les robinets d’arrêt des orifices de seringue.Retirez délicatement le bouchon de l’orifice de remplissage et aspirez le contenu à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 mL, en inclinant le récipient lorsqu’il est vidé. Distribuer le contenu de tous les groupes témoins et de traitement dans des tubes coniques de 15 mL étiquetés individuellement. Fermez chaque tube et retournez-les doucement plusieurs fois pour vous assurer qu’ils sont bien mélangés.Utiliser la méthode préférée pour déterminer la concentration et la viabilité de la culture cellulaire résultante afin de se préparer aux essais expérimentaux ultérieurs. La viabilité initiale et les densités de sièges de la lignée cellulaire NK-92 ont été comparées à la viabilité finale et aux concentrations terminales résultantes. Après un traitement SMG de 72 heures, deux cas de résultats négatifs et positifs ont été comparés.À titre de comparaison, la plage de concentration optimale de la lignée cellulaire NK-92 utilisée était comprise entre 0,3 et 1,2 million de cellules par millilitre avec un temps de doublement d’environ deux à trois jours. La prolifération dans le groupe de traitement SMG était approximativement égale dans les groupes témoins et de traitement. Ces paramètres étaient essentiels pour le succès expérimental en aval et les cellules résultantes des deux groupes témoins ont donné des résultats similaires dans les essais expérimentaux en aval.Il est crucial de surveiller et de tenir compte de la formation de bulles tout au long du traitement, en particulier dans la culture cellulaire soumise à une microgravité simulée. La formation de grosses bulles peut perturber la dynamique des fluides à l’intérieur du récipient, ce qui annulera essentiellement la condition de microgravité simulée.

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