Name: culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system
Uploaded: 2022-08-25T12:30:00
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Diese Arbeit wird von der Canadian Space Agency (CSA) mit einem Forschungsstipendium (17ILSRA3, Immuno Profile) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Roxanne Fournier (University of Toronto), Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial University) und Preteesh Mylabathula (University of Arizona) für ihre Hilfe bei der anfänglichen Fehlerbehebung dieses Protokolls.

Anmerkungen: Die folgenden Schritte sollten in einer sterilen biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.
1. Vorbereitung von Gefäßen für die Zellkultur
<ol><li>Nehmen Sie die Kulturgefäße aus der Plastikverpackung. Beschriften Sie jedes Gefäß am Rand entsprechend dem verwendeten Zelltyp/der Zelllinie, ob es sich um die Kontrolle (1G) oder die Behandlung (SMG) handelt, und alle anderen relevanten Informationen.</li>
	<li>Stabilisieren Sie das Gefäß und ö...

<ol>
	<li>ElGindi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+the+force+be+with+you+(or+not):+the+immune+system+under+microgravity.">May the force be with you (or not): the immune system under microgravity.</a> Cells. 10 (8), 1941 (2021).</li><li>Chouk&#232;r, A., Ullrich, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).</li><li>Crucian, B. 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M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+NK-92+cells+for+refractory+hematological+malignancies+relapsing+after+autologous+hematopoietic+cell.">A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell.</a> Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).</li><li>Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol">https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol</a> (2022)</li><li>Counting cells using a hemocytometer. 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L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+attachment-independent+biofilm+formation+and+repression+of+hfq+expression+by+low-fluid-shear+culture+of+Staphylococcus+aureus.">Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).</li><li>Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air+bubble-isolating+rotating+wall+vessel+bioreactor+for+improved+spheroid/organoid+formation.">An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).</li></ol>

Während sich die Menschheit auf längere Weltraummissionen zu Mond und Mars vorbereitet, muss mehr Forschung betrieben werden, um ernsthafte Gesundheitsrisiken bei Astronauten zu mindern. Ein wichtiger Aspekt der Weltraumumgebung, der sich auf die menschliche Physiologie auswirkt, ist die Schwerelosigkeit. Hier wurde ein Zellkulturverfahren beschrieben, um Lymphozyten mit einem kommerziell erhältlichen rotierenden Zellkultursystem einem SMG zu unterziehen.
Dieses Protokoll enthält einige wi...

Es hat sich gezeigt, dass die Raumfahrt viele Aspekte der menschlichen Physiologie beeinflusst, einschließlich des Immunsystems. Viele Studien haben Hinweise auf eine Fehlregulation des Immunsystems als Folge von Raumflügen in vivo und Exposition gegenüber simulierter Schwerelosigkeit (SMG) in vitro gezeigt 1,2,3,4. Ein wichtiger Aspekt der Weltraumumgebung, der sich auf die menschliche Physiologie auswirkt, ist die Schwerelosigkeit. Mikrogravitation bezieht sich auf die "Schwerelosigkeit", die aufgrund geringer Gravitationskräfte in der Weltraumumgebung erlebtwird 5. Während sich die Menschheit auf längere Weltraummissionen zu Mond und Mars vorbereitet, muss mehr Forschung betrieben werden, um ernsthafte Gesundheitsrisiken bei Astronauten zu mindern.
Echte Schwerelosigkeitsbedingungen für die wissenschaftliche Forschung können im Weltraum an Bord der Internationalen Raumstation (ISS) oder in Nanosatelliten, die in den Orbit gebracht werden, erreicht werden. Diese Optionen können jedoch unglaublich kostspielig und komplex in der Orchestrierung sein. Angesichts der derzeitigen Einschränkungen der biologischen Forschung im Weltraum gibt es mehrere Möglichkeiten, echte Schwerelosigkeit und SMG auf der Erde zu induzieren. Es gibt groß angelegte Operationen, die kurze Perioden echter Schwerelosigkeit auf der Erde erzeugen können, darunter Falltürme, Parabelflüge und Höhenforschungsraketen. Diese Methoden sind jedoch nicht übermäßig geeignet, um die Auswirkungen der Schwerelosigkeit auf biologische Systeme zu untersuchen, was vor allem auf ihre kurzen Zeiträume der Mikrogravitationsbehandlung (d. h. Sekunden bis 20 Minuten) zurückzuführen ist. Diese Methoden werden an anderer Stelle ausführlicher erörtert 5,6. Zu den Optionen, die für die biologische Zellkultur geeignet sind, gehören kleine Geräte wie 2D-Klinostate oder RWV-Geräte (Rotating Wall Vessel) und 3D-Klinostate oder Zufallspositioniermaschinen (RPM). Diese Geräte können in Zellkulturinkubatoren bei 37 °C und 5 % CO2 aufgestellt werden und drehen die Zellkultur entweder um eine horizontale Achse (2D) oder um zwei senkrechte Achsen (3D)5. Es ist jedoch wichtig zu betonen, dass diese Kultivierungsmethoden SMG erzeugen, im Gegensatz zur echten Schwerelosigkeit, die im Weltraum für biologische Forschungskontexte am besten erreicht werden kann.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Schritte zur Subvention von Lymphozyten mit SMG unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen RWV-Geräts (Table of Materials) zu skizzieren, das unter die 2D-Klinostat-Klassifikation fällt. Während es vom Hersteller ein allgemeines Protokoll für den Betrieb dieses Geräts gibt, zielt der aktuelle Artikel darauf ab, die Schritte zur Fehlerbehebung und Optimierung genauer zu behandeln. Dieser Artikel behandelt auch die Theorie hinter der Funktionsweise dieses Geräts zur Herstellung von SMG in Suspensionszellkultur, insbesondere mit Lymphozyten. Suspensionszellkultur bezieht sich in diesem Zusammenhang auf Zellen, die in supplementierten Nährmedien frei wachsen, ohne an einem zusätzlichen Gerüst zu haften. Viele Zelltypen werden in Suspensionszellkultur gezüchtet, darunter auch Lymphozyten. Lymphozyten sind Zellen des Immunsystems, einschließlich T-, B- und natürlicher Killerzellen (NK), die sich in lymphatischen Organen und im Blutkreislauf befinden7.
Der hier beschriebene RWV-2D-Klinostat arbeitet nach dem Prinzip der zeitlich gemittelten Gravitationsvektor-Nullifikation 5,6,8,9, wobei der Gravitationsvektor durch Rotation der Zellkultur um eine horizontale Achse randomisiert wird. Dies wird erreicht, indem die Rotationsgeschwindigkeit des Kulturgefäßes an die Sedimentationsgeschwindigkeit der Zellen angepasst wird. Solange die Rotationsgeschwindigkeit des Kulturgefäßes gut auf die Sedimentationsgeschwindigkeit der Zellen abgestimmt ist, bleiben die Zellen im freien Fall und können nicht sedimentieren, wie es in der Weltraumumgebung der Fall ist. Nach einer anfänglichen Beschleunigungsphase erreicht das Medium im Kulturgefäß schließlich mit der Zeit eine "Festkörperrotation". Diese horizontale Rotation induziert auch eine laminare Strömung im Zellkulturgefäß. Dadurch entsteht eine "scherarme" Umgebung, da die Scherspannung, die durch laminare Strömung auf die Zellen induziert wird, viel geringer ist als die der turbulenten Strömung. Da der Klinostat jedoch kein perfektes System ist, gibt es einige kleine, laminare Flüssigkeitsbewegungen, die eine minimale Scherspannung auf die Zellen ausüben. So werden die im Medium schwebenden Zellen bei der Rotation von dieser Strömung mitgerissen. Während der horizontalen Rotation wirkt der Schwerkraftvektor auf die Zellen und bringt sie in eine oszillierende Bahn, wie in Abbildung 1 dargestellt. Eine weitere kleine Quelle der Scherspannung wird dadurch verursacht, dass die Zellen durch das Medium "fallen" und eine laminare Strömung um die Zellen herum verursachen. Wenn sich das Kulturgefäß um eine horizontale Achse dreht, dreht sich auch der Schwerkraftvektor, den die Zellen erfahren. Im Laufe der Zeit wird dieser rotierende Schwerkraftvektor gemittelt, um gegen Null zu gehen. Dieses Phänomen wird als zeitgemittelte Gravitationsvektor-Nullifikation bezeichnet und induziert einen Zustand vonSMG 5,6,8,9. Dieses Gerät wurde verwendet, um die Auswirkungen von SMG auf viele Zelltypen zu untersuchen, von denen einige in den Referenzen10, 11, 12 behandelt werden. Weitere Beispiele finden Sie auf der Website des Geräteherstellers.
Dieses RWV-Gerät verwendet spezielle "High Aspect Ratio Vessels" (HARVs), die über den Gerätehersteller erhältlich sind. Diese HARVs fassen jeweils 10 ml Zellkultur; Es sind jedoch auch 50-ml-HARVs erhältlich. Es können entweder 10-ml- oder 50-ml-HARVs verwendet werden, je nachdem, wie viele Zellen benötigt werden, um nachgeschaltete experimentelle Assays durchzuführen, was im Abschnitt "Diskussion" näher erläutert wird. Die HARVs bestehen aus Polycarbonat und verfügen über eine Silikon-Oxygenierungsmembran, um den Gasaustausch während der Zellkultur zu ermöglichen. Dadurch wird der pH-Wert des Zellmediums aufrechterhalten und eine effiziente Zellatmung ermöglicht. An der Vorderseite des Gefäßes befinden sich eine Hauptfüllöffnung und zwei Spritzenöffnungen mit Verschluss (Abbildung 2A). Nachdem die Zellkultur durch die Hauptfüllöffnung geladen wurde, werden zwei Spritzen auf das Gefäß geladen, um die Blasenentfernung zu unterstützen. Bei Verwendung der 10-ml-Gefäße funktionieren zwei 3-ml-Spritzen gut. Eine Spritze wird leer auf das Gerät aufgesteckt, wobei die Spritze vollständig niedergedrückt ist, und die andere wird mit 3 ml Zellkultur gefüllt (Abbildung 2E). Diese werden in Kombination verwendet, um Blasen aus dem Gefäß zu entfernen, was für die Aufrechterhaltung der SMG-Behandlung wichtig ist. Im Allgemeinen wird empfohlen, zwei Negativkontrollen einzurichten, die als "Flask"-Kontrolle und "1G"-Kontrolle bezeichnet werden können. Die "Flask"-Kontrolle entspricht Zellen, die in einem Standard-T25-Suspensionszellkulturkolben gezüchtet werden. Die 1G-Kontrolle entspricht Zellen, die in dem speziellen 10-ml-Kulturgefäß gezüchtet werden, das einfach in den Inkubator gelegt wird (d. h. ohne SMG-Behandlung). Weitere Informationen zu den Steuerelementen finden Sie im Abschnitt "Diskussion".
Die hier beschriebene Methode eignet sich für jeden Forscher, der die Auswirkungen von SMG auf Lymphozyten untersuchen möchte, mit besonderem Fokus auf NK-Zellen unter Verwendung der NK92-Zelllinie13. Die Ergebnisse dieser Studien könnten uns helfen, die negativen Auswirkungen der Raumfahrt auf das menschliche Immunsystem besser zu verstehen und abzumildern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>D-410</td>
			<td>Gamma sterilized culture vessels (4/box)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok tip syringes (3 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>For attaching to the 10 mL HARVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92 Cell-line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4D</td>
			<td>Rotating wall vessel device; 2D clinostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 suspension culture flasks</td>
			<td>Sarsedt</td>
			<td>83.3910.502</td>
			<td>For flask control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system

Angesichts der derzeitigen Einschränkungen der biologischen Forschung im Weltraum gibt es einige Möglichkeiten, Zellkulturen auf der Erde einer simulierten Schwerelosigkeit (SMG) auszusetzen. Diese Optionen unterscheiden sich in ihren Methoden, Prinzipien und ihrer Eignung für die Verwendung mit Suspensionszellkulturen. In dieser Arbeit wird ein Zellkulturverfahren beschrieben, bei dem Lymphozyten unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen rotierenden Zellkultursystems, auch bekannt als 2D-Klinostat oder Rotating Wall Vessel (RWV)-Gerät, einer simulierten Schwerelosigkeit ausgesetzt werden. Diese Zellkulturmethode nutzt das Prinzip der zeitgemittelten Gravitationsvektoraufhebung, um die Schwerelosigkeit zu simulieren, indem die Zellen um eine horizontale Achse gedreht werden. Die in diesem System kultivierten Zellen können geerntet und in vielen verschiedenen experimentellen Assays verwendet werden, um die Auswirkungen der simulierten Schwerelosigkeit auf die zelluläre Funktion und Physiologie zu bewerten. Die Kultivierungstechnik kann je nach verwendetem Zelltyp oder Zelllinie leicht variieren, aber die hier beschriebene Methode kann auf jede Suspensionszellkultur angewendet werden.

Diese Kultivierungsmethode gilt als erfolgreich, wenn 1) die Proliferation der Zellen in allen Kontrollgruppen (und idealerweise in allen Versuchsgruppen) annähernd konsistent ist, 2) die Proliferation angesichts der Aussaatdichte, der Behandlungsdauer und der Verdopplungszeit des Zelltyps/der Zelllinie angemessen ist und 3) die Lebensfähigkeit der geernteten Zellen 85 % oder mehr beträgt (Tabelle 1 ). Idealerweise sollten die resultierenden Zellen so gesund sein wie in einer Standardzellkultur, insbe...

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Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System

Dies ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Verwendung eines kommerziell erhältlichen rotierenden Zellkultursystems zur Kultivierung von Lymphozyten in simulierter Schwerelosigkeit mit speziellen Einweg-Kulturgefäßen. Diese Kultivierungsmethode kann auf jede Suspensionszellkultur angewendet werden.

Kultivierung von Lymphozyten in simulierter Schwerelosigkeit mit einem rotierenden Zellkultursystem

Given the current limitations of conducting biological research in space, a few options exist for subjecting cell culture to simulated microgravity (SMG) ...

Diese Technik ermöglicht es uns, die Auswirkungen der simulierten Schwerelosigkeit auf Immunzellen zu untersuchen, um besser zu verstehen, wie sich Aspekte der Weltraumumgebung auf die menschliche Physiologie auf molekularer Ebene auswirken. Diese Technik ist wirtschaftlich machbar und relativ einfach einzurichten und zu warten, verglichen mit der Entsendung von Zellkulturen in den Weltraum oder anderen Methoden, bei denen Zellkulturen auf der Erde simulierter Schwerelosigkeit ausgesetzt werden. Es wird empfohlen, beim Befüllen der Gefäße langsam vorzugehen, um ein Überlaufen und Verschütten zu vermeiden.Stellen Sie nach dem ersten Entfernen der Blase sicher, dass die Gefäße vollständig gefüllt sind, indem Sie die Spritzen verwenden. Dadurch wird die Wahrscheinlichkeit einer großen Blasenbildung während der gesamten Behandlung minimiert. Nehmen Sie zunächst die Kulturgefäße aus der Plastikverpackung.Beschriften Sie jedes Gefäß am Rand entsprechend dem verwendeten Zelltyp oder der verwendeten Linie, ob es sich um die Kontrolle oder Behandlung handelt, und nach anderen relevanten Informationen. Stabilisieren Sie das Gefäß und öffnen Sie die Einfüllöffnung vorsichtig, ohne den Stift der Einfüllöffnungskappe oder den O-Ring zu berühren. Setzen Sie die Kappe mit dem Stift oder O-Ring nach oben auf ein Ethanolpad, während das Gefäß gefüllt ist.Entfernen Sie die Kappen nicht von den Spritzenanschlüssen. Befüllen Sie das Gefäß mit 10 ml des für die Zellkultur geeigneten Komplettmediums mit einer sterilen serologischen Pipette und setzen Sie die Kappe vorsichtig auf die Einfüllöffnung. Stellen Sie sicher, dass die Kappen der Spritzenöffnung und die Einfüllöffnung sicher verschlossen sind.Legen Sie dann die gefüllten Gefäße in einen Inkubator, während Sie die folgenden Schritte durchführen, um die Gefäße für die Zellkultur vorzubereiten. Entnehmen Sie die mediengrundierten Gefäße aus dem Inkubator. Für eine Kolbenkontrolle wird ein T25-Suspensionskulturkolben mit 10 ml Zellkultur aus dem oben vorbereiteten Bestand geladen.Geben Sie 10 ml der Stammzellkultur in ein separates konisches 15-ml-Röhrchen, das zum Laden der Spritzen verwendet wird. Schrauben Sie die Spritzenanschlusskappen ab, um sie aus dem Gefäß zu entfernen, und stellen Sie sicher, dass sich die serienmäßigen Absperrhähne in der geöffneten Position befinden. Stabilisieren Sie das Gefäß und öffnen Sie die Einfüllöffnung vorsichtig, ohne den Stift der Einfüllöffnungskappe oder den O-Ring zu berühren.Setzen Sie die Kappe mit dem Stift oder O-Ring nach oben auf ein Ethanolpad, während das Gefäß gefüllt wird. Stellen Sie sicher, dass sich die Absperrhähne in der geöffneten Position befinden. Das Gefäß kann entleert werden, indem das Medium mit einer serologischen Pipette aus dem Gefäß in einen Abfallbehälter gegossen wird.Alternativ können Sie das Medium mit einem sterilen Glas an Ihrer Pipette vorbeisaugen, die an ein Vakuumsystem angeschlossen ist. Achten Sie bei der Verwendung einer Pipette oder des Vakuumsystems darauf, die Sauerstoffmembran nicht zu berühren, da dies diese beschädigen und das Gefäß unbrauchbar machen könnte. Verschließen Sie das konische 50-ml-Röhrchen mit der vorbereiteten Stammzellkultur fest und drehen Sie es einige Male vorsichtig um, um den Inhalt gründlich zu mischen.Ziehen Sie 10 ml Zellkulturvorrat aus dem 50-ml-Röhrchen mit einer frischen, sterilen serologischen Pipette auf. Nehmen Sie das Gefäß auf und kippen Sie es so, dass die Einfüllöffnung nach oben zeigt. Anschließend die Zellkulturbrühe vorsichtig durch die Einfüllöffnung in das Gefäß dosieren.Füllen Sie das Gefäß bis zur Spitze der Einfüllöffnung und kippen Sie das Gefäß wieder nach unten, um ein Verschütten zu vermeiden. Achten Sie darauf, die Sauerstoffmembran nicht mit der Pipette zu berühren, da diese sehr zerbrechlich ist. Sobald das Gefäß beladen ist, setzen Sie die Kappe der Einfüllöffnung vorsichtig wieder auf, ohne den O-Ring zu berühren.Nehmen Sie die erste 3-ml-Spritze aus der Verpackung und pumpen Sie sie einige Male, um sie zu lösen. Befestigen Sie dann die Spritze an einem der Spritzenanschlüsse und achten Sie darauf, dass die Spritze vollständig niedergedrückt ist. Verschließen Sie das konische 15-ml-Röhrchen mit 10 ml aliquoter Zellkultur fest und drehen Sie es einige Male vorsichtig um, um den Inhalt gründlich zu mischen.Nehmen Sie die zweite 3-ml-Spritze ebenfalls aus der Verpackung und pumpen Sie sie einige Male ab. Tauchen Sie diese Spritze dann vorsichtig halb in die Zellkultur aus dem konischen 15-ml-Röhrchen ein und ziehen Sie etwas Kultur auf. Minimieren Sie Luftblasen, indem Sie die Spritze vollständig zurück in das Röhrchen geben und 3 ml Kultur aufziehen.Befestigen Sie die gefüllte Spritze an der verbleibenden Spritzenöffnung und desinfizieren Sie die Spritzen vorsichtig und um die Füllöffnung herum mit einem Ethanolpad. Bringen Sie kein Ethanol auf die Sauerstoffversorgungsmembran. Wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Gefäße.Wenn im konischen 50-ml-Röhrchen für das letzte Gefäß noch eine etwas unzureichende Zellkultur vorhanden ist, gewinnen Sie die verbleibende Menge aus dem konischen 15-ml-Röhrchen zurück, das zum Laden der Spritzen verwendet wurde. Stellen Sie sicher, dass die Absperrhähne der Spritzenöffnungen geschlossen sind, um die Migration von Zellen und Blasen aus den Spritzen in die Gefäße zu begrenzen. Drehen Sie das Gefäß auf den Kopf und schlagen Sie ein paar Mal auf die Seite, um die ersten Blasen einzusammeln.Drehen Sie das Gefäß schnell wieder nach oben und dann in einem leichten Winkel nach weg, so dass die Blasen alle nach oben schwimmen. Manövrieren Sie die Blasen mit der leeren Spritze unter den Anschluss und beobachten Sie, wie sie beginnen, in den Anschluss einzudringen. Öffnen Sie beide Absperrhähne der Spritzenöffnungen.Schlagen Sie vorsichtig auf das Gefäß, damit die Blasen in die leere Spritze aufsteigen können. Saugen Sie die größeren Blasen langsam mit der leeren Spritze auf, während Sie die volle Spritze vorsichtig nach unten drücken, um den Druck im Gefäß aufrechtzuerhalten, damit die Sauerstoffmembran nicht platzt. Wiederholen Sie diesen Vorgang einige Male, um sicherzustellen, dass alle Blasen entfernt sind.Wenn die Blasen effektiv entfernt wurden, schließen Sie die Absperrhähne der Spritzenöffnungen. Lassen Sie die Spritzen während der Behandlung an, um eine spätere Blasenentfernung zu ermöglichen, und stellen Sie sicher, dass das Volumen in beiden Spritzen ungefähr gleich ist. Wischen Sie die Oberfläche des rotierenden Sockels und des Flachbandkabels vorsichtig mit 70%igem Ethanol ab.Stellen Sie sicher, dass das Flachbandkabel an das Netzteil angeschlossen ist. Legen Sie den drehbaren Sockel in den Inkubator und befestigen Sie das Flachbandkabel am Sockel. Platzieren Sie das Netzteil in der Nähe, aber außerhalb des Inkubators.Befestigen Sie das SMG-Behandlungsgefäß, indem Sie die Gefäßgewinde am rotierenden Stift ausrichten und den rotierenden Stift vorsichtig gegen den Uhrzeigersinn auf dem Sockel drehen. Stellen Sie sicher, dass das Gefäß sicher befestigt ist. Halten Sie den Inkubator bei ca. 100 % Luftfeuchtigkeit, indem Sie die Wasserschale mit autoklaviertem RO-Wasser füllen.Passen Sie die Rotationsgeschwindigkeit des Inkubators an die Sedimentationsgeschwindigkeit der Zellen an, damit die Zellen nicht durch das Medium fallen. Kontrollieren Sie am ersten Tag der Behandlung alle paar Stunden die Blasenbildung, wie im Textmanuskript beschrieben. Entfernen Sie die Blasen mindestens einmal täglich bis zum Ende der gewünschten Behandlungsdauer.Sobald die geplante Behandlungslänge abgelaufen ist, stoppen Sie die Rotation und zerlegen Sie das Gerät. Entfernen Sie das Behandlungsgefäß, indem Sie das Gefäß vorsichtig stationär halten, während Sie den Drehzapfen des Geräts im Uhrzeigersinn drehen. Bringen Sie den Kontrollkolben, das Kontrollgefäß und das behandelte Gefäß in eine sterile biologische Sicherheitswerkbank.Nehmen Sie jedes Gefäß mit Ausnahme des Kontrollkolbens und drehen Sie es so, dass es nach unten zeigt. Schlagen Sie dann vorsichtig darauf, um alle Zellen in Suspension zu bringen. Drehen Sie dann das Gefäß mit der Einfüllöffnung nach unten auf die Seite und schlagen Sie erneut darauf, um die Zellen zur Einfüllöffnung zu führen, um eine effiziente Aspiration zu gewährleisten.Behandeln Sie jedes Gefäß einzeln. Schrauben Sie die Spritzen von den beiden Anschlüssen ab und geben Sie sie in den biologisch gefährlichen Abfall. Öffnen Sie die Absperrhähne an den Spritzenöffnungen.Entfernen Sie vorsichtig die Kappe der Einfüllöffnung und ziehen Sie den Inhalt mit einer sterilen serologischen 10-ml-Pipette auf, wobei Sie das Gefäß beim Entleeren kippen. Dosieren Sie den Inhalt aller Kontroll- und Behandlungsgruppen in einzeln beschriftete konische 15-ml-Röhrchen. Schließen Sie jedes Röhrchen und drehen Sie es einige Male vorsichtig um, um sicherzustellen, dass sie richtig gemischt sind.Verwenden Sie die bevorzugte Methode zur Bestimmung der Konzentration und Lebensfähigkeit der resultierenden Zellkultur, um sich auf nachfolgende experimentelle Assays vorzubereiten. Die Startviabilität und die Sitzdichten der NK-92-Zelllinie wurden mit der resultierenden Endviabilität und den Endkonzentrationen verglichen. Nach einer 72-stündigen SMG-Behandlung wurden zwei Fälle von negativen und positiven Ergebnissen verglichen.Zum Vergleich: Der optimale Konzentrationsbereich der verwendeten Zelllinie NK-92 lag zwischen 0,3 und 1,2 Millionen Zellen pro Milliliter mit einer Verdopplungszeit von etwa zwei bis drei Tagen. Die Proliferation in der SMG-Behandlungsgruppe war in der Kontroll- und der Behandlungsgruppe ungefähr gleich. Diese Parameter waren essentiell für den Erfolg der nachgeschalteten Experimente, und die resultierenden Zellen aus den beiden Kontrollgruppen schnitten in den nachgelagerten experimentellen Assays ähnlich ab.Es ist von entscheidender Bedeutung, die Blasenbildung während des gesamten Behandlungsverlaufs zu überwachen und zu berücksichtigen, insbesondere in der Zellkultur, die simulierter Schwerelosigkeit ausgesetzt ist. Die Bildung großer Blasen kann zu einer Störung der Fluiddynamik im Inneren des Behälters führen, wodurch die simulierte Schwerelosigkeit im Wesentlichen aufgehoben wird.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Forschung

Immunologie und Infektion

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Molekulare Diffusion in Plasmamembranen von primären Lymphozyten mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie gemessen

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die<em&gt; In Vitro</em&gt; Prophylaktische Wirkung von Interferonen

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Schnelle Quantifizierung von Mitogen-induzierte Blastogenese in T-Lymphozyten zur Identifizierung von immunmodulatorische Drogen

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...