Name: culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system
Uploaded: 2022-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי סוכנות החלל הקנדית (CSA), מענק מחקר (17ILSRA3, פרופיל חיסוני). המחברים רוצים להכיר ולהודות לד"ר רוקסן פורנייה (אוניברסיטת טורונטו), ד"ר רנדל גרג (אוניברסיטת לינקולן ממוריאל) ופרטש מילבאטולה (אוניברסיטת אריזונה) על עזרתם בפתרון הבעיות הראשוני של פרוטוקול זה.

הערה: יש להשלים את השלבים הבאים בתוך ארון בטיחות ביולוגי סטרילי.
1. הכנת כלי דם לתרבית תאים
<ol><li>הוציאו את כלי התרבות מאריזות הפלסטיק. תייגו כל כלי על השפה בהתאם לסוג התא / הקו בו נעשה שימוש, האם מדובר בבקרה (1G) או בטיפול (SMG), וכל מידע רלוונטי אחר.</li>
	<li>ייצב את הכלי ופתח ...

<ol>
	<li>ElGindi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+the+force+be+with+you+(or+not):+the+immune+system+under+microgravity.">May the force be with you (or not): the immune system under microgravity.</a> Cells. 10 (8), 1941 (2021).</li><li>Chouk&#232;r, A., Ullrich, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+system+dysregulation+during+spaceflight:+potential+countermeasures+for+deep+space+exploration+missions.">Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Countermeasures-based+improvements+in+stress,+immune+system+dysregulation+and+latent+herpesvirus+reactivation+onboard+the+International+Space+Station+-+relevance+for+deep+space+missions+and+terrestrial+medicine.">Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine.</a> Neuroscience &amp; Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).</li><li>Herranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground-based+facilities+for+simulation+of+microgravity:+organism-specific+recommendations+for+their+use,+and+recommended+terminology.">Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology.</a> Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).</li><li>Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+current+microgravity+platforms+for+space+biology+research.">Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research.</a> Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).</li><li>Murphy, K., Weaver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Janeway's Immunobiology 9th Edition. , (2016).</li><li>Dedolph, R. R., Dipert, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+gravity+stimulus+nullification+by+clinostat+rotation.">The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation.</a> Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).</li><li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+suspension+culture:+the+rotating-wall+vessel.">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).</li><li>Crabb&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+proteomic+responses+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+to+spaceflight+conditions+involve+Hfq+regulation+and+reveal+a+role+for+oxygen.">Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).</li><li>Ulbrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+simulated+and+real+microgravity+on+bone+cells+and+mesenchymal+stem+cells.">The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells.</a> BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).</li><li>Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+and+simulated+microgravity+cause+a+significant+reduction+of+key+gene+expression+in+early+T-cell+activation.">Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).</li><li>Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+cell+line+(NK-92)+with+phenotypical+and+functional+characteristics+of+activated+natural+killer+cells.">Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.</a> Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).</li><li>Williams, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+NK-92+cells+for+refractory+hematological+malignancies+relapsing+after+autologous+hematopoietic+cell.">A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell.</a> Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).</li><li>Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol">https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol</a> (2022)</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2022)</li><li>Mylabathula, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+disarms+human+NK-cells+and+inhibits+anti-tumor+cytotoxicity+in+vitro.">Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro.</a> Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+simulated+microgravity+on+primary+human+NK+cells.">Effects of simulated microgravity on primary human NK cells.</a> Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).</li><li>Shao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+effect+of+simulated+microgravity+on+the+cytotoxicity+of+NK+cells+following+the+DNA+methylation+of+NKG2D+and+the+expression+of+DAP10.">Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10.</a> Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).</li><li>Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+attachment-independent+biofilm+formation+and+repression+of+hfq+expression+by+low-fluid-shear+culture+of+Staphylococcus+aureus.">Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).</li><li>Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air+bubble-isolating+rotating+wall+vessel+bioreactor+for+improved+spheroid/organoid+formation.">An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).</li></ol>

ככל שהאנושות מתכוננת למשימות חלל ארוכות יותר לירח ולמאדים, יש צורך במחקר נוסף כדי להפחית סיכונים בריאותיים חמורים לאסטרונאוטים. היבט מרכזי אחד של סביבת החלל המשפיע על הפיזיולוגיה האנושית הוא מיקרו-כבידה. כאן, תוארה שיטת תרבית תאים לחשיפת לימפוציטים ל- SMG באמצעות מערכת תרבית תאים סיבובית ז...

הוכח כי טיסות לחלל משפיעות על היבטים רבים של הפיזיולוגיה האנושית, כולל מערכת החיסון. מחקרים רבים הוכיחו עדויות לחוסר ויסות חיסוני כתוצאה מטיסה לחלל in vivo וחשיפה למיקרו-כבידה מדומה (SMG) במבחנה 1,2,3,4. היבט מרכזי אחד של סביבת החלל המשפיע על הפיזיולוגיה האנושית הוא מיקרו-כבידה. מיקרו-כבידה מתייחסת ל"חוסר משקל" הנחווה עקב כוחות כבידה נמוכים בסביבת החלל5. ככל שהאנושות מתכוננת למשימות חלל ארוכות יותר לירח ולמאדים, יש צורך במחקר נוסף כדי להפחית סיכונים בריאותיים חמורים לאסטרונאוטים.
תנאי מיקרו-כבידה אמיתיים למחקר מדעי יכולים להיות מושגים בחלל על סיפון תחנת החלל הבינלאומית (ISS) או בננו-לוויינים המשוגרים למסלול; עם זאת, אפשרויות אלה יכולות להיות יקרות ומורכבות להפליא לתזמור. בהתחשב במגבלות הנוכחיות של ביצוע מחקר ביולוגי בחלל, קיימות מספר אפשרויות לגרימת מיקרו-כבידה אמיתית ו-SMG על כדור הארץ. קיימות פעולות בקנה מידה גדול שיכולות לייצר פרקי זמן קצרים של מיקרו-כבידה אמיתית על כדור הארץ, כולל מגדלי נפילה, טיסה פרבולית ורקטות קול. עם זאת, שיטות אלה אינן מתאימות יתר על המידה לחקר ההשפעות של מיקרו-כבידה על מערכות ביולוגיות, בעיקר בשל פרקי הזמן הקצרים של טיפול במיקרו-כבידה (כלומר, שניות עד 20 דקות). שיטות אלה נידונות ביתר פירוט במקומות אחרים 5,6. אפשרויות המתאימות לתרבית תאים ביולוגית כוללות התקנים בקנה מידה קטן כגון קלינוסטט דו-ממדי או התקני כלי קיר מסתובבים (RWV) וקלינוסטטים תלת-ממדיים או מכונות מיקום אקראיות (RPM). התקנים אלה יכולים להיות מוקמים בתוך אינקובטורים של תרביות תאים המתוחזקים בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2, והם מסובבים את תרבית התאים על ציר אופקי (2D) או על שני צירים ניצבים (3D)5. עם זאת, חשוב להדגיש כי שיטות גידול אלה מייצרות SMG בניגוד למיקרו-כבידה אמיתית, המושגת ביותר במרחב להקשרים של מחקר ביולוגי.
מטרת המאמר הנוכחי היא להתוות את השלבים לחשיפת לימפוציטים ל-SMG באמצעות מכשיר RWV זמין מסחרית (Table of Materials), אשר נופל תחת סיווג קלינוסטט דו-ממדי. אמנם קיים פרוטוקול כללי זמין מהיצרן להפעלת מכשיר זה, אך המאמר הנוכחי נועד לכסות את שלבי פתרון הבעיות והאופטימיזציה בפירוט רב יותר. מאמר זה מכסה גם את התיאוריה מאחורי איך המכשיר הזה עובד כדי לייצר SMG בתרבית תאי השעיה, במיוחד עם לימפוציטים. בהקשר זה, תרבית תאי תרחיף מתייחסת לתאים הגדלים בחופשיות בתרבית משלימה, ללא היצמדות לפיגומים נוספים. סוגי תאים רבים גדלים בתרבית תאי תרחיף, כולל לימפוציטים. לימפוציטים הם תאים של מערכת החיסון, כולל תאי T, B והרג טבעי (NK), השוכנים באיברי הלימפה ובזרם הדם7.
קלינוסטט RWV 2D המתואר כאן פועל על עקרון ביטול וקטור הכבידה הממוצע בזמן 5,6,8,9, לפיו וקטור הכבידה מחולק באופן אקראי באמצעות סיבוב של תרבית התא על ציר אופקי. זה מושג על ידי התאמת מהירות הסיבוב של כלי התרבית למהירות השקיעה של התאים. כל עוד מהירות הסיבוב של כלי התרבית מותאמת היטב למהירות השקיעה של התאים, התאים נשמרים בנפילה חופשית ואינם מסוגלים לשקוע, כפי שחווים בסביבת החלל. לאחר שלב ההאצה הראשוני, המדיה בכלי התרבית מגיעה בסופו של דבר ל"סיבוב גוף מוצק" לאורך זמן. סיבוב אופקי זה גורם גם לזרימה למינרית בכלי תרבית התא. זה יוצר סביבה "נמוכה גזירה", בהתחשב בכך שלחץ הגזירה המושרה על התאים על ידי זרימה למינרית הוא הרבה פחות מזה של זרימה טורבולנטית. עם זאת, בהתחשב בכך שהקלינוסטט אינו מערכת מושלמת, מוצגות כמה תנועות נוזל למינריות קטנות, אשר גורמות ללחץ גזירה מינימלי על התאים. ככאלה, התאים המרחפים במדיה נגררים על ידי זרימה זו במהלך הסיבוב. במהלך סיבוב אופקי, וקטור הכבידה פועל על התאים ומביא אותם למסלול מתנודד, כפי שניתן לראות באיור 1. מקור קטן נוסף של לחץ גזירה נגרם על ידי התאים "נופלים" דרך התקשורת, מה שגורם לזרימה למינרית סביב התאים. כאשר כלי התרבית מסתובב על ציר אופקי, וקטור הכבידה שחווים התאים מסתובב גם כן. עם הזמן, וקטור הכבידה המסתובב הזה מתקרב בממוצע לאפס; תופעה זו נקראת ביטול וקטור כבידה ממוצע זמן וגורמת למצב של SMG 5,6,8,9. מכשיר זה שימש לחקר ההשפעות של SMG על סוגים רבים של תאים, שחלקם מכוסים בהפניות10,11,12. דוגמאות נוספות ניתן למצוא באתר האינטרנט של יצרן המכשיר.
התקן RWV זה משתמש ב"כלי יחס גובה-רוחב גבוה" (HARVs) מיוחדים הזמינים דרך יצרן המכשיר. HARV אלה מחזיקים 10 מ"ל של תרבית תאים כל אחד; עם זאת, 50 מ"ל HARV זמינים גם. ניתן להשתמש ב- HARV של 10 מ"ל או 50 מ"ל בהתאם למספר התאים הדרושים כדי להשלים כל בדיקה ניסיונית במורד הזרם, המתוארת בהמשך פרק הדיון. ה-HARV עשויים מפוליקרבונט וכוללים קרום חמצון סיליקון כדי לאפשר חילופי גזים במהלך תרבית תאים. זה שומר על ה- pH של המדיה התאית ומאפשר נשימה תאית יעילה. יש פתח מילוי ראשי ושתי יציאות מזרק מכוסים על פני הספינה (איור 2A). לאחר טעינת תרבית התאים דרך פתח המילוי הראשי, שני מזרקים נטענים על הכלי כדי לסייע בהסרת הבועות. בעת שימוש בכלי 10 מ"ל, שני מזרקים 3 מ"ל לעבוד טוב. מזרק אחד מחובר למכשיר ריק, כאשר המזרק מדוכא לחלוטין, והשני מחובר מלא ב-3 מ"ל של תרבית תאים (איור 2E). אלה משמשים בשילוב כדי להסיר בועות מן הכלי, אשר חשוב לשמירה על הטיפול SMG. באופן כללי, מומלץ להגדיר שני פקדים שליליים, אשר ניתן לכנות את פקד "Flask" ואת "1G" פקד. בקרת "Flask" מתאימה לתאים הגדלים בצלוחית תרבית תאי תרחיף T25 סטנדרטית. בקרת 1G מתאימה לתאים הגדלים בכלי התרבות המיוחד של 10 מ"ל, אשר פשוט ממוקם באינקובטור (כלומר, מבלי להיות נתון לטיפול SMG). עיין בסעיף דיון לקבלת פרטים נוספים על פקדים.
השיטה המתוארת כאן מתאימה לכל חוקר המעוניין לחקור את ההשפעות של SMG על לימפוציטים, עם התמקדות ספציפית בתאי NK באמצעות קו תאי NK9213. התוצאות ממחקרים אלה עשויות לעזור לנו להבין טוב יותר ולמתן את ההשפעות השליליות של טיסה לחלל על מערכת החיסון האנושית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>D-410</td>
			<td>Gamma sterilized culture vessels (4/box)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok tip syringes (3 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>For attaching to the 10 mL HARVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92 Cell-line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4D</td>
			<td>Rotating wall vessel device; 2D clinostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 suspension culture flasks</td>
			<td>Sarsedt</td>
			<td>83.3910.502</td>
			<td>For flask control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system

בהתחשב במגבלות הנוכחיות של ביצוע מחקר ביולוגי בחלל, קיימות מספר אפשרויות לחשיפת תרבית תאים למיקרו-כבידה מדומה (SMG) על כדור הארץ. אפשרויות אלה נבדלות זו מזו בשיטותיהן, בעקרונותיהן ובהתאמתן לשימוש בתרבית תאי תרחיף. כאן, מתוארת שיטת תרבית תאים לחשיפת לימפוציטים למיקרו-כבידה מדומה באמצעות מערכת תרבית תאים סיבובית זמינה מסחרית, הידועה גם בשם קלינוסטט דו-ממדי או מכשיר כלי קיר מסתובב (RWV). שיטת תרבית תאים זו משתמשת בעיקרון של ביטול וקטור הכבידה הממוצע בזמן כדי לדמות מיקרו-כבידה על ידי סיבוב התאים על ציר אופקי. התאים המגודלים בתרבית במערכת זו ניתנים לקציר ולשימוש בניסויים רבים ושונים כדי להעריך את ההשפעות של מיקרו-כבידה מדומה על תפקוד התאים והפיזיולוגיה. טכניקת הטיפוח עשויה להשתנות מעט בהתאם לסוג התא או לקו שבו נעשה שימוש, אך השיטה המתוארת כאן עשויה להיות מיושמת על כל תרבית תאים מסוג תרחיף.

שיטת גידול זו נחשבת מוצלחת אם 1) התפשטות התאים עקבית בקירוב בין קבוצות הביקורת (ובאופן אידיאלי כל קבוצות הניסוי), 2) ההתרבות מתאימה בהתחשב בצפיפות הזריעה, משך הטיפול וזמן ההכפלה של סוג התא/קו, ו-3) הכדאיות של התאים שנקטפו היא 85% ומעלה (טבלה 1 ). באופן אידיאלי, התאים המתקבלים צריכים להיות...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System

זהו מדריך שלב אחר שלב לשימוש במערכת תרבית תאים סיבובית זמינה מסחרית לתרבית לימפוציטים במיקרו-כבידה מדומה באמצעות כלי תרבית חד-פעמיים מיוחדים. שיטת גידול זו יכולה להיות מיושמת על כל תרבית תאים מסוג תרחיף.

גידול לימפוציטים במיקרו-כבידה מדומה באמצעות מערכת תרבית תאים סיבובית

Given the current limitations of conducting biological research in space, a few options exist for subjecting cell culture to simulated microgravity (SMG) ...

שיטה זו מאפשרת לנו לחקור את ההשפעות של מיקרו-כבידה מדומה על תאי מערכת החיסון כדי לעזור לנו להבין טוב יותר כיצד היבטים של סביבת החלל משפיעים על הפיזיולוגיה האנושית ברמה המולקולרית. טכניקה זו היא כדאית מבחינה כלכלית והיא קלה יחסית להקמה ולתחזוקה בהשוואה לשליחת תרבית תאים לחלל או שיטות אחרות של חשיפת תרבית תאים למיקרו-כבידה מדומה על כדור הארץ. מומלץ ללכת לאט תוך כדי מילוי הכלים על מנת למנוע הצפה ושפיכה.לאחר הסרת הבועה הראשונית, ודא כי כלי הדם מלאים לחלוטין באמצעות מזרקים. זה ימזער את הסיכויים להיווצרות בועות גדולות במהלך הטיפול. התחילו בהוצאת כלי התרבות מאריזות הפלסטיק.תייגו כל כלי על השפה בהתאם לסוג התא או הקו בו נעשה שימוש, בין אם הוא נמצא בבקרה או בטיפול וכל מידע רלוונטי אחר. ייצב את הכלי ופתח את פתח המילוי בזהירות מבלי לגעת ביתד מכסה פתח המילוי או בטבעת O. הניחו את הפקק על כרית אתנול כאשר היתד או טבעת ה-O פונות כלפי מעלה בזמן שהכלי מלא.אין להסיר את הפקקים מיציאות המזרק. לטעון את הכלי עם 10 מ"ל של מדיה מלאה המתאימה עבור תרבית התא באמצעות פיפט סרולוגי סטרילי, בזהירות להניח את המכסה על יציאת המילוי. ודא שמכסי יציאות המזרק ויציאת המילוי סגורים היטב.לאחר מכן, הניחו את הכלים המלאים באינקובטור תוך ביצוע השלבים הבאים כדי לכוון את הכלים לתרבית תאים. שלפו את כלי השיט הדרוכים מהאינקובטור. לבקרת בקבוק, טען בקבוק תרבית תרחיף T25 עם 10 מ"ל של תרבית תאים מהמלאי שהוכן לעיל.הוסף 10 מ"ל של תרבית תאי מלאי לצינור חרוטי נפרד של 15 מ"ל, שישמש לטעינת המזרקים. פתח את הברגת מכסי יציאת המזרק כדי להסיר אותם מהכלי ולוודא שהפקקים נמצאים במצב פתוח. ייצב את הכלי ופתח את פתח המילוי בזהירות מבלי לגעת ביתד מכסה פתח המילוי או בטבעת O.הניחו את הפקק על כרית אתנול כאשר היתד או טבעת ה-O פונות כלפי מעלה בזמן מילוי הכלי. ודא כי stopcocks נמצאים במצב פתוח. ניתן לרוקן את הכלי על ידי שפיכת המדיה מהכלי למיכל פסולת באמצעות פיפטה סרולוגית.לחלופין, שאפו את המדיה באמצעות זכוכית סטרילית מעבר לפיפטה שלכם המחוברת למערכת ואקום. בעת השימוש בפיפט או במערכת הוואקום, הקפד לא לגעת בקרום החמצון מכיוון שהדבר עלול לפגוע בו, ולהפוך את הכלי לבלתי שמיש. סגור היטב את הצינור החרוטי 50 מ"ל המכיל את תרבית תאי המלאי מוכן ולהפוך אותו בעדינות כמה פעמים כדי לערבב את התוכן ביסודיות.צייר 10 מ"ל של מלאי תרבית תאים מצינור 50 מ"ל עם פיפט סרולוגי סטרילי טרי. הרימו את הכלי והטו אותו, כך שיציאת המילוי תהיה כלפי מעלה. לאחר מכן הוציאו בזהירות את מלאי תרבית התאים לתוך הספינה דרך יציאת המילוי.מלאו את הכלי עד קצה פתח המילוי, תוך הטיית הכלי חזרה כלפי מטה כדי למנוע שפיכה. היזהר לא לגעת בקרום החמצון עם פיפטה כפי שהוא שביר מאוד. לאחר העמסת הכלי, הניחו בזהירות את מכסה פתח המילוי בחזרה מבלי לגעת בטבעת ה-O.הסר את מזרק 3 מ"ל הראשון מן החבילה שלה לשאוב אותו כמה פעמים כדי לשחרר אותו. לאחר מכן חבר את המזרק לאחת מיציאות המזרק, וודא שהמזרק מדוכא לחלוטין. סגור היטב את הצינור החרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של תרבית תאי aliquot, ולהפוך אותו בעדינות כמה פעמים כדי לערבב את התוכן ביסודיות.באופן דומה, להסיר את מזרק 3 מ"ל השני מן החבילה שלה לשאוב אותו כמה פעמים. ואז בזהירות חצי שקוע מזרק זה בתרבית התא מן הצינור החרוטי 15 מ"ל ולצייר קצת תרבית. מזערו את בועות האוויר על ידי הוצאה מוחלטת של המזרק בחזרה לתוך הצינור והפקת 3 מ"ל של תרבית.חברו את המזרק המלא ליציאת המזרק הנותרת, וחטאו בזהירות את המזרקים ומסביב לשקע המילוי בעזרת פד אתנול. אין לקבל אתנול על קרום החמצון. חזור על התהליך עבור הכלים הנותרים.אם נותרה תרבית תאים מעט לא מספקת בצינור החרוטי של 50 מ"ל עבור הכלי האחרון, לשחזר את הכמות הנותרת מהצינור החרוטי 15 מ"ל המשמש לטעינת המזרקים. ודא כי פקקי יציאת המזרק סגורים כדי להגביל את נדידת התאים והבועות מהמזרקים לתוך כלי הדם. הפוך את הכלי והכה אותו בצד כמה פעמים כדי לאסוף את הבועות הראשוניות.הפוך במהירות את הכלי לאחור כדי לפנות כלפי מעלה, ולאחר מכן בזווית קלה פונה החוצה, כך שכל הבועות צפות לצד למעלה של הכלי. תמרנו את הבועות מתחת לנמל עם המזרק הריק, וצפו בהן מתחילות להיכנס לנמל. פתח את שני פקקי יציאת המזרק.הכו בעדינות בכלי כדי לעודד את הבועות לצוף מעלה לתוך המזרק הריק. לאט לאט למצוץ את הבועות הגדולות עם מזרק ריק תוך לחיצה בזהירות על המזרק המלא כדי לשמור על הלחץ בכלי, כך קרום חמצון לא להתפוצץ. חזור על תהליך זה מספר פעמים כדי להבטיח שכל הבועות יוסרו.לאחר הסרת הבועות ביעילות, סגור את פקקי יציאת המזרק. שמור את המזרקים דולקים במהלך הטיפול כדי לאפשר הסרת בועות לאחר מכן, להבטיח כי נפח בשני מזרקים הוא שווה בקירוב. נגב בזהירות את פני השטח של הבסיס המסתובב וכבל הסרט עם 70% אתנול.ודא שכבל רצועת הכלים מחובר לספק הכוח. מניחים את הבסיס המסתובב באינקובטור, ומחברים את כבל הסרט לבסיס. מקם את ספק הכוח ליד, אך מחוץ לאינקובטור.חבר את כלי הטיפול SMG על ידי יישור חוטי הכלי ליתד המסתובבת וסיבוב עדין של היתד המסתובבת על הבסיס נגד כיוון השעון. ודא שכלי השיט מחובר היטב. שמור על האינקובטור בלחות של כ -100% על ידי מילוי מגש המים במי RO autoclave.התאימו את מהירות הסיבוב של האינקובטור כך שתתאים למהירות השקיעה של התאים, כך שהתאים לא יפלו דרך המדיה. ביום הראשון לקביעת הטיפול, יש לבדוק היווצרות בועות כל כמה שעות כמתואר בכתב היד של הטקסט. הסירו את הבועות לפחות פעם ביום עד לסיום משך הטיפול הרצוי.לאחר שחלף אורך הטיפול המתוכנן, עצרו את הסיבוב ופרקו את המנגנון. הסר את כלי הטיפול על ידי החזקת כלי הדם בעדינות במצב נייח תוך סיבוב היתד המסתובבת של המכשיר בכיוון השעון. הכניסו את צלוחית הבקרה, הבקרה וכלי הטיפול לארון בטיחות ביולוגי סטרילי.קח כל כלי למעט בקבוק הבקרה והפוך אותו, כך שהוא פונה כלפי מטה. לאחר מכן הכה אותו בעדינות כדי להביא את כל התאים להשעיה. לאחר מכן סובב את הכלי על צדו עם פתח המילוי לכיוון התחתית, והכה בו שוב כדי להנחות את התאים לכיוון פתח המילוי לשאיפה יעילה.טפל בכל כלי בנפרד. שחררו את המזרקים משתי היציאות ושחררו אותם לפסולת המסוכנת ביולוגית. פתח את הסטופקוקים ביציאות המזרק.בזהירות להסיר את מכסה יציאת מילוי ולצייר את התוכן באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית 10 מ"ל, להטות את הכלי כפי שהוא מרוקן. יש לחלק את התוכן של כל קבוצות הבקרה והטיפול לתוך צינורות חרוטיים 15 מ"ל המסומנים בנפרד. סגרו כל צינור והפכו אותו בעדינות כמה פעמים כדי לוודא שהוא מעורבב כראוי.השתמש בשיטה המועדפת לקביעת הריכוז והכדאיות של תרבית התאים המתקבלת כדי להתכונן לבדיקות הניסוי הבאות. הכדאיות ההתחלתית של קו התאים NK-92 וצפיפויות הישיבה הושוו לכדאיות הסופית ולריכוזי הקצה המתקבלים. לאחר טיפול SMG של 72 שעות, הושוו שני מקרים של תוצאות שליליות וחיוביות.לשם השוואה, טווח הריכוז האופטימלי של קו התאים NK-92 שבו נעשה שימוש היה בין 0.3 ל-1.2 מיליון תאים למיליליטר עם זמן הכפלה של כיומיים-שלושה. ההתפשטות בקבוצת הטיפול ב-SMG הייתה שווה בקירוב בין קבוצות הביקורת והטיפול. פרמטרים אלה היו חיוניים להצלחת הניסוי במורד הזרם, והתאים שהתקבלו משתי קבוצות הביקורת תפקדו באופן דומה במבחני ניסוי במורד הזרם.חשוב מאוד לעקוב ולהסביר את היווצרות הבועות במהלך הטיפול, במיוחד בתרבית התא הנתונה למיקרו-כבידה מדומה. היווצרות בועות גדולות עלולה לגרום להפרעה לדינמיקת הנוזלים בתוך כלי השיט, וזה למעשה ישלול את מצב המיקרו-כבידה המדומה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

תא עצב ראשי מערכת התרבות לחקר וירוס הרפס סימפלקס המתנה ו הפעלה מחדש

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

דיפוזיה מולקולרית פלזמה ממברנות יסודי לימפוציטים נמדד באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

כימות מהיר של Blastogenesis mitogen-Induced T לימפוציטים לזיהוי סמים המערכת החיסונית

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...