Name: culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system
Uploaded: 2022-08-25T12:30:00
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Questo lavoro è sostenuto dall'Agenzia spaziale canadese (CSA), borsa di ricerca (17ILSRA3, Immuno Profile). Gli autori desiderano riconoscere e ringraziare la dottoressa Roxanne Fournier (Università di Toronto), il dottor Randal Gregg (Lincoln Memorial University) e Preteesh Mylabathula (Università dell'Arizona) per il loro aiuto nella risoluzione dei problemi iniziali di questo protocollo.

NOTA: I seguenti passaggi devono essere completati all'interno di un armadio di sicurezza biologica sterile.
1. Preparazione di vasi per la coltura cellulare
<ol><li>Estrarre i recipienti di coltura dall'imballaggio di plastica. Etichettare ogni recipiente sul bordo in base al tipo/linea di cellula utilizzata, sia che si tratti del controllo (1G) o del trattamento (SMG) e di qualsiasi altra informazione pertinente.</li>
	<li>Stabilizzare il recipiente e aprire con attenzione...

<ol>
	<li>ElGindi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+the+force+be+with+you+(or+not):+the+immune+system+under+microgravity.">May the force be with you (or not): the immune system under microgravity.</a> Cells. 10 (8), 1941 (2021).</li><li>Chouk&#232;r, A., Ullrich, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+system+dysregulation+during+spaceflight:+potential+countermeasures+for+deep+space+exploration+missions.">Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Countermeasures-based+improvements+in+stress,+immune+system+dysregulation+and+latent+herpesvirus+reactivation+onboard+the+International+Space+Station+-+relevance+for+deep+space+missions+and+terrestrial+medicine.">Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine.</a> Neuroscience &amp; Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).</li><li>Herranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground-based+facilities+for+simulation+of+microgravity:+organism-specific+recommendations+for+their+use,+and+recommended+terminology.">Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology.</a> Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).</li><li>Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+current+microgravity+platforms+for+space+biology+research.">Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research.</a> Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).</li><li>Murphy, K., Weaver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Janeway's Immunobiology 9th Edition. , (2016).</li><li>Dedolph, R. R., Dipert, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+gravity+stimulus+nullification+by+clinostat+rotation.">The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation.</a> Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).</li><li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+suspension+culture:+the+rotating-wall+vessel.">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).</li><li>Crabb&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+proteomic+responses+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+to+spaceflight+conditions+involve+Hfq+regulation+and+reveal+a+role+for+oxygen.">Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).</li><li>Ulbrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+simulated+and+real+microgravity+on+bone+cells+and+mesenchymal+stem+cells.">The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells.</a> BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).</li><li>Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+and+simulated+microgravity+cause+a+significant+reduction+of+key+gene+expression+in+early+T-cell+activation.">Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).</li><li>Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+cell+line+(NK-92)+with+phenotypical+and+functional+characteristics+of+activated+natural+killer+cells.">Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.</a> Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).</li><li>Williams, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+NK-92+cells+for+refractory+hematological+malignancies+relapsing+after+autologous+hematopoietic+cell.">A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell.</a> Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).</li><li>Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol">https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol</a> (2022)</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2022)</li><li>Mylabathula, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+disarms+human+NK-cells+and+inhibits+anti-tumor+cytotoxicity+in+vitro.">Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro.</a> Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+simulated+microgravity+on+primary+human+NK+cells.">Effects of simulated microgravity on primary human NK cells.</a> Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).</li><li>Shao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+effect+of+simulated+microgravity+on+the+cytotoxicity+of+NK+cells+following+the+DNA+methylation+of+NKG2D+and+the+expression+of+DAP10.">Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10.</a> Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).</li><li>Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+attachment-independent+biofilm+formation+and+repression+of+hfq+expression+by+low-fluid-shear+culture+of+Staphylococcus+aureus.">Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).</li><li>Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air+bubble-isolating+rotating+wall+vessel+bioreactor+for+improved+spheroid/organoid+formation.">An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).</li></ol>

Mentre l'umanità si prepara per missioni spaziali più lunghe sulla Luna e su Marte, è necessario condurre ulteriori ricerche per mitigare i gravi rischi per la salute degli astronauti. Un aspetto importante dell'ambiente spaziale che influisce sulla fisiologia umana è la microgravità. Qui, è stato descritto un metodo di coltura cellulare per sottoporre i linfociti a SMG utilizzando un sistema di coltura cellulare rotante disponibile in commercio.
Questo protocollo contiene alcuni passagg...

È stato dimostrato che il volo spaziale ha un impatto su molti aspetti della fisiologia umana, incluso il sistema immunitario. Molti studi hanno dimostrato prove di disregolazione immunitaria a seguito del volo spaziale in vivo e dell'esposizione alla microgravità simulata (SMG) in vitro 1,2,3,4. Un aspetto importante dell'ambiente spaziale che influisce sulla fisiologia umana è la microgravità. La microgravità si riferisce alla "assenza di peso" sperimentata a causa delle basse forze gravitazionali nell'ambiente spaziale5. Mentre l'umanità si prepara per missioni spaziali più lunghe sulla Luna e su Marte, è necessario condurre ulteriori ricerche per mitigare i gravi rischi per la salute degli astronauti.
Condizioni reali di microgravità per la ricerca scientifica possono essere raggiunte nello spazio a bordo della Stazione Spaziale Internazionale (ISS) o in nanosatelliti lanciati in orbita; Tuttavia, queste opzioni possono essere incredibilmente costose e complesse da orchestrare. Dati gli attuali limiti della conduzione della ricerca biologica nello spazio, esistono diverse opzioni per indurre la microgravità reale e SMG sulla Terra. Esistono operazioni su larga scala che possono produrre brevi periodi di microgravità reale sulla Terra, tra cui torri di lancio, volo parabolico e razzi sonda. Tuttavia, questi metodi non sono eccessivamente adatti per studiare gli effetti della microgravità sui sistemi biologici, in gran parte a causa dei loro brevi periodi di trattamento in microgravità (cioè secondi a 20 minuti). Questi metodi sono discussi più dettagliatamente altrove 5,6. Le opzioni adatte per la coltura cellulare biologica includono dispositivi su piccola scala come clinostati 2D o dispositivi di vasi rotanti a parete (RWV) e clinostati 3D o macchine di posizionamento casuale (RPM). Questi dispositivi possono essere installati all'interno di incubatori di colture cellulari mantenuti a 37 °C e al 5% di CO2 e ruotano la coltura cellulare su un asse orizzontale (2D) o su due assi perpendicolari (3D)5. Tuttavia, è importante sottolineare che questi metodi di coltura producono SMG in contrasto con la microgravità reale, che è più fattibile nello spazio per contesti di ricerca biologica.
L'obiettivo del presente documento è quello di delineare i passaggi per sottoporre i linfociti a SMG utilizzando un dispositivo RWV (Table of Materials) disponibile in commercio, che rientra nella classificazione 2D clinostat. Mentre esiste un protocollo generale disponibile dal produttore per il funzionamento di questo dispositivo, l'articolo corrente mira a coprire i passaggi di risoluzione dei problemi e ottimizzazione in modo più dettagliato. Questo articolo copre anche la teoria alla base di come funziona questo dispositivo per produrre SMG in coltura cellulare in sospensione, in particolare con i linfociti. In questo contesto, la coltura cellulare in sospensione si riferisce alle cellule che crescono liberamente in terreni di coltura integrati, senza aderire ad alcuna impalcatura aggiuntiva. Molti tipi di cellule vengono coltivati in coltura cellulare in sospensione, compresi i linfociti. I linfociti sono cellule del sistema immunitario, comprese le cellule T, B e Natural Killer (NK), che risiedono negli organi linfoidi e nel flusso sanguigno7.
Il clinostato RWV 2D qui descritto opera sul principio dell'annullamento del vettore gravitazionale mediato nel tempo 5,6,8,9, per cui il vettore gravitazionale è randomizzato attraverso la rotazione della coltura cellulare su un asse orizzontale. Ciò si ottiene abbinando la velocità di rotazione del recipiente di coltura alla velocità di sedimentazione delle cellule. Finché la velocità di rotazione del recipiente di coltura è ben abbinata alla velocità di sedimentazione delle cellule, le cellule sono mantenute in caduta libera e incapaci di sedimentare, come sperimentato nell'ambiente spaziale. Dopo una fase iniziale di accelerazione, il mezzo nel recipiente di coltura raggiunge la "rotazione del corpo solido" nel tempo. Questa rotazione orizzontale induce anche il flusso laminare nel vaso di coltura cellulare. Questo crea un ambiente "low shear", dato che lo sforzo di taglio indotto sulle celle dal flusso laminare è molto inferiore a quello del flusso turbolento. Tuttavia, dato che il clinostato non è un sistema perfetto, vengono introdotti alcuni piccoli movimenti del fluido laminare, che infliggono uno stress di taglio minimo alle cellule. Pertanto, le celle sospese nel supporto vengono trascinate da questo flusso durante la rotazione. Durante la rotazione orizzontale, il vettore gravitazionale agisce sulle celle e le porta in una traiettoria oscillante, come visualizzato nella Figura 1. Un'altra piccola fonte di stress da taglio è causata dalle cellule che "cadono" attraverso i media, causando il flusso laminare intorno alle cellule. Mentre il recipiente di coltura ruota su un asse orizzontale, ruota anche il vettore di gravità sperimentato dalle cellule. Nel corso del tempo, questo vettore di gravità rotante si avvicina in media allo zero; questo fenomeno è chiamato nullificazione del vettore gravitazionale mediato nel tempo e induce uno stato di SMG 5,6,8,9. Questo dispositivo è stato utilizzato per studiare gli effetti di SMG su molti tipi di cellule, alcune delle quali sono trattate nei riferimenti10,11,12. Altri esempi sono disponibili sul sito Web del produttore del dispositivo.
Questo dispositivo RWV utilizza "vasi ad alto rapporto d'aspetto" (HARV) specializzati disponibili tramite il produttore del dispositivo. Questi HARV contengono 10 ml di coltura cellulare ciascuno; tuttavia, sono disponibili anche HARV da 50 ml. Possono essere utilizzati HARV da 10 ml o 50 ml a seconda di quante cellule sono necessarie per completare qualsiasi test sperimentale a valle, che è descritto ulteriormente nella sezione di discussione. Gli HARV sono realizzati in policarbonato e includono una membrana di ossigenazione in silicone per consentire lo scambio di gas durante la coltura cellulare. Questo mantiene il pH del mezzo cellulare e consente una respirazione cellulare efficiente. C'è una porta di riempimento principale e due porte per siringhe con tappo sulla faccia del recipiente (Figura 2A). Dopo aver caricato la coltura cellulare attraverso la porta di riempimento principale, due siringhe vengono caricate sul recipiente per facilitare la rimozione delle bolle. Quando si usano i recipienti da 10 ml, due siringhe da 3 ml funzionano bene. Una siringa è attaccata al dispositivo vuota, con la siringa completamente premuta e l'altra è attaccata riempita con 3 ml di coltura cellulare (Figura 2E). Questi sono usati in combinazione per rimuovere le bolle dal vaso, che è importante per mantenere il trattamento SMG. In generale, si consiglia di impostare due controlli negativi, che possono essere indicati come il controllo "Flask" e il controllo "1G". Il controllo "Flask" corrisponde alle cellule che vengono coltivate in un pallone di coltura cellulare di sospensione T25 standard. Il controllo 1G corrisponde alle cellule che vengono coltivate nel recipiente di coltura specializzato da 10 ml, che viene semplicemente inserito nell'incubatore (cioè senza essere sottoposto al trattamento SMG). Si prega di consultare la sezione Discussione per ulteriori dettagli sui controlli.
Il metodo qui descritto è appropriato per qualsiasi ricercatore che desideri studiare gli effetti di SMG sui linfociti, con un focus specifico sulle cellule NK utilizzando la linea cellulare NK9213. I risultati di questi studi possono aiutarci a comprendere meglio e mitigare gli effetti negativi del volo spaziale sul sistema immunitario umano.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>D-410</td>
			<td>Gamma sterilized culture vessels (4/box)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok tip syringes (3 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>For attaching to the 10 mL HARVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92 Cell-line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4D</td>
			<td>Rotating wall vessel device; 2D clinostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 suspension culture flasks</td>
			<td>Sarsedt</td>
			<td>83.3910.502</td>
			<td>For flask control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system

Dati gli attuali limiti della conduzione della ricerca biologica nello spazio, esistono alcune opzioni per sottoporre la coltura cellulare alla microgravità simulata (SMG) sulla Terra. Queste opzioni variano nei loro metodi, principi e idoneità per l'uso con colture cellulari in sospensione. Qui, viene descritto un metodo di coltura cellulare per sottoporre i linfociti a microgravità simulata utilizzando un sistema di coltura cellulare rotante disponibile in commercio, noto anche come clinostato 2D o dispositivo di vaso a parete rotante (RWV). Questo metodo di coltura cellulare utilizza il principio della nullificazione del vettore gravitazionale mediato nel tempo per simulare la microgravità ruotando le cellule su un asse orizzontale. Le cellule coltivate in questo sistema possono essere raccolte e utilizzate in molti saggi sperimentali diversi per valutare gli effetti della microgravità simulata sulla funzione cellulare e sulla fisiologia. La tecnica di coltura può variare leggermente a seconda del tipo di cellula o della linea utilizzata, ma il metodo qui descritto può essere applicato a qualsiasi coltura cellulare di tipo sospensione.

Questo metodo di coltura è considerato efficace se 1) la proliferazione delle cellule è approssimativamente coerente tra i gruppi di controllo (e idealmente tutti i gruppi sperimentali), 2) la proliferazione è appropriata data la densità di semina, la durata del trattamento e il tempo di raddoppio del tipo / linea cellulare, e 3) la vitalità delle cellule raccolte è dell'85% o superiore (Tabella 1 ). Idealmente, le cellule risultanti dovrebbero essere sane come lo sarebbero in coltura cellulare sta...

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Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System

Questa è una guida passo-passo per l'utilizzo di un sistema di coltura cellulare rotante disponibile in commercio per la coltura di linfociti in microgravità simulata utilizzando vasi di coltura monouso specializzati. Questo metodo di coltura può essere applicato a qualsiasi coltura cellulare di tipo sospensione.

Coltura di linfociti in microgravità simulata utilizzando un sistema di coltura cellulare rotante

Given the current limitations of conducting biological research in space, a few options exist for subjecting cell culture to simulated microgravity (SMG) ...

Questa tecnica ci permette di studiare gli effetti della microgravità simulata sulle cellule immunitarie per aiutarci a capire meglio come gli aspetti dell'ambiente spaziale influenzano la fisiologia umana a livello molecolare. Questa tecnica è economicamente fattibile ed è relativamente facile da impostare e mantenere rispetto all'invio di colture cellulari nello spazio o ad altri metodi di sottoporre la coltura cellulare alla microgravità simulata sulla terra. Si consiglia di andare lentamente mentre si riempiono i vasi per evitare trabocchi e fuoriuscite.Dopo la rimozione iniziale delle bolle, assicurarsi che i vasi siano completamente pieni utilizzando le siringhe. Ciò ridurrà al minimo le possibilità di formazione di grandi bolle durante il trattamento. Inizia togliendo i vasi di coltura dall'imballaggio di plastica.Etichettare ogni recipiente sul bordo in base al tipo di cellula o alla linea utilizzata sia nel controllo che nel trattamento e qualsiasi altra informazione pertinente. Stabilizzare il recipiente e aprire con attenzione la porta di riempimento senza toccare il piolo del tappo della porta di riempimento o l'O-ring. Posizionare il tappo su un tampone di etanolo con il piolo o l'O-ring rivolto verso l'alto mentre il recipiente è pieno.Non rimuovere i cappucci dalle porte della siringa. Caricare il recipiente con 10 ml del mezzo completo appropriato per la coltura cellulare utilizzando un pipetta sierologica sterile e posizionare con attenzione il tappo sulla porta di riempimento. Assicurarsi che i tappi della porta della siringa e la porta di riempimento siano ben chiusi.Quindi, posizionare i vasi riempiti in un'incubatrice mentre si eseguono i passaggi successivi per innescare i vasi per la coltura cellulare. Recuperare i vasi adescati dal supporto dall'incubatore. Per un controllo del pallone, caricare un pallone per colture in sospensione T25 con 10 ml di coltura cellulare dal materiale preparato sopra.Aggiungere 10 mL di coltura di cellule madre in un tubo conico separato da 15 ml, che verrà utilizzato per caricare le siringhe. Svitare i tappi delle porte della siringa per rimuoverli dal recipiente e assicurarsi che i rubinetti di arresto siano in posizione aperta. Stabilizzare il recipiente e aprire con attenzione la porta di riempimento senza toccare il piolo del tappo della porta di riempimento o l'O-ring.Posizionare il tappo su un tampone di etanolo con il piolo o l'O-ring rivolto verso l'alto mentre il recipiente viene riempito. Assicurarsi che i rubinetti di arresto siano in posizione aperta. Il recipiente può essere svuotato versando il mezzo dal recipiente in un contenitore per rifiuti utilizzando una pipetta sierologica.In alternativa, aspirare il fluido utilizzando un vetro sterile oltre la pipetta collegata a un sistema di vuoto. Durante l'utilizzo di una pipetta o del sistema a vuoto, assicurarsi di non toccare la membrana di ossigenazione in quanto ciò potrebbe danneggiarla e rendere il recipiente inutilizzabile. Chiudere ermeticamente il tubo conico da 50 mL contenente la coltura di cellule madre preparata e capovolgerlo delicatamente alcune volte per mescolare accuratamente il contenuto.Prelevare 10 mL di materiale di coltura cellulare dalla provetta da 50 mL con un pipet sierologico sterile fresco. Raccogli il recipiente e inclinalo, in modo che la porta di riempimento sia verso l'alto. Quindi erogare con attenzione lo stock di coltura cellulare nel recipiente attraverso la porta di riempimento.Riempire il recipiente fino alla punta della porta di riempimento, inclinando il recipiente verso il basso per evitare fuoriuscite. Fare attenzione a non toccare la membrana di ossigenazione con la pipetta poiché è molto fragile. Una volta caricato il recipiente, riposizionare con attenzione il tappo della porta di riempimento senza toccare l'O-ring.Rimuovere la prima siringa da 3 ml dalla confezione e pomparla alcune volte per allentarla. Quindi collegare la siringa a una delle porte della siringa, assicurandosi che la siringa sia completamente premuta. Chiudere saldamente il tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di coltura cellulare aliquota e capovolgerlo delicatamente alcune volte per mescolare accuratamente il contenuto.Allo stesso modo, rimuovere la seconda siringa da 3 ml dalla confezione e pomparla alcune volte. Quindi semi-immergere accuratamente questa siringa nella coltura cellulare dal tubo conico da 15 mL e prelevare un po 'di coltura. Ridurre al minimo le bolle d'aria erogando completamente la siringa nel tubo e aspirando 3 ml di coltura.Collegare la siringa riempita alla porta della siringa rimanente e disinfettare accuratamente le siringhe e intorno alla porta di riempimento con un tampone di etanolo. Non ottenere etanolo sulla membrana di ossigenazione. Ripetere il processo per le navi rimanenti.Se nella provetta conica da 50 mL è rimasta una coltura cellulare leggermente insufficiente, recuperare la quantità rimanente dal tubo conico da 15 mL utilizzato per caricare le siringhe. Assicurarsi che i rubinetti della porta della siringa siano chiusi per limitare la migrazione di cellule e bolle dalle siringhe nei vasi. Capovolgi la nave e colpiscila di lato un paio di volte per raccogliere le bolle iniziali.Capovolgere rapidamente la nave verso l'alto, e poi con una leggera angolazione rivolta verso l'esterno, in modo che le bolle galleggino tutte verso l'alto della nave. Manovra le bolle sotto la porta con la siringa vuota e guardale iniziare a entrare nella porta. Aprire entrambi i rubinetti della porta della siringa.Colpire delicatamente il recipiente per incoraggiare le bolle a galleggiare nella siringa vuota. Aspirare lentamente le bolle più grandi con la siringa vuota mentre si preme attentamente la siringa piena per mantenere la pressione nel recipiente, in modo che la membrana di ossigenazione non scoppi. Ripeti questo processo alcune volte per assicurarti che tutte le bolle vengano rimosse.Quando le bolle sono state efficacemente rimosse, chiudere i rubinetti della porta della siringa. Tenere le siringhe durante il trattamento per consentire la successiva rimozione delle bolle, assicurandosi che il volume in entrambe le siringhe sia approssimativamente uguale. Pulire accuratamente la superficie della base rotante e del cavo a nastro con etanolo al 70%.Assicurarsi che il cavo a nastro sia collegato all'alimentatore. Posizionare la base rotante nell'incubatore e collegare il cavo a nastro alla base. Posizionare l'alimentatore vicino, ma all'esterno dell'incubatore.Fissare il recipiente di trattamento SMG allineando i fili del recipiente al piolo rotante e ruotando delicatamente il piolo rotante sulla base in senso antiorario. Assicurarsi che la nave sia fissata saldamente. Mantenere l'incubatore a circa il 100% di umidità riempiendo il vassoio dell'acqua con acqua RO dell'autoclave.Regolare la velocità di rotazione dell'incubatore in modo che corrisponda alla velocità di sedimentazione delle cellule, in modo che le cellule non cadano attraverso il supporto. Il primo giorno di preparazione del trattamento, controllare la formazione di bolle ogni poche ore come descritto nel manoscritto del testo. Rimuovere le bolle almeno una volta al giorno andando avanti fino alla fine della durata del trattamento desiderata.Una volta trascorsa la durata prevista del trattamento, interrompere la rotazione e smontare l'apparecchio. Rimuovere il recipiente di trattamento tenendo delicatamente il recipiente fermo mentre si ruota il piolo rotante del dispositivo in senso orario. Portare il pallone di controllo, il recipiente di controllo e il recipiente trattato in un armadio di sicurezza biologica sterile.Prendere ogni recipiente escluso il pallone di controllo e capovolgerlo, in modo che sia rivolto verso il basso. Quindi colpirlo delicatamente per portare tutte le cellule in sospensione. Quindi ruotare il recipiente su un lato con la porta di riempimento verso il basso e colpirlo di nuovo per guidare le celle verso la porta di riempimento per un'aspirazione efficiente.Maneggiare ogni nave individualmente. Svitare le siringhe dalle due porte e distribuirle nei rifiuti a rischio biologico. Aprire i rubinetti di arresto sulle porte della siringa.Rimuovere con cautela il tappo della porta di riempimento e aspirare il contenuto utilizzando una pipetta sierologica sterile da 10 ml, inclinando il recipiente mentre viene svuotato. Erogare il contenuto di tutti i gruppi di controllo e trattamento in provette coniche da 15 mL etichettate individualmente. Chiudi ogni tubo e capovolgilo delicatamente alcune volte per assicurarti che siano miscelati correttamente.Utilizzare il metodo preferito per determinare la concentrazione e la vitalità della coltura cellulare risultante per prepararsi ai successivi saggi sperimentali. La vitalità iniziale della linea cellulare NK-92 e le densità di seduta sono state confrontate con la vitalità finale risultante e le concentrazioni finali. Dopo un trattamento SMG di 72 ore, sono stati confrontati due casi di esiti negativi e positivi.Per confronto, l'intervallo di concentrazione ottimale della linea cellulare NK-92 utilizzata era compreso tra 0,3 e 1,2 milioni di cellule per millilitro con un tempo di raddoppio di circa due o tre giorni. La proliferazione nel gruppo di trattamento SMG è stata approssimativamente uguale tra i gruppi di controllo e di trattamento. Questi parametri sono stati essenziali per il successo sperimentale a valle e le cellule risultanti dai due gruppi di controllo hanno funzionato in modo simile nei saggi sperimentali a valle.È fondamentale monitorare e tenere conto della formazione di bolle durante tutto il corso del trattamento, specialmente nella coltura cellulare sottoposta a microgravità simulata. La formazione di grandi bolle può causare interruzioni alla fluidodinamica all'interno del vaso, e questo essenzialmente annullerà la condizione di microgravità simulata.

Research

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