Name: culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system
Uploaded: 2022-08-25T12:30:00
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이 연구는 캐나다 우주국 (CSA), 연구 보조금 (17ILSRA3, Immuno Profile)의 지원을 받는다. 저자는 이 프로토콜의 초기 문제 해결에 도움을 준 Dr. Roxanne Fournier(토론토 대학교), Randal Gregg 박사(링컨 메모리얼 대학교) 및 Preteesh Mylabathula(애리조나 대학교)에게 감사를 표합니다.

알림: 다음 단계는 멸균된 생물학적 안전 캐비닛 내부에서 완료해야 합니다.
1. 세포 배양용 용기의 제조
<ol><li>플라스틱 포장에서 배양 용기를 꺼냅니다. 사용 중인 세포 유형/라인, 대조군(1G) 또는 처리(SMG) 여부 및 기타 관련 정보에 따라 테두리의 각 용기에 라벨을 붙입니다.</li>
	<li>용기를 안정화하고 충전 포트 캡 페그/O-링을 건드리지 않고 충전 포트를 조심...

<ol>
	<li>ElGindi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+the+force+be+with+you+(or+not):+the+immune+system+under+microgravity.">May the force be with you (or not): the immune system under microgravity.</a> Cells. 10 (8), 1941 (2021).</li><li>Chouk&#232;r, A., Ullrich, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+system+dysregulation+during+spaceflight:+potential+countermeasures+for+deep+space+exploration+missions.">Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Countermeasures-based+improvements+in+stress,+immune+system+dysregulation+and+latent+herpesvirus+reactivation+onboard+the+International+Space+Station+-+relevance+for+deep+space+missions+and+terrestrial+medicine.">Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine.</a> Neuroscience &amp; Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).</li><li>Herranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground-based+facilities+for+simulation+of+microgravity:+organism-specific+recommendations+for+their+use,+and+recommended+terminology.">Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology.</a> Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).</li><li>Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+current+microgravity+platforms+for+space+biology+research.">Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research.</a> Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).</li><li>Murphy, K., Weaver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Janeway's Immunobiology 9th Edition. , (2016).</li><li>Dedolph, R. R., Dipert, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+gravity+stimulus+nullification+by+clinostat+rotation.">The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation.</a> Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).</li><li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+suspension+culture:+the+rotating-wall+vessel.">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).</li><li>Crabb&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+proteomic+responses+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+to+spaceflight+conditions+involve+Hfq+regulation+and+reveal+a+role+for+oxygen.">Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).</li><li>Ulbrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+simulated+and+real+microgravity+on+bone+cells+and+mesenchymal+stem+cells.">The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells.</a> BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).</li><li>Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+and+simulated+microgravity+cause+a+significant+reduction+of+key+gene+expression+in+early+T-cell+activation.">Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).</li><li>Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+cell+line+(NK-92)+with+phenotypical+and+functional+characteristics+of+activated+natural+killer+cells.">Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.</a> Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).</li><li>Williams, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+NK-92+cells+for+refractory+hematological+malignancies+relapsing+after+autologous+hematopoietic+cell.">A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell.</a> Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).</li><li>Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol">https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol</a> (2022)</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2022)</li><li>Mylabathula, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+disarms+human+NK-cells+and+inhibits+anti-tumor+cytotoxicity+in+vitro.">Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro.</a> Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+simulated+microgravity+on+primary+human+NK+cells.">Effects of simulated microgravity on primary human NK cells.</a> Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).</li><li>Shao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+effect+of+simulated+microgravity+on+the+cytotoxicity+of+NK+cells+following+the+DNA+methylation+of+NKG2D+and+the+expression+of+DAP10.">Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10.</a> Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).</li><li>Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+attachment-independent+biofilm+formation+and+repression+of+hfq+expression+by+low-fluid-shear+culture+of+Staphylococcus+aureus.">Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).</li><li>Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air+bubble-isolating+rotating+wall+vessel+bioreactor+for+improved+spheroid/organoid+formation.">An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).</li></ol>

인류가 달과 화성에 대한 더 긴 우주 임무를 준비함에 따라 우주 비행사의 심각한 건강 위험을 완화하기 위해 더 많은 연구가 수행되어야 합니다. 인간 생리학에 영향을 미치는 우주 환경의 주요 측면 중 하나는 미세 중력입니다. 여기서, 시판되는 회전세포 배양 시스템을 이용하여 림프구를 SMG에 투여하는 세포 배양 방법을 설명하였다.
이 프로토콜에는 사용되는 세포 유형 ?...

우주 비행은 면역 체계를 포함한 인간 생리학의 여러 측면에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 많은 연구에서 생체 내 우주 비행 및 시험관 내 모의 미세 중력 (SMG)에 대한 노출로 인한 면역 조절 장애의 증거를 입증했습니다 1,2,3,4. 인간 생리학에 영향을 미치는 우주 환경의 주요 측면 중 하나는 미세 중력입니다. 미세중력은 우주 환경5에서 낮은 중력으로 인해 경험하는 "무중력"을 의미한다. 인류가 달과 화성에 대한 더 긴 우주 임무를 준비함에 따라 우주 비행사의 심각한 건강 위험을 완화하기 위해 더 많은 연구가 수행되어야 합니다.
과학 연구를위한 실제 미세 중력 조건은 국제 우주 정거장 (ISS)의 우주 또는 궤도에 진입 한 나노 위성에서 달성 할 수 있습니다. 그러나 이러한 옵션은 오케스트레이션하는 데 비용이 많이 들고 복잡할 수 있습니다. 우주에서 생물학적 연구를 수행하는 현재의 한계를 감안할 때 지구에서 실제 미세 중력과 SMG를 유도하기위한 몇 가지 옵션이 있습니다. 드롭 타워, 포물선 비행 및 사운딩 로켓을 포함하여 지구상에서 단기간의 실제 미세 중력을 생성할 수 있는 대규모 작업이 존재합니다. 그러나, 이들 방법들은 생물학적 시스템에 대한 미세중력의 영향을 연구하는 데 지나치게 적합하지 않은데, 이는 주로 이들의 짧은 기간의 미세중력 처리(즉, 몇 초 내지 20분)로 인한 것이다. 이러한 방법은 다른 곳에서 더 자세히 논의됩니다 5,6. 생물학적 세포 배양에 적합한 옵션에는 2D 클리노스타트 또는 회전 벽 용기(RWV) 장치와 같은 소규모 장치와 3D 클리노스타트 또는 랜덤 포지셔닝 머신(RPM)이 포함됩니다. 이 장치는 37°C 및 5%CO2로 유지되는 세포 배양 배양기 내부에 설치할 수 있으며 수평 축(2D) 또는 두 개의 수직 축(3D)에서 세포 배양을 회전시킵니다5. 그러나 이러한 배양 방법은 생물학적 연구 맥락을 위해 우주에서 가장 실현 가능하게 달성되는 실제 미세 중력과 달리 SMG를 생성한다는 점을 강조하는 것이 중요합니다.
현재 논문의 목표는 2D clinostat 분류에 속하는 상업적으로 이용 가능한 RWV 장치(Table of Materials)를 사용하여 림프구를 SMG에 적용하는 단계를 설명하는 것입니다. 이 장치를 작동하기 위해 제조업체에서 사용할 수 있는 일반 프로토콜이 있지만 현재 문서에서는 문제 해결 및 최적화 단계를 더 자세히 다루는 것을 목표로 합니다. 이 기사는 또한 이 장치가 현탁 세포 배양, 특히 림프구에서 SMG를 생산하기 위해 어떻게 작동하는지에 대한 이론을 다룹니다. 이러한 맥락에서 현탁 세포 배양은 추가 스캐폴딩을 부착하지 않고 보충된 배양 배지에서 자유롭게 성장하는 세포를 말합니다. 많은 세포 유형은 림프구를 포함한 현탁 세포 배양에서 성장합니다. 림프구는 T, B, 자연살해(Natural Killer, NK) 세포를 포함한 면역계의 세포로, 림프 기관과 혈류에 존재한다7.
여기에 설명된 RWV 2D 클리노스타트는 시간-평균 중력 벡터 무효화(5,6,8,9)의 원리에 따라 동작하며, 이에 의해 중력 벡터는 수평 축 상의 세포 배양물의 회전을 통해 무작위화된다. 이것은 배양 용기의 회전 속도를 세포의 침강 속도와 일치시킴으로써 달성됩니다. 배양 용기의 회전 속도가 세포의 침강 속도와 잘 일치하는 한, 세포는 자유 낙하 상태로 유지되며 우주 환경에서 경험하는 것처럼 침전될 수 없습니다. 초기 속도 향상 단계 후, 배양 용기의 배지는 결국 시간이 지남에 따라 "고체 회전"에 도달합니다. 이러한 수평 회전은 또한 세포 배양 용기 내의 층류를 유도한다. 이것은 층류에 의해 세포에 유도된 전단 응력이 난류의 전단 응력보다 훨씬 적다는 점을 감안할 때 "낮은 전단" 환경을 만듭니다. 그러나 클리노스타트가 완벽한 시스템이 아니라는 점을 감안할 때 세포에 최소한의 전단 응력을 가하는 작은 층류 유체 운동이 도입됩니다. 따라서 미디어에 부유하는 셀은 회전 중에 이 흐름에 의해 끌립니다. 수평 회전 중에 중력 벡터는 세포에 작용하여 그림 1에 시각화된 것처럼 세포를 진동 궤적으로 만듭니다. 전단 응력의 또 다른 작은 원인은 세포가 매체를 통해 "떨어지는" 세포로 인해 세포 주위에 층류를 일으키기 때문에 발생합니다. 배양 용기가 수평축을 중심으로 회전함에 따라 세포가 경험하는 중력 벡터도 회전합니다. 시간이 지남에 따라 이 회전하는 중력 벡터는 평균적으로 0에 접근합니다. 이 현상을 시간 평균 중력 벡터 무효화라고 하며 SMG 5,6,8,9의 상태를 유도합니다. 이 장치는 많은 유형의 세포에 대한 SMG의 효과를 연구하는 데 사용되었으며, 그 중 일부는 참고 문헌10,11,12에서 다룹니다. 더 많은 예는 장치 제조업체의 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다.
이 RWV 장치는 장치 제조업체를 통해 사용할 수 있는 특수 "고종횡비 용기"(HARB)를 사용합니다. 이 HARV는 각각 10mL의 세포 배양을 보유합니다. 그러나 50mL HARV도 사용할 수 있습니다. 10mL 또는 50mL HARV는 다운스트림 실험 분석을 완료하는 데 필요한 세포 수에 따라 사용할 수 있으며, 이는 논의 섹션에서 자세히 설명합니다. HARV는 폴리카보네이트로 만들어졌으며 세포 배양 중에 가스 교환을 허용하기 위해 실리콘 산소화 멤브레인을 포함합니다. 이것은 세포 배지의 pH를 유지하고 효율적인 세포 호흡을 가능하게 합니다. 용기 표면에는 주 충전 포트와 두 개의 캡이 있는 주사기 포트가 있습니다(그림 2A). 주 충전 포트를 통해 세포 배양물을 적재한 후 기포 제거를 돕기 위해 두 개의 주사기를 용기에 적재합니다. 10mL 용기를 사용할 때 두 개의 3mL 주사기가 잘 작동합니다. 한 주사기는 주사기를 완전히 누른 상태에서 빈 상태로 장치에 부착되고 다른 주사기는 3mL의 세포 배양액으로 채워져 부착됩니다(그림 2E). 이들은 SMG 처리를 유지하는 데 중요한 혈관에서 기포를 제거하기 위해 조합하여 사용됩니다. 일반적으로 "플라스크" 대조군과 "1G" 대조군이라고 할 수 있는 두 개의 음성 대조군을 설정하는 것이 좋습니다. "플라스크" 대조군은 표준 T25 현탁액 세포 배양 플라스크에서 성장되는 세포에 상응한다. 1G 대조군은 특수 10mL 배양 용기에서 성장한 세포에 해당하며, 이는 단순히 인큐베이터에 배치됩니다(즉, SMG 처리를 거치지 않고). 컨트롤에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하세요.
여기에 설명된 방법은 NK92 세포주13을 사용하여 NK 세포에 특히 중점을 두고 림프구에 대한 SMG의 효과를 연구하려는 모든 연구자에게 적합합니다. 이러한 연구의 결과는 우주 비행이 인간 면역 체계에 미치는 악영향을 더 잘 이해하고 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>D-410</td>
			<td>Gamma sterilized culture vessels (4/box)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok tip syringes (3 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>For attaching to the 10 mL HARVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92 Cell-line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4D</td>
			<td>Rotating wall vessel device; 2D clinostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 suspension culture flasks</td>
			<td>Sarsedt</td>
			<td>83.3910.502</td>
			<td>For flask control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system

우주에서 생물학적 연구를 수행하는 현재의 한계를 감안할 때, 세포 배양을 지구의 모의 미세 중력 (SMG)에 적용하기위한 몇 가지 옵션이 있습니다. 이러한 옵션은 방법, 원리 및 현탁 세포 배양에 사용하기에 적합한지 여부에 따라 다릅니다. 여기서, 세포 배양 방법은 2D 클리노스타트 또는 회전 벽 용기(RWV) 장치라고도 하는 상업적으로 이용 가능한 회전 세포 배양 시스템을 사용하여 림프구를 시뮬레이션된 미세 중력에 노출시키는 방법을 설명합니다. 이 세포 배양 방법은 시간 평균 중력 벡터 무효화 원리를 활용하여 수평 축에서 세포를 회전시켜 미세 중력을 시뮬레이션합니다. 이 시스템에서 배양된 세포는 세포 기능 및 생리학에 대한 시뮬레이션된 미세중력의 영향을 평가하기 위해 다양한 실험 분석에서 수확 및 활용될 수 있습니다. 배양 기술은 사용되는 세포 유형 또는 계통에 따라 약간 다를 수 있지만 여기에 설명된 방법은 모든 현탁액 유형 세포 배양에 적용될 수 있습니다.

이 배양 방법은 1) 세포의 증식이 대조군(이상적으로는 모든 실험군)에 걸쳐 거의 일관되고, 2) 파종 밀도, 처리 기간 및 세포 유형/계통의 배가 시간을 고려할 때 증식이 적절하고, 3) 수확된 세포의 생존율이 85% 이상인 경우 성공적인 것으로 간주됩니다(표 1 ). 이상적으로, 생성된 세포는 특히 후속 실험 및 분석에 사용하기 위해 표준 세포 배양에서와 같이 건강해야 합니다(즉, 생존율 ...

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Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System

이것은 상업적으로 이용 가능한 회전 세포 배양 시스템을 사용하여 특수 일회용 배양 용기를 사용하여 시뮬레이션된 미세 중력에서 림프구를 배양하기 위한 단계별 가이드입니다. 이러한 배양 방법은 모든 현탁형 세포 배양액에 적용될 수 있다.

Rotary Cell Culture System을 사용하여 시뮬레이션된 미세중력에서 림프구 배양

Given the current limitations of conducting biological research in space, a few options exist for subjecting cell culture to simulated microgravity (SMG) ...

이 기술을 통해 면역 세포에 대한 시뮬레이션된 미세중력의 영향을 연구하여 우주 환경의 측면이 분자 수준에서 인간 생리학에 어떤 영향을 미치는지 더 잘 이해할 수 있습니다. 이 기술은 경제적으로 실현 가능하며 세포 배양을 우주로 보내거나 세포 배양을 지구의 시뮬레이션된 미세 중력에 적용하는 다른 방법에 비해 설정 및 유지 관리가 상대적으로 쉽습니다. 넘침과 유출을 피하기 위해 용기를 채우면서 천천히 이동하는 것이 좋습니다.초기 기포 제거 후 주사기를 사용하여 용기가 완전히 채워졌는지 확인하십시오. 이렇게 하면 치료 전반에 걸쳐 큰 기포가 형성될 가능성이 최소화됩니다. 플라스틱 포장에서 배양 용기를 꺼내는 것으로 시작하십시오.사용 중인 세포 유형 또는 라인, 대조군 또는 치료 여부 및 기타 관련 정보에 따라 테두리의 각 용기에 라벨을 붙입니다. 용기를 안정시키고 충전 포트 캡 페그 또는 O-링을 건드리지 않고 충전 포트를 조심스럽게 엽니다. 용기가 채워지는 동안 못이나 O-링이 위를 향하도록 하여 에탄올 패드에 캡을 놓습니다.주사기 포트에서 캡을 제거하지 마십시오. 멸균 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 배양에 적합한 완전한 배지 10mL를 용기에 넣고 캡을 충전 포트에 조심스럽게 놓습니다. 주사기 포트 캡과 주입 포트가 단단히 닫혀 있는지 확인하십시오.그런 다음 채워진 용기를 인큐베이터에 넣고 후속 단계를 수행하여 세포 배양을 위한 용기를 프라이밍합니다. 인큐베이터에서 배지 프라이밍 용기를 회수합니다. 플라스크 대조군을 위해, T25 현탁 배양 플라스크에 위에서 제조된 스톡으로부터의 세포 배양물 10 mL를 로딩한다.주사기를 로드하는 데 사용할 별도의 15mL 원뿔형 튜브에 스톡 세포 배양액 10mL를 추가합니다. 주사기 포트 캡의 나사를 풀어 용기에서 제거하고 스톡 스톱콕이 열린 위치에 있는지 확인합니다. 용기를 안정시키고 충전 포트 캡 페그 또는 O-링을 건드리지 않고 충전 포트를 조심스럽게 엽니다.용기가 채워지는 동안 페그 또는 O-링이 위를 향하도록 캡을 에탄올 패드에 놓습니다. 스톱콕이 열린 위치에 있는지 확인하십시오. 혈청학적 피펫을 사용하여 용기의 배지를 폐기물 용기에 부어 용기를 비울 수 있습니다.또는 진공 시스템에 부착된 피펫을 지나 멸균 유리를 사용하여 배지를 흡입합니다. 피펫 또는 진공 시스템을 사용하는 동안 산소 공급 멤브레인을 만지면 손상되고 용기를 사용할 수 없게 될 수 있으므로 만지지 마십시오. 준비된 스톡 세포 배양액이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브를 단단히 닫고 내용물을 완전히 혼합하기 위해 몇 번 부드럽게 뒤집습니다.신선한 멸균 혈청학적 피펫을 사용하여 50mL 튜브에서 10mL의 세포 배양 스톡을 채취합니다. 용기를 들어 올려 채우기 포트가 위쪽을 향하도록 기울입니다. 그런 다음 세포 배양 스톡을 충전 포트를 통해 용기에 조심스럽게 분배합니다.엎지르지 않도록 용기를 다시 아래로 기울이면서 용기를 채우기 포트 끝까지 채우십시오. 피펫으로 산소화 멤브레인은 매우 약하므로 만지지 않도록 주의하십시오. 용기에 짐을 싣고 O-링을 건드리지 않고 조심스럽게 충전 포트 캡을 다시 씌웁니다.패키지에서 처음 3mL 주사기를 꺼내고 몇 번 펌핑하여 풉니다. 그런 다음 주사기를 주사기 포트 중 하나에 부착하여 주사기가 완전히 눌려졌는지 확인합니다. 10mL의 분취량 세포 배양액이 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브를 단단히 닫고 부드럽게 몇 번 뒤집어 내용물을 완전히 혼합합니다.마찬가지로 패키지에서 두 번째 3mL 주사기를 꺼내 몇 번 펌핑합니다. 그런 다음 이 주사기를 15mL 원뿔형 튜브에서 세포 배양액에 조심스럽게 반담궈 배양액을 끌어냅니다. 주사기를 튜브에 완전히 다시 분배하고 3mL의 배양액을 끌어내어 기포를 최소화합니다.채워진 주사기를 나머지 주사기 포트에 부착하고 에탄올 패드로 주사기와 주입구 주변을 조심스럽게 소독합니다. 산소 공급 멤브레인에 에탄올을 묻히지 마십시오. 나머지 용기에 대해 이 과정을 반복합니다.마지막 용기를 위해 50mL 코니컬 튜브에 세포 배양이 약간 부족한 경우 주사기를 로드하는 데 사용된 15mL 코니컬 튜브에서 남은 양을 회수합니다. 주사기에서 혈관으로 세포와 기포의 이동을 제한하기 위해 주사기 포트 스톱콕이 닫혀 있는지 확인하십시오. 용기를 거꾸로 뒤집고 몇 번 옆으로 두드려 초기 거품을 모으십시오.용기를 다시 위로 향하게 빠르게 뒤집은 다음 반대쪽을 향한 약간의 각도로 기포가 모두 용기의 위쪽으로 뜨도록 합니다. 빈 주사기로 항구 아래의 거품을 조작하고 항구로 들어가기 시작하는 것을 지켜보십시오. 두 주사기 포트 스톱콕을 모두 엽니다.용기를 부드럽게 두드려 거품이 빈 주사기로 떠오르도록 합니다. 빈 주사기로 더 큰 기포를 천천히 빨아들이면서 전체 주사기를 조심스럽게 눌러 용기의 압력을 유지하여 산소 공급 막이 파열되지 않도록 합니다. 이 과정을 몇 번 반복하여 모든 거품이 제거되었는지 확인합니다.기포가 효과적으로 제거되면 주사기 포트 마개를 닫습니다. 후속 기포 제거를 위해 치료 중에 주사기를 계속 착용하여 두 주사기의 부피가 거의 동일한지 확인하십시오. 회전하는 베이스와 리본 케이블의 표면을 70% 에탄올로 조심스럽게 닦습니다.리본 케이블이 전원 공급 장치에 연결되어 있는지 확인합니다. 회전베이스를 인큐베이터에 놓고 리본 케이블을 받침대에 부착합니다. 전원 공급 장치를 인큐베이터 외부에 배치하십시오.용기 나사산을 회전하는 페그에 정렬하고 베이스의 회전 페그를 시계 반대 방향으로 부드럽게 돌려 SMG 처리 용기를 부착합니다. 용기가 단단히 부착되었는지 확인하십시오. 물 트레이에 오토클레이브 RO 물을 채워 인큐베이터를 약 100% 습도로 유지합니다.세포가 배지를 통해 떨어지지 않도록 세포의 침강 속도와 일치하도록 인큐베이터의 회전 속도를 조정합니다. 치료를 시작한 첫날, 텍스트 원고에 설명 된대로 몇 시간마다 기포 형성을 확인하십시오. 원하는 치료 기간이 끝날 때까지 적어도 하루에 한 번 거품을 제거하십시오.계획된 치료 기간이 경과하면 회전을 멈추고 장치를 분해하십시오. 장치의 회전하는 페그를 시계 방향으로 돌리면서 용기를 고정된 상태로 부드럽게 잡고 처리 용기를 제거합니다. 제어 플라스크, 제어 및 처리된 용기를 멸균된 생물학적 안전 캐비닛으로 가져옵니다.컨트롤 플라스크를 제외한 각 용기를 잡고 뒤집어 아래를 향하도록 합니다. 그런 다음 부드럽게 두드려 모든 세포를 현탁액으로 만듭니다. 그런 다음 충전 포트가 바닥을 향하도록 용기를 옆으로 돌리고 다시 쳐서 효율적인 흡인을 위해 셀을 충전 포트 쪽으로 안내합니다.각 용기를 개별적으로 취급하십시오. 두 포트에서 주사기의 나사를 풀고 생물학적 위험 폐기물에 분배합니다. 주사기 포트의 마개를 엽니다.충전 포트 캡을 조심스럽게 제거하고 멸균된 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 내용물을 끌어올리고 용기를 비울 때 기울입니다. 모든 대조군과 처리군의 내용물을 개별적으로 라벨이 붙은 15mL 원뿔형 튜브에 분주합니다. 각 튜브를 닫고 부드럽게 몇 번 뒤집어 제대로 혼합되었는지 확인합니다.생성된 세포 배양물의 농도 및 생존율을 결정하기 위해 바람직한 방법을 사용하여 후속 실험 분석을 준비한다. NK-92 세포주를 시작 생존율 및 착석 밀도를 결과적인 최종 생존율 및 최종 농도와 비교하였다. 72시간 SMG 치료 후 두 가지 부정적인 결과와 긍정적인 결과를 비교했습니다.비교를 위해, 사용된 NK-92 세포주의 최적 농도 범위는 밀리리터당 0.3 내지 120만 세포였으며, 배가 시간은 약 2 내지 3일이었다. SMG 처리군에서의 증식은 대조군 및 처리군에 걸쳐 거의 동일하였다. 이러한 매개변수는 다운스트림 실험 성공에 필수적이었고 두 대조군의 결과 세포는 다운스트림 실험 분석에서 유사하게 수행되었습니다.처리 과정 전반에 걸쳐, 특히 시뮬레이션된 미세 중력에 노출되는 세포 배양에서 기포 형성을 모니터링하고 설명하는 것이 중요합니다. 큰 기포 형성은 용기 내의 유체 역학에 혼란을 야기할 수 있으며, 이는 본질적으로 시뮬레이션된 미세 중력 조건을 무효화합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

헤르페스의 연구를위한 예비 신경 세포 문화 시스템은 바이러스 지연 및 재가입을 단순

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

연구

면역학 및 감염병학

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

신생아와 성인 중추 신경계에서 배양 소교 세포

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

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분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

기자 마우스를 사용하여 IL-22 발현 림프구의 시각화

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

형광 상관 분광학에 의해 측정 된 차 림프구의 플라즈마 막 분자 확산

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과<em&gt; 체외</em인터페론의&gt; 예방 효과

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

면역 마약 식별을위한 T 림프구에서 미토 겐 유도 블라스의 신속한 정량

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...