Name: culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system
Uploaded: 2022-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

Este trabalho é apoiado pela Agência Espacial Canadense (CSA), bolsa de pesquisa (17ILSRA3, Immuno Profile). Os autores gostariam de reconhecer e agradecer ao Dr. Roxanne Fournier (Universidade de Toronto), ao Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial University) e à Preteesh Mylabathula (Universidade do Arizona) por sua ajuda com a solução inicial de problemas deste protocolo.

NOTA: As seguintes etapas devem ser concluídas dentro de um armário de segurança biológica estéril.
1. Preparação dos vasos para cultura celular
<ol><li>Retire os recipientes de cultura das embalagens plásticas. Rotular cada recipiente na borda de acordo com o tipo/linha celular que está sendo usado, se é o controle (1G) ou o tratamento (SMG), e qualquer outra informação relevante.</li>
	<li>Estabilize o navio e abra a porta de enchimento cuidadosamente, sem toca...

<ol>
	<li>ElGindi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+the+force+be+with+you+(or+not):+the+immune+system+under+microgravity.">May the force be with you (or not): the immune system under microgravity.</a> Cells. 10 (8), 1941 (2021).</li><li>Chouk&#232;r, A., Ullrich, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+system+dysregulation+during+spaceflight:+potential+countermeasures+for+deep+space+exploration+missions.">Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Countermeasures-based+improvements+in+stress,+immune+system+dysregulation+and+latent+herpesvirus+reactivation+onboard+the+International+Space+Station+-+relevance+for+deep+space+missions+and+terrestrial+medicine.">Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine.</a> Neuroscience &amp; Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).</li><li>Herranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground-based+facilities+for+simulation+of+microgravity:+organism-specific+recommendations+for+their+use,+and+recommended+terminology.">Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology.</a> Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).</li><li>Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+current+microgravity+platforms+for+space+biology+research.">Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research.</a> Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).</li><li>Murphy, K., Weaver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Janeway's Immunobiology 9th Edition. , (2016).</li><li>Dedolph, R. R., Dipert, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+gravity+stimulus+nullification+by+clinostat+rotation.">The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation.</a> Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).</li><li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+suspension+culture:+the+rotating-wall+vessel.">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).</li><li>Crabb&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+proteomic+responses+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+to+spaceflight+conditions+involve+Hfq+regulation+and+reveal+a+role+for+oxygen.">Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).</li><li>Ulbrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+simulated+and+real+microgravity+on+bone+cells+and+mesenchymal+stem+cells.">The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells.</a> BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).</li><li>Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+and+simulated+microgravity+cause+a+significant+reduction+of+key+gene+expression+in+early+T-cell+activation.">Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).</li><li>Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+cell+line+(NK-92)+with+phenotypical+and+functional+characteristics+of+activated+natural+killer+cells.">Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.</a> Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).</li><li>Williams, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+NK-92+cells+for+refractory+hematological+malignancies+relapsing+after+autologous+hematopoietic+cell.">A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell.</a> Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).</li><li>Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol">https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol</a> (2022)</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2022)</li><li>Mylabathula, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+disarms+human+NK-cells+and+inhibits+anti-tumor+cytotoxicity+in+vitro.">Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro.</a> Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+simulated+microgravity+on+primary+human+NK+cells.">Effects of simulated microgravity on primary human NK cells.</a> Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).</li><li>Shao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+effect+of+simulated+microgravity+on+the+cytotoxicity+of+NK+cells+following+the+DNA+methylation+of+NKG2D+and+the+expression+of+DAP10.">Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10.</a> Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).</li><li>Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+attachment-independent+biofilm+formation+and+repression+of+hfq+expression+by+low-fluid-shear+culture+of+Staphylococcus+aureus.">Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).</li><li>Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air+bubble-isolating+rotating+wall+vessel+bioreactor+for+improved+spheroid/organoid+formation.">An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).</li></ol>

À medida que a humanidade se prepara para missões espaciais mais longas à Lua e a Marte, mais pesquisas precisam ser conduzidas para mitigar sérios riscos à saúde dos astronautas. Um aspecto importante do ambiente espacial que impacta a fisiologia humana é a microgravidade. Aqui, um método de cultura celular foi descrito para submeter linfócitos à SMG usando um sistema de cultura de células rotativas comercialmente disponível.
Esse protocolo contém algumas etapas críticas que tal...

Foi demonstrado que o voo espacial impacta muitos aspectos da fisiologia humana, incluindo o sistema imunológico. Muitos estudos têm demonstrado evidências de desregulação imunológica como resultado de voo espacial in vivo e exposição à microgravidade simulada (SMG) in vitro 1,2,3,4. Um aspecto importante do ambiente espacial que impacta a fisiologia humana é a microgravidade. A microgravidade refere-se à "ausência de gravidade" experimentada devido às baixas forças gravitacionais no ambiente espacial5. À medida que a humanidade se prepara para missões espaciais mais longas à Lua e a Marte, mais pesquisas precisam ser conduzidas para mitigar sérios riscos à saúde dos astronautas.
Condições reais de microgravidade para a pesquisa científica podem ser alcançadas no espaço a bordo da Estação Espacial Internacional (ISS) ou em nanossatélites lançados em órbita; No entanto, essas opções podem ser incrivelmente caras e complexas de orquestrar. Dadas as limitações atuais da realização de pesquisas biológicas no espaço, existem várias opções para induzir microgravidade real e SMG na Terra. Existem operações em grande escala que podem produzir curtos períodos de microgravidade real na Terra, incluindo torres de queda, voo parabólico e foguetes de sondagem. No entanto, esses métodos não são excessivamente adequados para estudar os efeitos da microgravidade em sistemas biológicos, em grande parte devido aos seus curtos períodos de tratamento de microgravidade (isto é, segundos a 20 min). Esses métodos são discutidos mais detalhadamente em outras publicações 5,6. As opções que são adequadas para cultura de células biológicas incluem dispositivos de pequena escala, como clinostatos 2D ou dispositivos de vasos de parede rotativa (RWV) e clinostatos 3D ou máquinas de posicionamento aleatório (RPM). Esses dispositivos podem ser instalados dentro de incubadoras de cultura celular mantidas a 37 °C e 5% CO2, e eles giram a cultura celular em um eixo horizontal (2D) ou em dois eixos perpendiculares (3D)5. No entanto, é importante enfatizar que esses métodos de cultivo produzem SMG em oposição à microgravidade real, que é mais viável no espaço para contextos de pesquisa biológica.
O objetivo do presente trabalho é delinear os passos para submeter linfócitos à SMG usando um dispositivo RWV comercialmente disponível (Tabela de Materiais), que se enquadra na classificação clinostat 2D. Embora haja um protocolo geral disponível do fabricante para operar este dispositivo, o artigo atual visa cobrir as etapas de solução de problemas e otimização com mais detalhes. Este artigo também aborda a teoria por trás de como este dispositivo funciona para produzir SMG em cultura de células em suspensão, especificamente com linfócitos. Nesse contexto, cultura de células em suspensão refere-se a células crescendo livremente em meios de cultura suplementados, sem aderir a nenhum andaime adicional. Muitos tipos celulares são cultivados em cultura de células em suspensão, incluindo linfócitos. Os linfócitos são células do sistema imune, incluindo as células T, B e Natural Killer (NK), que residem nos órgãos linfoides e na corrente sanguínea7.
O clinostato RWV 2D aqui descrito opera com base no princípio da anulação do vetor gravitacional em média no tempo 5,6,8,9, pelo qual o vetor gravitacional é randomizado através da rotação da cultura celular em um eixo horizontal. Isto é conseguido combinando a velocidade de rotação do vaso de cultura com a velocidade de sedimentação das células. Desde que a velocidade de rotação do vaso de cultura seja bem compatível com a velocidade de sedimentação das células, as células são mantidas em queda livre e incapazes de sedimentar, como experimentado no ambiente espacial. Após uma fase inicial de aceleração, o meio no vaso de cultura finalmente atinge a "rotação do corpo sólido" ao longo do tempo. Essa rotação horizontal também induz fluxo laminar no vaso de cultura celular. Isso cria um ambiente de "baixo cisalhamento", dado que a tensão de cisalhamento induzida nas células pelo fluxo laminar é muito menor do que a do fluxo turbulento. No entanto, dado que o clinostato não é um sistema perfeito, há alguns pequenos movimentos de fluido laminar introduzidos, que infligem estresse de cisalhamento mínimo nas células. Como tal, as células suspensas no meio são arrastadas por esse fluxo durante a rotação. Durante a rotação horizontal, o vetor gravitacional atua sobre as células e as coloca em uma trajetória oscilante, conforme visualizado na Figura 1. Outra pequena fonte de tensão de cisalhamento é causada pela "queda" das células através do meio, causando fluxo laminar ao redor das células. À medida que o vaso de cultura gira em um eixo horizontal, o vetor gravitacional experimentado pelas células também gira. Com o tempo, esse vetor de gravidade giratório faz médias para se aproximar de zero; esse fenômeno é chamado de anulação do vetor gravitacional tempo-médio e induz um estado de SMG 5,6,8,9. Esse dispositivo tem sido utilizado para estudar os efeitos da SMG em diversos tipos de células, algumas das quais são abordadas emreferências10,11,12. Mais exemplos podem ser encontrados no site do fabricante do dispositivo.
Este dispositivo RWV usa "vasos de alta taxa de aspecto" (HARVs) especializados disponíveis através do fabricante do dispositivo. Esses HARVs contêm 10 mL de cultura celular cada; no entanto, HARVs de 50 mL também estão disponíveis. HARVs de 10 mL ou 50 mL podem ser usados dependendo de quantas células são necessárias para completar quaisquer ensaios experimentais a jusante, o que é descrito mais adiante na seção de discussão. Os HARVs são feitos de policarbonato e incluem uma membrana de oxigenação de silicone para permitir a troca gasosa durante a cultura celular. Isso mantém o pH do meio celular e permite uma respiração celular eficiente. Há uma porta de enchimento principal e duas portas de seringa tampadas na face do navio (Figura 2A). Depois de carregar a cultura celular através da porta de enchimento principal, duas seringas são carregadas no recipiente para ajudar na remoção de bolhas. Ao usar os vasos de 10 mL, duas seringas de 3 mL funcionam bem. Uma seringa é acoplada ao dispositivo vazia, com a seringa completamente deprimida, e a outra é anexada preenchida com 3 mL de cultura celular (Figura 2E). Estes são usados em combinação para remover bolhas do vaso, o que é importante para manter o tratamento SMG. Em geral, é aconselhável configurar dois controles negativos, que podem ser chamados de controle "Flask" e controle "1G". O controle "Flask" corresponde às células que são cultivadas em um frasco padrão de cultura de células de suspensão T25. O controle 1G corresponde às células que são cultivadas no vaso de cultura especializado de 10 mL, que é simplesmente colocado na incubadora (ou seja, sem ser submetido ao tratamento SMG). Consulte a seção Discussão para obter mais detalhes sobre controles.
O método aqui descrito é apropriado para qualquer pesquisador que pretenda estudar os efeitos da SMG em linfócitos, com foco específico em células NK utilizando a linhagem celular NK9213. Os resultados desses estudos podem nos ajudar a entender melhor e mitigar os efeitos adversos dos voos espaciais no sistema imunológico humano.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>D-410</td>
			<td>Gamma sterilized culture vessels (4/box)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok tip syringes (3 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>For attaching to the 10 mL HARVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92 Cell-line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4D</td>
			<td>Rotating wall vessel device; 2D clinostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 suspension culture flasks</td>
			<td>Sarsedt</td>
			<td>83.3910.502</td>
			<td>For flask control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system

Dadas as limitações atuais da realização de pesquisas biológicas no espaço, existem algumas opções para submeter a cultura de células à microgravidade simulada (SMG) na Terra. Essas opções variam em seus métodos, princípios e adequação para uso com cultura de células em suspensão. Aqui, um método de cultura celular é descrito para submeter linfócitos a microgravidade simulada usando um sistema de cultura de células rotativas comercialmente disponível, também conhecido como clinostato 2D ou dispositivo de vaso de parede rotativa (RWV). Este método de cultura de células utiliza o princípio da anulação vetorial gravitacional em média no tempo para simular a microgravidade girando as células em um eixo horizontal. As células cultivadas neste sistema podem ser colhidas e utilizadas em diferentes ensaios experimentais para avaliar os efeitos da microgravidade simulada sobre a função e fisiologia celular. A técnica de cultivo pode variar ligeiramente dependendo do tipo ou linhagem celular utilizada, mas o método aqui descrito pode ser aplicado a qualquer cultura celular do tipo suspensão.

Esse método de cultivo é considerado bem-sucedido se 1) a proliferação das células for aproximadamente consistente entre os grupos controle (e idealmente todos os grupos experimentais), 2) a proliferação for apropriada dada a densidade de semeadura, o tempo de tratamento e o tempo de duplicação do tipo/linhagem celular, e 3) a viabilidade das células colhidas for de 85% ou mais (Tabela 1 ). Idealmente, as células resultantes deveriam ser tão saudáveis quanto seriam em cultura celular padrão...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System

Este é um guia passo a passo para o uso de um sistema de cultura de células rotativas comercialmente disponível para cultivar linfócitos em microgravidade simulada usando vasos de cultura descartáveis especializados. Este método de cultura pode ser aplicado a qualquer cultura celular do tipo suspensão.

Cultivo de Linfócitos em Microgravidade Simulada utilizando Sistema de Cultura de Células Rotativas

Given the current limitations of conducting biological research in space, a few options exist for subjecting cell culture to simulated microgravity (SMG) ...

Esta técnica permite-nos estudar os efeitos da microgravidade simulada nas células imunitárias para nos ajudar a compreender melhor como aspectos do ambiente espacial afetam a fisiologia humana a nível molecular. Esta técnica é economicamente viável e é relativamente fácil de configurar e manter em comparação com o envio de cultura de células para o espaço ou outros métodos de submeter a cultura de células à microgravidade simulada na Terra. Recomenda-se ir lentamente enquanto enche os vasos, a fim de evitar transbordamento e derramamento.Após a remoção inicial da bolha, certifique-se de que os recipientes estão completamente cheios usando as seringas. Isso minimizará as chances de formação de grandes bolhas ao longo do tratamento. Comece retirando os recipientes de cultura das embalagens plásticas.Rotule cada recipiente na borda de acordo com o tipo de célula ou linha que está sendo usada, se está no controle ou tratamento e qualquer outra informação relevante. Estabilize o recipiente e abra a porta de enchimento cuidadosamente sem tocar no pino da tampa da porta de enchimento ou no O-ring. Coloque a tampa em uma almofada de etanol com o pino ou O-ring virado para cima enquanto o recipiente está cheio.Não retire as tampas das portas da seringa. Carregar o recipiente com 10 mL do meio completo apropriado para a cultura celular usando uma pipeta sorológica estéril e colocar cuidadosamente a tampa no orifício de enchimento. Certifique-se de que as tampas da porta da seringa e a porta de enchimento estão bem fechadas.Em seguida, coloque os vasos preenchidos em uma incubadora enquanto realiza as etapas subsequentes para preparar os vasos para cultura celular. Recupere os vasos preparados da incubadora. Para um balão de controle, carregar um frasco de cultura de suspensão T25 com 10 mL de cultura celular do estoque preparado acima.Adicionar 10 mL de cultura de células-estoque a um tubo cônico separado de 15 mL, que será usado para carregar as seringas. Desparafuse as tampas das portas da seringa para removê-las do navio e garantir que as torneiras de estoque estejam na posição aberta. Estabilize o recipiente e abra a porta de enchimento cuidadosamente sem tocar no pino da tampa da porta de enchimento ou no O-ring.Coloque a tampa em uma almofada de etanol com o pino ou O-ring virado para cima enquanto o recipiente está sendo preenchido. Certifique-se de que as torneiras estão na posição aberta. O recipiente pode ser esvaziado despejando o meio do recipiente em um recipiente de resíduos usando uma pipeta sorológica.Alternativamente, aspirar o meio usando um vidro estéril passando pela pipeta conectada a um sistema de vácuo. Ao usar uma pipeta ou o sistema de vácuo, certifique-se de não tocar na membrana de oxigenação, pois isso pode danificá-la e tornar o vaso inutilizável. Feche bem o tubo cônico de 50 mL que contém a cultura de células-estoque preparada e inverta-o suavemente algumas vezes para misturar o conteúdo completamente.Retirar 10 mL de cultura celular do tubo de 50 mL com uma pipeta sorológica estéril fresca. Pegue o navio e incline-o, de modo que a porta de enchimento esteja em direção ao topo. Em seguida, distribua cuidadosamente o estoque de cultura de células no recipiente através do porto de enchimento.Encha o navio até a ponta do porto de enchimento, enquanto inclina o navio de volta para baixo para evitar derramamentos. Tenha cuidado para não tocar a membrana de oxigenação com a pipeta, pois ela é muito frágil. Uma vez que o navio esteja carregado, coloque cuidadosamente a tampa da porta de enchimento de volta sem tocar no O-ring.Retire a primeira seringa de 3 mL de sua embalagem e bombeie-a algumas vezes para soltá-la. Em seguida, conecte a seringa a uma das portas da seringa, garantindo que a seringa esteja totalmente pressionada. Fechar bem o tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de cultura de alíquota e invertê-lo suavemente algumas vezes para misturar o conteúdo completamente.Da mesma forma, retire a segunda seringa de 3 mL de sua embalagem e bombeie-a algumas vezes. Em seguida, cuidadosamente semi-submersa esta seringa na cultura celular a partir do tubo cônico de 15 mL e fazer alguma cultura. Minimize as bolhas de ar distribuindo totalmente a seringa de volta para o tubo e extraindo 3 mL de cultura.Fixe a seringa cheia à porta da seringa restante e higienize cuidadosamente as seringas e a porta de enchimento com uma almofada de etanol. Não obter etanol na membrana de oxigenação. Repita o processo para os vasos restantes.Se houver uma cultura celular ligeiramente insuficiente no tubo cônico de 50 mL para o último vaso, recupere a quantidade restante do tubo cônico de 15 mL usado para carregar as seringas. Certifique-se de que as torneiras das portas da seringa estão fechadas para limitar a migração de células e bolhas das seringas para os recipientes. Vire o vaso de cabeça para baixo e bata-o de lado algumas vezes para coletar as bolhas iniciais.Vire rapidamente o vaso de volta para cima e, em seguida, em um leve ângulo voltado para longe, de modo que as bolhas flutuem todas para o lado ascendente do vaso. Manobrar as bolhas sob a porta com a seringa vazia e vê-las começar a entrar na porta. Abra as duas torneiras da porta da seringa.Bata suavemente no recipiente para incentivar as bolhas a flutuar até a seringa vazia. Sugue lentamente as bolhas maiores com a seringa vazia enquanto deprime cuidadosamente a seringa cheia para manter a pressão no vaso, para que a membrana de oxigenação não estoure. Repita esse processo algumas vezes para garantir que todas as bolhas sejam removidas.Quando as bolhas tiverem sido efetivamente removidas, feche as torneiras da porta da seringa. Mantenha as seringas ligadas durante o tratamento para permitir a remoção subsequente da bolha, garantindo que o volume em ambas as seringas seja aproximadamente igual. Limpe cuidadosamente a superfície da base giratória e do cabo de fita com 70% de etanol.Verifique se o cabo de fita está conectado à fonte de alimentação. Coloque a base giratória na incubadora e prenda o cabo de fita à base. Coloque a fonte de alimentação perto, mas fora da incubadora.Conecte o recipiente de tratamento SMG alinhando as roscas do vaso ao pino giratório e girando suavemente o pino giratório na base no sentido anti-horário. Certifique-se de que o recipiente está preso de forma segura. Mantenha a incubadora com aproximadamente 100% de umidade enchendo a bandeja de água com água de autoclave RO.Ajuste a velocidade de rotação da incubadora para corresponder à velocidade de sedimentação das células, de modo que as células não caiam através do meio. No primeiro dia de instalação do tratamento, verifique a formação de bolhas a cada poucas horas, conforme descrito no manuscrito do texto. Remova as bolhas pelo menos uma vez por dia até o final da duração do tratamento desejado.Uma vez decorrido o tempo de tratamento planejado, pare a rotação e desmonte o aparelho. Remova o recipiente de tratamento segurando suavemente o recipiente parado enquanto gira o pino giratório do dispositivo no sentido horário. Coloque o frasco de controle, o recipiente de controle e o recipiente tratado em um armário de segurança biológica estéril.Pegue cada recipiente, excluindo o balão de controle, e vire-o, de modo que ele fique virado para baixo. Em seguida, golpeie-o suavemente para colocar todas as células em suspensão. Em seguida, vire o vaso de lado com a porta de enchimento em direção ao fundo e golpeie-o novamente para guiar as células em direção à porta de enchimento para uma aspiração eficiente.Manuseie cada embarcação individualmente. Desparafuse as seringas das duas portas e distribua-as nos resíduos de risco biológico. Abra as torneiras nas portas da seringa.Remova cuidadosamente a tampa da porta de enchimento e retire o conteúdo usando uma pipeta sorológica estéril de 10 mL, inclinando o recipiente à medida que é esvaziado. Distribuir o conteúdo de todos os grupos de controle e tratamento em tubos cônicos de 15 mL rotulados individualmente. Feche cada tubo e inverta-os suavemente algumas vezes para garantir que estão devidamente misturados.Use o método preferido para determinar a concentração e a viabilidade da cultura celular resultante para se preparar para ensaios experimentais subsequentes. A viabilidade inicial da linhagem NK-92 e as densidades de assentos foram comparadas com a viabilidade final e concentrações finais resultantes. Após um tratamento de 72 horas com SMG, dois casos de desfechos negativos e positivos foram comparados.Para comparação, a faixa de concentração ótima da linhagem celular NK-92 utilizada foi entre 0,3 a 1,2 milhão de células por mililitro, com um tempo de duplicação de cerca de dois a três dias. A proliferação no grupo de tratamento com SMG foi aproximadamente igual entre os grupos controle e tratamento. Estes parâmetros foram essenciais para o sucesso experimental a jusante e as células resultantes dos dois grupos controle tiveram desempenho semelhante em ensaios experimentais a jusante.É crucial monitorar e contabilizar a formação de bolhas ao longo do tratamento, especialmente na cultura de células que está sendo submetida à microgravidade simulada. A formação de grandes bolhas pode causar ruptura na dinâmica dos fluidos dentro do vaso, e isso essencialmente anulará a condição de microgravidade simulada.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Um sistema de cultura primária Neuron para o Estudo da Herpes Simplex Virus latência e reativação

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Imunologia e Infecção

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Difusão molecular em membranas plasmáticas de linfócitos primários medida por fluorescência Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Virus Zika sistema de cultura celular Infecciosas e do<em&gt; In Vitro</em&gt; Efeito profilático de interferões

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Quantificação rápida de blastogénese induzida por Mitogénio em linfócitos T para identificar drogas imunomoduladoras

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...