Name: culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system
Uploaded: 2022-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

Эта работа поддержана Канадским космическим агентством (CSA), исследовательский грант (17ILSRA3, Immuno Profile). Авторы выражают признательность и благодарность доктору Роксане Фурнье (Университет Торонто), доктору Рэндалу Греггу (Мемориальный университет Линкольна) и Претишу Милабатуле (Университет Аризоны) за их помощь в первоначальном устранении неполадок этого протокола.

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены внутри стерильного шкафа биологической безопасности.
1. Подготовка сосудов для культивирования клеток
<ol><li>Достаньте сосуды для культивирования из пластиковой упаковки. Маркируйте каждый сосуд на ободе в соотв...

<ol>
	<li>ElGindi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+the+force+be+with+you+(or+not):+the+immune+system+under+microgravity.">May the force be with you (or not): the immune system under microgravity.</a> Cells. 10 (8), 1941 (2021).</li><li>Chouk&#232;r, A., Ullrich, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+system+dysregulation+during+spaceflight:+potential+countermeasures+for+deep+space+exploration+missions.">Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Countermeasures-based+improvements+in+stress,+immune+system+dysregulation+and+latent+herpesvirus+reactivation+onboard+the+International+Space+Station+-+relevance+for+deep+space+missions+and+terrestrial+medicine.">Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine.</a> Neuroscience &amp; Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).</li><li>Herranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground-based+facilities+for+simulation+of+microgravity:+organism-specific+recommendations+for+their+use,+and+recommended+terminology.">Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology.</a> Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).</li><li>Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+current+microgravity+platforms+for+space+biology+research.">Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research.</a> Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).</li><li>Murphy, K., Weaver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Janeway's Immunobiology 9th Edition. , (2016).</li><li>Dedolph, R. R., Dipert, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+gravity+stimulus+nullification+by+clinostat+rotation.">The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation.</a> Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).</li><li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+suspension+culture:+the+rotating-wall+vessel.">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).</li><li>Crabb&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+proteomic+responses+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+to+spaceflight+conditions+involve+Hfq+regulation+and+reveal+a+role+for+oxygen.">Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).</li><li>Ulbrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+simulated+and+real+microgravity+on+bone+cells+and+mesenchymal+stem+cells.">The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells.</a> BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).</li><li>Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+and+simulated+microgravity+cause+a+significant+reduction+of+key+gene+expression+in+early+T-cell+activation.">Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).</li><li>Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+cell+line+(NK-92)+with+phenotypical+and+functional+characteristics+of+activated+natural+killer+cells.">Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.</a> Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).</li><li>Williams, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+NK-92+cells+for+refractory+hematological+malignancies+relapsing+after+autologous+hematopoietic+cell.">A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell.</a> Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).</li><li>Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol">https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol</a> (2022)</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2022)</li><li>Mylabathula, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+disarms+human+NK-cells+and+inhibits+anti-tumor+cytotoxicity+in+vitro.">Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro.</a> Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+simulated+microgravity+on+primary+human+NK+cells.">Effects of simulated microgravity on primary human NK cells.</a> Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).</li><li>Shao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+effect+of+simulated+microgravity+on+the+cytotoxicity+of+NK+cells+following+the+DNA+methylation+of+NKG2D+and+the+expression+of+DAP10.">Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10.</a> Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).</li><li>Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+attachment-independent+biofilm+formation+and+repression+of+hfq+expression+by+low-fluid-shear+culture+of+Staphylococcus+aureus.">Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).</li><li>Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air+bubble-isolating+rotating+wall+vessel+bioreactor+for+improved+spheroid/organoid+formation.">An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).</li></ol>

По мере того, как человечество готовится к более длительным космическим миссиям на Луну и Марс, необходимо провести дополнительные исследования, чтобы снизить серьезные риски для здоровья астронавтов. Одним из основных аспектов космической среды, влияющих на физиологию человека, явля...

Было показано, что космический полет влияет на многие аспекты физиологии человека, включая иммунную систему. Многие исследования продемонстрировали доказательства иммунной дисрегуляции в результате космического полета in vivo и воздействия моделируемой микрогравитации (SMG) in vitro1,2,3,4. Одним из основных аспектов космической среды, влияющих на физиологию человека, является микрогравитация. Микрогравитация относится к «невесомости», испытываемой из-за низких гравитационных сил в космической среде5. По мере того, как человечество готовится к более длительным космическим миссиям на Луну и Марс, необходимо провести дополнительные исследования, чтобы снизить серьезные риски для здоровья астронавтов.
Реальные условия микрогравитации для научных исследований могут быть достигнуты в космосе на борту Международной космической станции (МКС) или в наноспутниках, выводимых на орбиту; Однако эти варианты могут быть невероятно дорогостоящими и сложными в управлении. Учитывая текущие ограничения проведения биологических исследований в космосе, существует несколько вариантов индуцирования реальной микрогравитации и SMG на Земле. Существуют крупномасштабные операции, которые могут создавать короткие периоды реальной микрогравитации на Земле, включая падающие башни, параболический полет и зондирующие ракеты. Однако эти методы не слишком подходят для изучения воздействия микрогравитации на биологические системы, в основном из-за их коротких периодов обработки в условиях микрогравитации (т.е. от секунд до 20 минут). Эти методы более подробно обсуждаются в другом месте 5,6. Варианты, которые подходят для биологической культуры клеток, включают в себя небольшие устройства, такие как 2D-клиностаты или устройства с вращающимися стенками (RWV), а также 3D-клиностаты или машины случайного позиционирования (RPM). Эти устройства могут быть установлены внутри инкубаторов клеточных культур, поддерживаемых при температуре 37 °C и 5% CO2, и они вращают клеточную культуру либо по горизонтальной оси (2D), либо по двум перпендикулярным осям (3D)5. Тем не менее, важно подчеркнуть, что эти методы культивирования производят SMG в отличие от реальной микрогравитации, которая наиболее реально достигается в космосе для биологических исследований.
Цель настоящей статьи состоит в том, чтобы описать этапы воздействия на лимфоциты SMG с использованием коммерчески доступного устройства RWV (таблица материалов), которое подпадает под классификацию 2D-клиностата. Несмотря на то, что от производителя доступен общий протокол для работы с этим устройством, текущая статья направлена на более подробное рассмотрение шагов по устранению неполадок и оптимизации. В этой статье также рассматривается теория, лежащая в основе того, как это устройство работает для производства SMG в культуре суспензионных клеток, особенно с лимфоцитами. В этом контексте суспензионная клеточная культура относится к клеткам, свободно растущим в добавленных питательных средах, без прилипания к каким-либо дополнительным каркасам. Многие типы клеток выращиваются в культуре суспензионных клеток, включая лимфоциты. Лимфоциты - это клетки иммунной системы, включая Т, В и естественные клетки-киллеры (NK), которые находятся в лимфоидных органах и кровотоке7.
Описанный здесь клиностат RWV 2D работает по принципу усредненного по времени обнуления вектора гравитации 5,6,8,9, при котором вектор силы тяжести рандомизируется путем вращения культуры клеток вокруг горизонтальной оси. Это достигается путем согласования скорости вращения культивального сосуда со скоростью осаждения клеток. До тех пор, пока скорость вращения культурального сосуда хорошо согласуется со скоростью осаждения клеток, клетки находятся в свободном падении и не могут осаждаться, как это происходит в космической среде. После начальной фазы ускорения среда в сосуде для культивирования со временем достигает «вращения твердого тела». Это горизонтальное вращение также индуцирует ламинарный поток в сосуде клеточной культуры. Это создает среду «с низким сдвигом», учитывая, что напряжение сдвига, индуцированное на ячейки ламинарным потоком, намного меньше, чем у турбулентного потока. Однако, учитывая, что клиностат не является идеальной системой, вводятся небольшие движения ламинарной жидкости, которые оказывают минимальное напряжение сдвига на клетки. Таким образом, клетки, взвешенные в среде, увлекаются этим потоком во время вращения. Во время горизонтального вращения вектор силы тяжести воздействует на клетки и выводит их на колеблющуюся траекторию, как показано на рисунке 1. Другой небольшой источник напряжения сдвига вызван тем, что клетки «падают» через среду, вызывая ламинарный поток вокруг клеток. Когда культуральный сосуд вращается вокруг горизонтальной оси, вектор тяжести, испытываемый клетками, также вращается. Со временем этот вращающийся вектор гравитации в среднем приближается к нулю; это явление называется усредненным по времени обнулением вектора гравитации и индуцирует состояние SMG 5,6,8,9. Это устройство использовалось для изучения воздействия SMG на многие типы клеток, некоторые из которых описаны в ссылках10,11,12. Больше примеров можно найти на сайте производителя устройства.
В этом устройстве RWV используются специализированные «сосуды с высоким соотношением сторон» (HARV), доступные у производителя устройства. Каждый из этих HARV содержит 10 мл клеточной культуры; тем не менее, 50 мл HARV также доступны. Можно использовать либо 10 мл, либо 50 мл HARV в зависимости от того, сколько клеток необходимо для завершения любых последующих экспериментальных анализов, которые описаны далее в разделе обсуждения. HARV изготовлены из поликарбоната и включают силиконовую мембрану оксигенации, обеспечивающую газообмен во время культивирования клеток. Это поддерживает рН клеточной среды и обеспечивает эффективное клеточное дыхание. На лицевой стороне сосуда имеется основное заливное отверстие и два закрытых отверстия для шприцев (рис. 2A). После загрузки клеточной культуры через основное заливное отверстие в сосуд загружаются два шприца, чтобы помочь в удалении пузырьков. При использовании сосудов объемом 10 мл хорошо работают два шприца по 3 мл. Один шприц прикрепляется к устройству пустым, при этом шприц полностью нажат, а другой прикрепляется заполненным 3 мл клеточной культуры (рис. 2E). Они используются в комбинации для удаления пузырьков из сосуда, что важно для поддержания лечения SMG. Как правило, рекомендуется установить два отрицательных элемента управления, которые можно назвать контролем «Колба» и контролем «1G». Контроль «Колба» соответствует клеткам, которые выращиваются в стандартной колбе для культуры суспензионных клеток T25. Контроль 1G соответствует клеткам, которые выращиваются в специализированном сосуде для культивирования объемом 10 мл, который просто помещается в инкубатор (т.е. без обработки SMG). Дополнительные сведения об элементах управления см. в разделе «Обсуждение».
Описанный здесь метод подходит для любого исследователя, желающего изучить влияние SMG на лимфоциты, с особым акцентом на NK-клетки с использованием клеточной линииNK92 13. Результаты этих исследований могут помочь нам лучше понять и смягчить неблагоприятное воздействие космического полета на иммунную систему человека.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>D-410</td>
			<td>Gamma sterilized culture vessels (4/box)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok tip syringes (3 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>For attaching to the 10 mL HARVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92 Cell-line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4D</td>
			<td>Rotating wall vessel device; 2D clinostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 suspension culture flasks</td>
			<td>Sarsedt</td>
			<td>83.3910.502</td>
			<td>For flask control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system

Учитывая текущие ограничения проведения биологических исследований в космосе, существует несколько вариантов воздействия на клеточную культуру смоделированной микрогравитации (SMG) на Земле. Эти варианты различаются по своим методам, принципам и пригодности для использования с культурой суспензионных клеток. Здесь описан метод культивирования клеток для воздействия на лимфоциты смоделированной микрогравитации с использованием коммерчески доступной ротационной системы культивирования клеток, также известной как 2D-клиностат или устройство с вращающейся стенкой (RWV). Этот метод культивирования клеток использует принцип усредненного по времени обнуления вектора гравитации для имитации микрогравитации путем вращения клеток вокруг горизонтальной оси. Клетки, культивируемые в этой системе, могут быть собраны и использованы во многих различных экспериментальных анализах для оценки влияния моделируемой микрогравитации на клеточную функцию и физиологию. Метод культивирования может незначительно варьироваться в зависимости от используемого типа клеток или линии, но описанный здесь способ может быть применен к любой культуре клеток суспензионного типа.

Этот метод культивирования считается успешным, если: 1) пролиферация клеток приблизительно одинакова в контрольных группах (и в идеале во всех экспериментальных группах), 2) пролиферация подходящая, учитывая плотность посева, продолжительность обработки и время удвоения типа/линии кле?...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System

Это пошаговое руководство по использованию коммерчески доступной ротационной системы культивирования клеток для культивирования лимфоцитов в условиях имитации микрогравитации с использованием специализированных одноразовых сосудов для культивирования. Этот метод культивирования может быть применен к любой культуре клеток суспензионного типа.

Культивирование лимфоцитов в условиях смоделированной микрогравитации с использованием роторной системы культивирования клеток

Given the current limitations of conducting biological research in space, a few options exist for subjecting cell culture to simulated microgravity (SMG) ...

Этот метод позволяет нам изучать влияние моделируемой микрогравитации на иммунные клетки, чтобы помочь нам лучше понять, как аспекты космической среды влияют на физиологию человека на молекулярном уровне. Этот метод экономически целесообразен и относительно прост в настройке и обслуживании по сравнению с отправкой клеточной культуры в космос или другими методами воздействия на клеточную культуру моделируемой микрогравитации на Земле. Рекомендуется медленно заполнять сосуды, чтобы избежать переполнения и разлива.После первоначального удаления пузырьков убедитесь, что сосуды полностью заполнены с помощью шприцев. Это сведет к минимуму вероятность образования крупных пузырьков на протяжении всего лечения. Начните с того, что выньте сосуды для культивирования из пластиковой упаковки.Пометьте каждый сосуд на ободе в соответствии с типом клетки или используемой линией, независимо от того, находится ли она в контроле или лечении, а также в любой другой соответствующей информации. Стабилизируйте сосуд и осторожно откройте заливное отверстие, не касаясь колышка крышки заливного порта или уплотнительного кольца. Поместите колпачок на прокладку для этанола колышком или уплотнительным кольцом вверх, пока сосуд заполнен.Не снимайте колпачки с портов шприца. Загрузите в сосуд 10 мл соответствующей полной среды для клеточной культуры с помощью стерильной серологической пипетки и осторожно поместите крышку на заливное отверстие. Убедитесь, что крышки порта шприца и заливной порт надежно закрыты.Затем поместите заполненные сосуды в инкубатор, выполняя последующие шаги, чтобы подготовить сосуды для культивирования клеток. Извлеките из инкубатора сосуды, заполненные средой. Для контроля колбы загрузите колбу для культуры суспензии T25 10 мл клеточной культуры из приготовленного выше сырья.Добавьте 10 мл исходной клеточной культуры в отдельную коническую пробирку объемом 15 мл, которая будет использоваться для загрузки шприцев. Отвинтите крышки портов шприца, чтобы извлечь их из сосуда, и убедитесь, что стандартные запорные краны находятся в открытом положении. Стабилизируйте сосуд и осторожно откройте заливное отверстие, не касаясь колышка крышки заливного порта или уплотнительного кольца.Поместите колпачок на прокладку для этанола колышком или уплотнительным кольцом вверх, пока сосуд наполняется. Убедитесь, что запорные краны находятся в открытом положении. Сосуд можно опорожнить, вылив среду из сосуда в контейнер для отходов с помощью серологической пипетки.В качестве альтернативы можно аспирировать носитель с помощью стерильного стекла мимо пипетки, прикрепленной к вакуумной системе. При использовании пипетки или вакуумной системы не прикасайтесь к оксигенационной мембране, так как это может повредить ее и сделать сосуд непригодным для использования. Плотно закройте коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую подготовленную исходную клеточную культуру, и осторожно переверните ее несколько раз, чтобы тщательно перемешать содержимое.Извлеките 10 мл материала клеточной культуры из пробирки объемом 50 мл свежей стерильной серологической пипеткой. Поднимите сосуд и наклоните его так, чтобы заливное отверстие было направлено вверх. Затем осторожно распределите запас клеточной культуры в сосуд через заливное отверстие.Наполните сосуд прямо до кончика заливного отверстия, наклоняя сосуд обратно вниз, чтобы избежать проливания. Будьте осторожны, чтобы не прикоснуться пипеткой к мембране оксигенации, так как она очень хрупкая. После загрузки судна осторожно снова наденьте крышку заливного порта, не касаясь уплотнительного кольца.Извлеките первый шприц объемом 3 мл из упаковки и прокачайте его несколько раз, чтобы ослабить его. Затем прикрепите шприц к одному из портов шприца, убедившись, что шприц полностью нажат. Плотно закройте коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл аликвотной клеточной культуры, и осторожно переверните ее несколько раз, чтобы тщательно перемешать содержимое.Точно так же извлеките из упаковки второй шприц объемом 3 мл и прокачайте его несколько раз. Затем осторожно полупогружают этот шприц в клеточную культуру из конической пробирки объемом 15 мл и извлекают немного культуры. Сведите к минимуму пузырьки воздуха, полностью дозировав шприц обратно в пробирку и набрав 3 мл культуры.Прикрепите наполненный шприц к оставшемуся порту шприца и тщательно продезинфицируйте шприцы и вокруг заливного отверстия прокладкой для этанола. Не допускайте попадания этанола на оксигенационную мембрану. Повторите процесс для остальных сосудов.Если в конической пробирке объемом 50 мл для последнего сосуда осталось немного недостаточно клеточной культуры, извлеките оставшееся количество из конической трубки объемом 15 мл, используемой для загрузки шприцев. Убедитесь, что запорные краны порта шприца закрыты, чтобы ограничить миграцию клеток и пузырьков из шприцев в сосуды. Переверните сосуд вверх дном и несколько раз ударьте его по сторонам, чтобы собрать первоначальные пузырьки.Быстро переверните сосуд спиной вверх, а затем под небольшим углом в сторону, чтобы все пузырьки всплыли на восходящую сторону сосуда. Маневрируйте пузырьками под портом с помощью пустого шприца и наблюдайте, как они начинают входить в порт. Откройте оба запорных крана порта шприца.Осторожно ударьте по сосуду, чтобы пузырьки всплыли в пустой шприц. Медленно всасывайте большие пузырьки пустым шприцем, осторожно нажимая на полный шприц, чтобы поддерживать давление в сосуде, чтобы мембрана оксигенации не лопнула. Повторите этот процесс несколько раз, чтобы убедиться, что все пузырьки удалены.Когда пузырьки будут эффективно удалены, закройте запорные краны порта шприца. Держите шприцы включенными во время лечения, чтобы обеспечить последующее удаление пузырьков, убедившись, что объем в обоих шприцах примерно одинаков. Тщательно протрите поверхность вращающегося основания и ленточного кабеля 70% этанолом.Убедитесь, что ленточный кабель подключен к источнику питания. Поместите вращающееся основание в инкубатор и прикрепите ленточный кабель к основанию. Разместите блок питания рядом, но снаружи инкубатора.Прикрепите сосуд для обработки SMG, выровняв резьбу сосуда с вращающимся штифтом и осторожно повернув вращающийся штифт на основании против часовой стрелки. Убедитесь, что сосуд надежно закреплен. Поддерживайте влажность инкубатора примерно на 100%, заполнив поддон для воды водой обратного осмоса в автоклаве.Отрегулируйте скорость вращения инкубатора в соответствии со скоростью осаждения клеток, чтобы клетки не проваливались через среду. В первый день после начала лечения проверяйте наличие пузырьков каждые несколько часов, как описано в текстовой рукописи. Удаляйте пузырьки не реже одного раза в день до конца желаемой продолжительности лечения.По истечении запланированной продолжительности лечения остановите вращение и разберите аппарат. Снимите лечебный сосуд, осторожно удерживая сосуд в неподвижном положении, поворачивая вращающийся штифт устройства по часовой стрелке. Перенесите контрольную колбу, контрольную и обработанную емкость в стерильный шкаф биологической безопасности.Возьмите каждый сосуд, исключая контрольную колбу, и переверните его так, чтобы он был обращен вниз. Затем аккуратно ударьте по нему, чтобы привести все клетки во взвешенное состояние. Затем поверните сосуд на бок так, чтобы заливное отверстие было направлено ко дну, и ударьте по нему еще раз, чтобы направить ячейки к заливному отверстию для эффективной аспирации.Обрабатывайте каждое судно индивидуально. Открутите шприцы из двух портов и распределите их в биологически опасные отходы. Откройте запорные краны на портах шприца.Осторожно снимите крышку заливного порта и вытащите содержимое стерильной серологической пипеткой объемом 10 мл, наклоняя сосуд по мере его опорожнения. Распределите содержимое всех контрольных и лечебных групп в конические пробирки объемом 15 мл с индивидуальной маркировкой. Закройте каждую трубку и аккуратно переверните их несколько раз, чтобы убедиться, что они правильно перемешаны.Используйте предпочтительный метод определения концентрации и жизнеспособности полученной клеточной культуры для подготовки к последующим экспериментальным анализам. Начальную жизнеспособность клеточной линии NK-92 и плотность посадки сравнивали с результирующей конечной жизнеспособностью и конечными концентрациями. После 72-часового лечения SMG сравнивали два случая отрицательных и положительных результатов.Для сравнения, оптимальный диапазон концентрации используемой клеточной линии NK-92 составлял от 0,3 до 1,2 миллиона клеток на миллилитр со временем удвоения около двух-трех дней. Пролиферация в группе лечения SMG была примерно одинаковой в контрольной и лечебной группах. Эти параметры были необходимы для успеха последующих экспериментов, и полученные клетки из двух контрольных групп показали аналогичные результаты в последующих экспериментальных анализах.Крайне важно контролировать и учитывать образование пузырьков на протяжении всего курса лечения, особенно в культуре клеток, подвергающейся имитации микрогравитации. Образование больших пузырьков может привести к нарушению динамики жидкости внутри сосуда, и это по существу сведет на нет моделируемое состояние микрогравитации.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Первичная система культуры нейронов по изучению простого герпеса латентности вирусов и реактивации

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

PiggyBac транспозонов модификации системы первичной Т-клетках человека

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Культивирование Микроглии от новорожденных и взрослых центральной нервной системы

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Выделение и Th17 дифференцировки наивных CD4 Т-лимфоцитов

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Оценка Врожденная зондирование инфицированных ВИЧ-1 CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток плазмоцитов дендритных клеток с помощью<em&gt; Экс естественных</em&gt; Совместное культивирование системы.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Визуализация IL-22-экспрессирующих Лимфоциты Использование Reporter Мыши

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Молекулярная диффузия в плазматических мембранах первичных лимфоцитах Измеренные с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Зика Вирус Система Инфекционный Культура клеток и<em&gt; In Vitro</em&gt; Профилактический эффект интерферонов

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Быстрое Количественное митоген-индуцированной бластогенеза в Т-лимфоцитах для идентификации иммуномодулирующих препаратов

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Изоляция лимфоциты от мыши небольшой кишечной иммунной системы

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...