Name: culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system
Uploaded: 2022-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

Este trabajo cuenta con el apoyo de la Agencia Espacial Canadiense (CSA), beca de investigación (17ILSRA3, Immuno Profile). Roxanne Fournier (Universidad de Toronto), el Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial University) y Preteesh Mylabathula (Universidad de Arizona) por su ayuda con la solución de problemas iniciales de este protocolo.

NOTA: Los siguientes pasos deben completarse dentro de un gabinete de seguridad biológica estéril.
1. Preparación de vasos para cultivo celular
<ol><li>Saque los recipientes de cultivo del embalaje de plástico. Etiquete cada recipiente en el borde de acuerdo con el tipo / línea de celda que se está utilizando, ya sea el control (1G) o el tratamiento (SMG), y cualquier otra información relevante.</li>
	<li>Estabilice el recipiente y abra el puerto de llenado con cuidad...

<ol>
	<li>ElGindi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+the+force+be+with+you+(or+not):+the+immune+system+under+microgravity.">May the force be with you (or not): the immune system under microgravity.</a> Cells. 10 (8), 1941 (2021).</li><li>Chouk&#232;r, A., Ullrich, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+system+dysregulation+during+spaceflight:+potential+countermeasures+for+deep+space+exploration+missions.">Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Countermeasures-based+improvements+in+stress,+immune+system+dysregulation+and+latent+herpesvirus+reactivation+onboard+the+International+Space+Station+-+relevance+for+deep+space+missions+and+terrestrial+medicine.">Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine.</a> Neuroscience &amp; Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).</li><li>Herranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground-based+facilities+for+simulation+of+microgravity:+organism-specific+recommendations+for+their+use,+and+recommended+terminology.">Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology.</a> Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).</li><li>Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+current+microgravity+platforms+for+space+biology+research.">Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research.</a> Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).</li><li>Murphy, K., Weaver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Janeway's Immunobiology 9th Edition. , (2016).</li><li>Dedolph, R. R., Dipert, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+gravity+stimulus+nullification+by+clinostat+rotation.">The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation.</a> Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).</li><li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+suspension+culture:+the+rotating-wall+vessel.">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).</li><li>Crabb&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+proteomic+responses+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+to+spaceflight+conditions+involve+Hfq+regulation+and+reveal+a+role+for+oxygen.">Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).</li><li>Ulbrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+simulated+and+real+microgravity+on+bone+cells+and+mesenchymal+stem+cells.">The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells.</a> BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).</li><li>Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+and+simulated+microgravity+cause+a+significant+reduction+of+key+gene+expression+in+early+T-cell+activation.">Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).</li><li>Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+cell+line+(NK-92)+with+phenotypical+and+functional+characteristics+of+activated+natural+killer+cells.">Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.</a> Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).</li><li>Williams, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+NK-92+cells+for+refractory+hematological+malignancies+relapsing+after+autologous+hematopoietic+cell.">A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell.</a> Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).</li><li>Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol">https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol</a> (2022)</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2022)</li><li>Mylabathula, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+disarms+human+NK-cells+and+inhibits+anti-tumor+cytotoxicity+in+vitro.">Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro.</a> Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+simulated+microgravity+on+primary+human+NK+cells.">Effects of simulated microgravity on primary human NK cells.</a> Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).</li><li>Shao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+effect+of+simulated+microgravity+on+the+cytotoxicity+of+NK+cells+following+the+DNA+methylation+of+NKG2D+and+the+expression+of+DAP10.">Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10.</a> Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).</li><li>Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+attachment-independent+biofilm+formation+and+repression+of+hfq+expression+by+low-fluid-shear+culture+of+Staphylococcus+aureus.">Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).</li><li>Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air+bubble-isolating+rotating+wall+vessel+bioreactor+for+improved+spheroid/organoid+formation.">An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).</li></ol>

A medida que la humanidad se prepara para misiones espaciales más largas a la Luna y Marte, se necesita realizar más investigación para mitigar los graves riesgos para la salud de los astronautas. Un aspecto importante del entorno espacial que afecta la fisiología humana es la microgravedad. Aquí, se ha descrito un método de cultivo celular para someter linfocitos a SMG utilizando un sistema de cultivo celular rotativo disponible comercialmente.
Este protocolo contiene algunos pasos crí...

Se ha demostrado que los vuelos espaciales afectan muchos aspectos de la fisiología humana, incluido el sistema inmunológico. Muchos estudios han demostrado evidencia de desregulación inmune como resultado de vuelos espaciales in vivo y exposición a microgravedad simulada (SMG) in vitro1,2,3,4. Un aspecto importante del entorno espacial que afecta la fisiología humana es la microgravedad. La microgravedad se refiere a la "ingravidez" experimentada debido a las bajas fuerzas gravitacionales en el entorno espacial5. A medida que la humanidad se prepara para misiones espaciales más largas a la Luna y Marte, se necesita realizar más investigación para mitigar los graves riesgos para la salud de los astronautas.
Se pueden lograr condiciones reales de microgravedad para la investigación científica en el espacio a bordo de la Estación Espacial Internacional (ISS) o en nanosatélites lanzados en órbita; Sin embargo, estas opciones pueden ser increíblemente costosas y complejas de orquestar. Dadas las limitaciones actuales de la realización de investigaciones biológicas en el espacio, existen varias opciones para inducir microgravedad real y SMG en la Tierra. Existen operaciones a gran escala que pueden producir períodos cortos de microgravedad real en la Tierra, incluidas torres de caída, vuelo parabólico y cohetes de sondeo. Sin embargo, estos métodos no son demasiado adecuados para estudiar los efectos de la microgravedad en los sistemas biológicos, en gran parte debido a sus cortos períodos de tratamiento en microgravedad (es decir, segundos a 20 minutos). Estos métodos se discuten con mayor detalle en otra parte 5,6. Las opciones que son adecuadas para el cultivo celular biológico incluyen dispositivos a pequeña escala como clinostatos 2D o dispositivos de recipiente de pared giratoria (RWV) y clinostatos 3D o máquinas de posicionamiento aleatorio (RPM). Estos dispositivos pueden instalarse dentro de incubadoras de cultivo celular mantenidas a 37 °C y 5% deCO2, y giran el cultivo celular sobre un eje horizontal (2D) o sobre dos ejes perpendiculares (3D)5. Sin embargo, es importante enfatizar que estos métodos de cultivo producen SMG en oposición a la microgravedad real, que se logra de manera más factible en el espacio para contextos de investigación biológica.
El objetivo del presente documento es describir los pasos para someter los linfocitos a SMG utilizando un dispositivo RWV (Tabla de materiales) disponible comercialmente, que cae bajo la clasificación de clinostatos 2D. Si bien existe un protocolo general disponible del fabricante para operar este dispositivo, el artículo actual tiene como objetivo cubrir los pasos de solución de problemas y optimización con más detalle. Este artículo también cubre la teoría detrás de cómo funciona este dispositivo para producir SMG en cultivo celular en suspensión, específicamente con linfocitos. En este contexto, el cultivo celular en suspensión se refiere a las células que crecen libremente en medios de cultivo suplementados, sin adherirse a ningún andamiaje adicional. Muchos tipos de células se cultivan en cultivo celular en suspensión, incluidos los linfocitos. Los linfocitos son células del sistema inmunitario, incluidas las células T, B y asesinas naturales (NK), que residen en los órganos linfoides y en el torrente sanguíneo7.
El clinostato RWV 2D descrito aquí opera según el principio de anulación del vector de gravedad promediado en el tiempo 5,6,8,9, por el cual el vector de gravedad se aleatoriza mediante la rotación del cultivo celular en un eje horizontal. Esto se logra haciendo coincidir la velocidad de rotación del recipiente de cultivo con la velocidad de sedimentación de las células. Mientras la velocidad de rotación del recipiente de cultivo se adapte bien a la velocidad de sedimentación de las células, las células se mantienen en caída libre y no pueden sedimentar, como se experimenta en el entorno espacial. Después de una fase inicial de aceleración, el medio en el recipiente de cultivo finalmente alcanza la "rotación del cuerpo sólido" con el tiempo. Esta rotación horizontal también induce el flujo laminar en el vaso de cultivo celular. Esto crea un ambiente de "bajo cizallamiento", dado que el esfuerzo cortante inducido en las células por el flujo laminar es mucho menor que el del flujo turbulento. Sin embargo, dado que el clinostato no es un sistema perfecto, se introducen algunos pequeños movimientos de fluido laminar, que infligen un esfuerzo cortante mínimo en las células. Como tal, las células suspendidas en el medio son arrastradas por este flujo durante la rotación. Durante la rotación horizontal, el vector de gravedad actúa sobre las células y las lleva a una trayectoria oscilante, como se visualiza en la Figura 1. Otra pequeña fuente de esfuerzo cortante es causada por las células que "caen" a través de los medios, causando un flujo laminar alrededor de las células. A medida que el vaso de cultivo gira sobre un eje horizontal, el vector de gravedad experimentado por las células también gira. Con el tiempo, este vector de gravedad giratorio promedia acercarse a cero; este fenómeno se denomina anulación del vector de gravedad promediada en el tiempo e induce un estado de SMG 5,6,8,9. Este dispositivo se ha utilizado para estudiar los efectos de SMG en muchos tipos de células, algunas de las cuales están cubiertas en las referencias10,11,12. Se pueden encontrar más ejemplos en el sitio web del fabricante del dispositivo.
Este dispositivo RWV utiliza "recipientes de alta relación de aspecto" (HARV) especializados disponibles a través del fabricante del dispositivo. Estos HARV contienen 10 ml de cultivo celular cada uno; sin embargo, también hay disponibles 50 ml de HARV. Se pueden usar HARV de 10 ml o 50 ml dependiendo de cuántas células se necesiten para completar cualquier ensayo experimental posterior, que se describe más adelante en la sección de discusión. Los HARV están hechos de policarbonato e incluyen una membrana de oxigenación de silicona para permitir el intercambio de gases durante el cultivo celular. Esto mantiene el pH de los medios celulares y permite una respiración celular eficiente. Hay un puerto de llenado principal y dos puertos de jeringa tapados en la cara del recipiente (Figura 2A). Después de cargar el cultivo celular a través del puerto de llenado principal, se cargan dos jeringas en el recipiente para ayudar con la eliminación de burbujas. Cuando se usan los vasos de 10 ml, dos jeringas de 3 ml funcionan bien. Una jeringa se conecta al dispositivo vacía, con la jeringa completamente presionada, y la otra se conecta llena con 3 ml de cultivo celular (Figura 2E). Estos se utilizan en combinación para eliminar las burbujas del vaso, lo cual es importante para mantener el tratamiento SMG. En general, se recomienda configurar dos controles negativos, que pueden denominarse control "Flask" y control "1G". El control "Flask" corresponde a las células que se cultivan en un matraz de cultivo celular en suspensión T25 estándar. El control 1G corresponde a células que se cultivan en el recipiente de cultivo especializado de 10 ml, que simplemente se coloca en la incubadora (es decir, sin ser sometido al tratamiento SMG). Consulte la sección Discusión para obtener más detalles sobre los controles.
El método descrito aquí es apropiado para cualquier investigador que busque estudiar los efectos de SMG en los linfocitos, con un enfoque específico en las células NK mediante el uso de la línea celular NK9213. Los resultados de estos estudios pueden ayudarnos a comprender mejor y mitigar los efectos adversos de los vuelos espaciales en el sistema inmunológico humano.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>D-410</td>
			<td>Gamma sterilized culture vessels (4/box)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok tip syringes (3 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>For attaching to the 10 mL HARVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92 Cell-line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4D</td>
			<td>Rotating wall vessel device; 2D clinostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 suspension culture flasks</td>
			<td>Sarsedt</td>
			<td>83.3910.502</td>
			<td>For flask control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system

Dadas las limitaciones actuales de la realización de investigaciones biológicas en el espacio, existen algunas opciones para someter el cultivo celular a microgravedad simulada (SMG) en la Tierra. Estas opciones varían en sus métodos, principios e idoneidad para su uso con cultivo celular en suspensión. Aquí, se describe un método de cultivo celular para someter linfocitos a microgravedad simulada utilizando un sistema de cultivo celular rotativo disponible comercialmente, también conocido como clinostato 2D o dispositivo de vaso de pared giratoria (RWV). Este método de cultivo celular utiliza el principio de anulación del vector de gravedad promediado en el tiempo para simular la microgravedad girando las células sobre un eje horizontal. Las células cultivadas en este sistema se pueden cosechar y utilizar en muchos ensayos experimentales diferentes para evaluar los efectos de la microgravedad simulada en la función celular y la fisiología. La técnica de cultivo puede variar ligeramente dependiendo del tipo de célula o línea que se utilice, pero el método descrito aquí se puede aplicar a cualquier cultivo celular de tipo suspensión.

Este método de cultivo se considera exitoso si 1) la proliferación de las células es aproximadamente consistente en todos los grupos de control (e idealmente en todos los grupos experimentales), 2) la proliferación es apropiada dada la densidad de siembra, la duración del tratamiento y el tiempo de duplicación del tipo / línea celular, y 3) la viabilidad de las células cosechadas es del 85% o más (Tabla 1 ). Idealmente, las células resultantes deberían estar tan sanas como lo serían en el cul...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System

Esta es una guía paso a paso para usar un sistema de cultivo celular rotativo disponible comercialmente para cultivar linfocitos en microgravedad simulada utilizando recipientes de cultivo desechables especializados. Este método de cultivo se puede aplicar a cualquier cultivo celular de tipo suspensión.

Cultivo de linfocitos en microgravedad simulada utilizando un sistema de cultivo celular rotativo

Given the current limitations of conducting biological research in space, a few options exist for subjecting cell culture to simulated microgravity (SMG) ...

Esta técnica nos permite estudiar los efectos de la microgravedad simulada en las células inmunes para ayudarnos a comprender mejor cómo los aspectos del entorno espacial afectan la fisiología humana a nivel molecular. Esta técnica es económicamente factible y es relativamente fácil de configurar y mantener en comparación con el envío de cultivos celulares al espacio u otros métodos de someter el cultivo celular a microgravedad simulada en la tierra. Se recomienda ir lentamente mientras se llenan los recipientes para evitar desbordamientos y derrames.Después de la eliminación inicial de la burbuja, asegúrese de que los recipientes estén completamente llenos usando las jeringas. Esto minimizará las posibilidades de formación de burbujas grandes durante todo el tratamiento. Comience sacando los recipientes de cultivo del embalaje de plástico.Etiquete cada vaso en el borde de acuerdo con el tipo de celda o línea que se utiliza, ya sea en el control o tratamiento y cualquier otra información relevante. Estabilice el recipiente y abra el puerto de llenado con cuidado sin tocar la clavija de la tapa del puerto de llenado o la junta tórica. Coloque la tapa en una almohadilla de etanol con la clavija o junta tórica hacia arriba mientras se llena el recipiente.No retire las tapas de los puertos de la jeringa. Cargue el recipiente con 10 ml del medio completo apropiado para el cultivo celular utilizando una pipeta serológica estéril y coloque cuidadosamente la tapa en el puerto de llenado. Asegúrese de que las tapas del puerto de la jeringa y el puerto de llenado estén bien cerrados.Luego, coloque los recipientes llenos en una incubadora mientras realiza los pasos posteriores para preparar los recipientes para el cultivo celular. Recupere los recipientes cebados con medios de la incubadora. Para el control del matraz, cargar un matraz de cultivo en suspensión T25 con 10 ml de cultivo celular del material preparado anteriormente.Agregue 10 ml de cultivo de células madre a un tubo cónico separado de 15 ml, que se utilizará para cargar las jeringas. Desenrosque las tapas de los puertos de la jeringa para retirarlas del recipiente y asegúrese de que las llaves de paso de la culata estén en posición abierta. Estabilice el recipiente y abra el puerto de llenado con cuidado sin tocar la clavija de la tapa del puerto de llenado o la junta tórica.Coloque la tapa en una almohadilla de etanol con la clavija o junta tórica hacia arriba mientras se llena el recipiente. Asegúrese de que las llaves de paso estén en la posición abierta. El recipiente se puede vaciar vertiendo los medios del recipiente en un contenedor de residuos utilizando una pipeta serológica.Alternativamente, aspire el medio con un vidrio estéril más allá de su pipeta conectada a un sistema de vacío. Mientras usa una pipeta o el sistema de vacío, asegúrese de no tocar la membrana de oxigenación, ya que esto podría dañarla y dejar el recipiente inutilizable. Cierre herméticamente el tubo cónico de 50 ml que contiene el cultivo de células madre preparado e invierta suavemente varias veces para mezclar bien el contenido.Extraiga 10 ml de material de cultivo celular del tubo de 50 ml con una pipeta serológica estéril fresca. Levante el recipiente e inclínelo, de modo que el puerto de llenado esté hacia la parte superior. Luego dispense cuidadosamente el stock de cultivo celular en el recipiente a través del puerto de llenado.Llene el recipiente hasta la punta del puerto de llenado, mientras inclina el recipiente hacia abajo para evitar derrames. Tenga cuidado de no tocar la membrana de oxigenación con la pipeta, ya que es muy frágil. Una vez que el recipiente esté cargado, vuelva a colocar con cuidado la tapa del puerto de llenado sin tocar la junta tórica.Retire la primera jeringa de 3 ml de su paquete y bombéela varias veces para aflojarla. Luego conecte la jeringa a uno de los puertos de la jeringa, asegurándose de que la jeringa esté completamente presionada. Cierre herméticamente el tubo cónico de 15 ml que contiene 10 ml de cultivo celular alícuota e invierta suavemente varias veces para mezclar bien el contenido.Del mismo modo, retire la segunda jeringa de 3 ml de su paquete y bombéela varias veces. Luego, sumergió cuidadosamente esta jeringa en el cultivo celular del tubo cónico de 15 ml y elaboró un poco de cultivo. Minimice las burbujas de aire dispensando completamente la jeringa de nuevo en el tubo y extrayendo 3 ml de cultivo.Conecte la jeringa llena al puerto de la jeringa restante y desinfecte cuidadosamente las jeringas y alrededor del puerto de llenado con una almohadilla de etanol. No obtenga etanol en la membrana de oxigenación. Repita el proceso para los recipientes restantes.Si queda un cultivo celular ligeramente insuficiente en el tubo cónico de 50 ml para el último vaso, recupere la cantidad restante del tubo cónico de 15 ml utilizado para cargar las jeringas. Asegúrese de que las llaves de paso del puerto de la jeringa estén cerradas para limitar la migración de células y burbujas de las jeringas a los vasos. Voltee el recipiente boca abajo y golpee hacia un lado varias veces para recoger las burbujas iniciales.Voltee rápidamente el recipiente hacia atrás para mirar hacia arriba, y luego en un ligero ángulo hacia afuera, de modo que todas las burbujas floten hacia el lado hacia arriba del recipiente. Maniobra las burbujas debajo del puerto con la jeringa vacía y observa cómo comienzan a entrar en el puerto. Abra ambas llaves de paso del puerto de la jeringa.Golpee suavemente el recipiente para alentar a las burbujas a flotar en la jeringa vacía. Aspire lentamente las burbujas más grandes con la jeringa vacía mientras presiona cuidadosamente la jeringa llena para mantener la presión en el recipiente, de modo que la membrana de oxigenación no reviente. Repita este proceso varias veces para asegurarse de que se eliminen todas las burbujas.Cuando las burbujas se hayan eliminado eficazmente, cierre las llaves de paso del puerto de la jeringa. Mantenga las jeringas puestas durante el tratamiento para permitir la posterior eliminación de burbujas, asegurando que el volumen en ambas jeringas sea aproximadamente igual. Limpie cuidadosamente la superficie de la base giratoria y el cable de cinta con 70% de etanol.Asegúrese de que el cable de cinta esté conectado a la fuente de alimentación. Coloque la base giratoria en la incubadora y fije el cable de cinta a la base. Coloque la fuente de alimentación cerca, pero fuera de la incubadora.Fije el recipiente de tratamiento SMG alineando las roscas del recipiente a la clavija giratoria y girando suavemente la clavija giratoria en la base en sentido contrario a las agujas del reloj. Asegúrese de que el recipiente esté bien sujeto. Mantenga la incubadora a aproximadamente 100% de humedad llenando la bandeja de agua con agua RO en autoclave.Ajuste la velocidad de rotación de la incubadora para que coincida con la velocidad de sedimentación de las células, de modo que las células no caigan a través del medio. El primer día de configuración del tratamiento, verifique la formación de burbujas cada pocas horas como se describe en el manuscrito de texto. Retire las burbujas al menos una vez al día hasta el final de la duración deseada del tratamiento.Una vez transcurrida la duración prevista del tratamiento, detener la rotación y desmontar el aparato. Retire el recipiente de tratamiento sosteniendo suavemente el recipiente estacionario mientras gira la clavija giratoria del dispositivo en el sentido de las agujas del reloj. Llevar el matraz de control, el control y el recipiente tratado a un armario de seguridad biológica estéril.Tome cada recipiente excluyendo el matraz de control y voltéelo, de modo que mire hacia abajo. Luego golpee suavemente para poner todas las células en suspensión. Luego gire el recipiente de lado con el puerto de llenado hacia la parte inferior y vuelva a golpearlo para guiar las celdas hacia el puerto de llenado para una aspiración eficiente.Maneje cada embarcación individualmente. Desenrosque las jeringas de los dos puertos y dispense en los residuos de riesgo biológico. Abra las llaves de paso en los puertos de la jeringa.Retire con cuidado la tapa del puerto de llenado y extraiga el contenido con una pipeta serológica estéril de 10 ml, inclinando el recipiente a medida que se vacía. Dispensar el contenido de todos los grupos de control y tratamiento en tubos cónicos de 15 ml etiquetados individualmente. Cierre cada tubo e invierta suavemente varias veces para asegurarse de que estén bien mezclados.Utilice el método preferido para determinar la concentración y viabilidad del cultivo celular resultante para prepararse para ensayos experimentales posteriores. La viabilidad inicial de la línea celular NK-92 y las densidades de asiento se compararon con la viabilidad final resultante y las concentraciones finales. Después de un tratamiento con SMG de 72 horas, se compararon dos casos de resultados negativos y positivos.A modo de comparación, el rango de concentración óptimo de la línea celular NK-92 utilizada fue de entre 0,3 y 1,2 millones de células por mililitro, con un tiempo de duplicación de alrededor de dos a tres días. La proliferación en el grupo de tratamiento con SMG fue aproximadamente igual en los grupos de control y tratamiento. Estos parámetros fueron esenciales para el éxito experimental aguas abajo y las células resultantes de los dos grupos de control se desempeñaron de manera similar en los ensayos experimentales aguas abajo.Es crucial monitorear y tener en cuenta la formación de burbujas durante todo el curso del tratamiento, especialmente en el cultivo celular sometido a microgravedad simulada. La formación de burbujas grandes puede causar la interrupción de la dinámica de fluidos dentro del recipiente, y esto esencialmente negará la condición de microgravedad simulada.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Un sistema de neuronas cultivo primario para el estudio de la latencia del virus del herpes simple y Reactivación

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Investigación

Inmunología e Infección

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados<sup&gt; +</sup&gt; Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura del sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

La visualización de IL-22 que expresan linfocitos utilizando ratones Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Difusión molecular en el plasma membranas de linfocitos primarios medidos por espectroscopia de correlación de fluorescencia

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Virus Zika Sistema infecciosa cultivo celular y la<em&gt; In Vitro</em&gt; Profiláctica Efecto de los interferones

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

La cuantificación rápida de Blastogénesis inducida por mitógeno de linfocitos T para identificar fármacos inmunomoduladores

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...