Name: culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system
Uploaded: 2022-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

Detta arbete stöds av Canadian Space Agency (CSA), forskningsbidrag (17ILSRA3, Immuno Profile). Författare vill erkänna och tacka Dr. Roxanne Fournier (University of Toronto), Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial University) och Preteesh Mylabathula (University of Arizona) för deras hjälp med den första felsökningen av detta protokoll.

OBS: Följande steg ska utföras inuti ett sterilt biologiskt säkerhetsskåp.
1. Beredning av kärl för cellodling
<ol><li>Ta ut kulturkärlen ur plastförpackningen. Märk varje kärl på kanten beroende på vilken celltyp/linje som används, om det är kontroll (1G) eller behandling (SMG) och annan relevant information.</li>
	<li>Stabilisera kärlet och öppna påfyllningsporten försiktigt, utan att vidröra påfyllningsportens lockpinne/O-ring. Placera locket på en et...

<ol>
	<li>ElGindi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+the+force+be+with+you+(or+not):+the+immune+system+under+microgravity.">May the force be with you (or not): the immune system under microgravity.</a> Cells. 10 (8), 1941 (2021).</li><li>Chouk&#232;r, A., Ullrich, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+system+dysregulation+during+spaceflight:+potential+countermeasures+for+deep+space+exploration+missions.">Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Countermeasures-based+improvements+in+stress,+immune+system+dysregulation+and+latent+herpesvirus+reactivation+onboard+the+International+Space+Station+-+relevance+for+deep+space+missions+and+terrestrial+medicine.">Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine.</a> Neuroscience &amp; Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).</li><li>Herranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground-based+facilities+for+simulation+of+microgravity:+organism-specific+recommendations+for+their+use,+and+recommended+terminology.">Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology.</a> Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).</li><li>Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+current+microgravity+platforms+for+space+biology+research.">Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research.</a> Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).</li><li>Murphy, K., Weaver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Janeway's Immunobiology 9th Edition. , (2016).</li><li>Dedolph, R. R., Dipert, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+gravity+stimulus+nullification+by+clinostat+rotation.">The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation.</a> Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).</li><li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+suspension+culture:+the+rotating-wall+vessel.">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).</li><li>Crabb&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+proteomic+responses+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+to+spaceflight+conditions+involve+Hfq+regulation+and+reveal+a+role+for+oxygen.">Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).</li><li>Ulbrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+simulated+and+real+microgravity+on+bone+cells+and+mesenchymal+stem+cells.">The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells.</a> BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).</li><li>Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+and+simulated+microgravity+cause+a+significant+reduction+of+key+gene+expression+in+early+T-cell+activation.">Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).</li><li>Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+cell+line+(NK-92)+with+phenotypical+and+functional+characteristics+of+activated+natural+killer+cells.">Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.</a> Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).</li><li>Williams, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+NK-92+cells+for+refractory+hematological+malignancies+relapsing+after+autologous+hematopoietic+cell.">A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell.</a> Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).</li><li>Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol">https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol</a> (2022)</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2022)</li><li>Mylabathula, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+disarms+human+NK-cells+and+inhibits+anti-tumor+cytotoxicity+in+vitro.">Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro.</a> Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+simulated+microgravity+on+primary+human+NK+cells.">Effects of simulated microgravity on primary human NK cells.</a> Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).</li><li>Shao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+effect+of+simulated+microgravity+on+the+cytotoxicity+of+NK+cells+following+the+DNA+methylation+of+NKG2D+and+the+expression+of+DAP10.">Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10.</a> Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).</li><li>Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+attachment-independent+biofilm+formation+and+repression+of+hfq+expression+by+low-fluid-shear+culture+of+Staphylococcus+aureus.">Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).</li><li>Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air+bubble-isolating+rotating+wall+vessel+bioreactor+for+improved+spheroid/organoid+formation.">An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).</li></ol>

När mänskligheten förbereder sig för längre rymduppdrag till månen och Mars måste mer forskning genomföras för att mildra allvarliga hälsorisker hos astronauter. En viktig aspekt av rymdmiljön som påverkar människans fysiologi är mikrogravitation. Här har en cellodlingsmetod beskrivits för att utsätta lymfocyter för SMG med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt roterande cellodlingssystem.
Detta protokoll innehåller några kritiska steg som kan behöva optimeras beroende ...

Rymdfärder har visat sig påverka många aspekter av mänsklig fysiologi, inklusive immunsystemet. Många studier har visat bevis på immundysregulering som ett resultat av rymdfärder in vivo och exponering för simulerad mikrogravitation (SMG) in vitro 1,2,3,4. En viktig aspekt av rymdmiljön som påverkar människans fysiologi är mikrogravitation. Mikrogravitation avser den "viktlöshet" som upplevs på grund av låga gravitationskrafter i rymdmiljön5. När mänskligheten förbereder sig för längre rymduppdrag till månen och Mars måste mer forskning genomföras för att mildra allvarliga hälsorisker hos astronauter.
Verkliga mikrogravitationsförhållanden för vetenskaplig forskning kan uppnås i rymden ombord på den internationella rymdstationen (ISS) eller i nanosatelliter som skjuts upp i omloppsbana. Dessa alternativ kan dock vara otroligt kostsamma och komplexa att orkestrera. Med tanke på de nuvarande begränsningarna för att bedriva biologisk forskning i rymden finns det flera alternativ för att inducera verklig mikrogravitation och SMG på jorden. Storskaliga operationer finns som kan producera korta perioder av verklig mikrogravitation på jorden, inklusive dropptorn, parabolisk flygning och sondraketer. Dessa metoder är dock inte alltför lämpliga för att studera effekterna av mikrogravitation på biologiska system, till stor del på grund av deras korta perioder av mikrogravitationsbehandling (dvs. sekunder till 20 minuter). Dessa metoder diskuteras närmare på annan plats 5,6. Alternativ som är lämpliga för biologisk cellodling inkluderar småskaliga enheter såsom 2D-klinostater eller roterande väggkärl (RWV) enheter och 3D-klinostater eller slumpmässiga positioneringsmaskiner (RPM). Dessa enheter kan placeras inuti cellodlingsinkubatorer som hålls vid 37 °C och 5%CO2, och de roterar cellkulturen antingen på en horisontell axel (2D) eller på två vinkelräta axlar (3D)5. Det är dock viktigt att betona att dessa odlingsmetoder producerar SMG i motsats till verklig mikrogravitation, som mest genomförbart uppnås i rymden för biologiska forskningssammanhang.
Målet med det aktuella papperet är att beskriva stegen för att utsätta lymfocyter för SMG med hjälp av en kommersiellt tillgänglig RWV-enhet (Table of Materials), som faller under 2D-klinostatklassificeringen. Även om det finns ett allmänt protokoll tillgängligt från tillverkaren för att använda den här enheten, syftar den aktuella artikeln till att täcka felsöknings- och optimeringsstegen mer detaljerat. Denna artikel täcker också teorin bakom hur denna enhet fungerar för att producera SMG i suspensionscellodling, speciellt med lymfocyter. Med suspensionscellodling avses i detta sammanhang celler som växer fritt i kompletterade odlingssubstrat, utan att vidhäfta vid någon ytterligare byggnadsställning. Många celltyper odlas i suspensionscellodling, inklusive lymfocyter. Lymfocyter är celler i immunsystemet, inklusive T, B och Natural Killer (NK) celler, som finns i lymfoida organ och blodomloppet7.
RWV 2D-klinostaten som beskrivs här fungerar enligt principen om tidsmedelvärde av gravitationsvektorns nollifiering 5,6,8,9, varigenom gravitationsvektorn randomiseras genom rotation av cellkulturen på en horisontell axel. Detta uppnås genom att matcha odlingskärlets rotationshastighet med cellernas sedimenteringshastighet. Så länge odlingskärlets rotationshastighet matchas väl med cellernas sedimenteringshastighet, hålls cellerna i fritt fall och kan inte sedimentera, vilket upplevs i rymdmiljön. Efter en inledande påskyndningsfas når mediet i odlingskärlet så småningom "fast kroppsrotation" över tiden. Denna horisontella rotation inducerar också laminärt flöde i cellodlingskärlet. Detta skapar en "låg skjuvning" -miljö, med tanke på att skjuvspänningen som induceras på cellerna av laminärt flöde är mycket mindre än för turbulent flöde. Men med tanke på att klinostaten inte är ett perfekt system, finns det några små, laminära vätskerörelser införda, vilket medför minimal skjuvspänning på cellerna. Som sådan dras cellerna suspenderade i media med av detta flöde under rotation. Under horisontell rotation verkar tyngdkraftsvektorn på cellerna och för dem in i en oscillerande bana, som visualiseras i figur 1. En annan liten källa till skjuvspänning orsakas av att cellerna "faller" genom mediet, vilket orsakar laminärt flöde runt cellerna. När odlingskärlet roterar på en horisontell axel roterar också gravitationsvektorn som cellerna upplever. Med tiden närmar sig denna roterande gravitationsvektor i genomsnitt noll; detta fenomen kallas tidsmedelvärde gravitationsvektor nullifiering och inducerar ett tillstånd av SMG 5,6,8,9. Denna enhet har använts för att studera effekterna av SMG på många typer av celler, av vilka några omfattas av referenserna10,11,12. Fler exempel finns på enhetstillverkarens webbplats.
Denna RWV-enhet använder specialiserade "högbildskärl" (HARV) som är tillgängliga via enhetstillverkaren. Dessa HARVs innehåller 10 ml cellkultur vardera; dock finns 50 ml HARVs också tillgängliga. Antingen 10 ml eller 50 ml HARV kan användas beroende på hur många celler som behövs för att slutföra eventuella nedströms experimentella analyser, vilket beskrivs vidare i diskussionsavsnittet. HARVs är gjorda av polykarbonat och inkluderar ett silikonsyresättningsmembran för att möjliggöra gasutbyte under cellodling. Detta upprätthåller pH i cellmediet och möjliggör effektiv cellulär andning. Det finns en huvudöppning och två täckta sprutportar på fartygets yta (figur 2A). Efter att cellkulturen har laddats genom huvudpåfyllningsporten laddas två sprutor på kärlet för att hjälpa till med bubbelavlägsnande. Vid användning av 10 ml kärl fungerar två 3 ml sprutor bra. En spruta är ansluten till enheten tom, med sprutan helt nedtryckt och den andra är fäst fylld med 3 ml cellkultur (figur 2E). Dessa används i kombination för att avlägsna bubblor från kärlet, vilket är viktigt för att upprätthålla SMG-behandlingen. I allmänhet rekommenderas det att ställa in två negativa kontroller, som kan kallas "Flask" -kontrollen och "1G" -kontrollen. Kolvkontrollen motsvarar celler som odlas i en standardcellodlingskolv med T25-suspension. 1G-kontrollen motsvarar celler som odlas i det specialiserade 10 ml odlingskärlet, som helt enkelt placeras i inkubatorn (dvs utan att utsättas för SMG-behandlingen). Se avsnittet Diskussion för mer information om kontroller.
Metoden som beskrivs här är lämplig för alla forskare som vill studera effekterna av SMG på lymfocyter, med ett specifikt fokus på NK-celler med hjälp av NK92-cellinjen13. Resultaten från dessa studier kan hjälpa oss att bättre förstå och mildra de negativa effekterna av rymdfärder på det mänskliga immunsystemet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>D-410</td>
			<td>Gamma sterilized culture vessels (4/box)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok tip syringes (3 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>For attaching to the 10 mL HARVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92 Cell-line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4D</td>
			<td>Rotating wall vessel device; 2D clinostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 suspension culture flasks</td>
			<td>Sarsedt</td>
			<td>83.3910.502</td>
			<td>For flask control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system

Med tanke på de nuvarande begränsningarna för att bedriva biologisk forskning i rymden finns det några alternativ för att utsätta cellodling för simulerad mikrogravitation (SMG) på jorden. Dessa alternativ varierar i sina metoder, principer och lämplighet för användning med suspensionscellodling. Här beskrivs en cellodlingsmetod för att utsätta lymfocyter för simulerad mikrogravitation med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt roterande cellodlingssystem, även känt som en 2D-klinostat eller en roterande väggkärl (RWV) -anordning. Denna cellodlingsmetod använder principen om tidsmedelvärde gravitationsvektor nullifiering för att simulera mikrogravity genom att rotera cellerna på en horisontell axel. Cellerna odlade i detta system kan skördas och användas i många olika experimentella analyser för att bedöma effekterna av simulerad mikrogravitation på cellulär funktion och fysiologi. Odlingstekniken kan variera något beroende på vilken celltyp eller linje som används, men den metod som beskrivs här kan tillämpas på vilken cellodling som helst av suspensionstyp.

Denna odlingsmetod anses framgångsrik om 1) cellernas proliferation är ungefär konsekvent över kontrollgrupperna (och helst alla experimentgrupper), 2) proliferationen är lämplig med tanke på sådddensiteten, behandlingens längd och fördubblingstiden för celltypen / linjen och 3) livskraften hos de skördade cellerna är 85% eller högre (tabell 1 ). Helst bör de resulterande cellerna vara lika friska som de skulle vara i standardcellodling, speciellt för användning i efterföljande experime...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System

Detta är en steg-för-steg-guide för att använda ett kommersiellt tillgängligt roterande cellodlingssystem för att odla lymfocyter i simulerad mikrogravitation med hjälp av specialiserade engångsodlingskärl. Denna odlingsmetod kan tillämpas på vilken cellodling som helst av suspensionstyp.

Odling av lymfocyter i simulerad mikrogravitation med hjälp av ett roterande cellodlingssystem

Given the current limitations of conducting biological research in space, a few options exist for subjecting cell culture to simulated microgravity (SMG) ...

Denna teknik gör det möjligt för oss att studera effekterna av simulerad mikrogravitation på immunceller för att hjälpa oss att bättre förstå hur aspekter av rymdmiljön påverkar mänsklig fysiologi på molekylär nivå. Denna teknik är ekonomiskt genomförbar och är relativt lätt att installera och underhålla jämfört med att skicka cellodling till rymden eller andra metoder för att utsätta cellodling för simulerad mikrogravitation på jorden. Det rekommenderas att gå långsamt medan du fyller kärlen för att undvika överflöde och spill.Efter första bubbelavlägsnandet, se till att kärlen är helt fulla med hjälp av sprutorna. Detta minimerar risken för stor bubbelbildning under hela behandlingen. Börja med att ta ut kulturkärlen ur plastförpackningen.Märk varje kärl på kanten enligt celltypen eller linjen som används, oavsett om det är i kontrollen eller behandlingen och annan relevant information. Stabilisera kärlet och öppna påfyllningsporten försiktigt utan att vidröra påfyllningsportens lockpinne eller O-ringen. Placera locket på en etanoldyna med pinnen eller O-ringen uppåt medan kärlet är fyllt.Ta inte bort locken från sprutportarna. Fyll kärlet med 10 ml lämpligt komplett medium för cellkulturen med en steril serologisk pipett och placera försiktigt locket på påfyllningsporten. Se till att sprutportens lock och påfyllningsport är ordentligt stängda.Placera sedan de fyllda kärlen i en inkubator medan du utför de efterföljande stegen för att primera kärlen för cellodling. Hämta media primerade kärl från inkubatorn. För kontroll av kolven, fyll på en T25-suspensionskolv med 10 ml cellkultur från det ovan beredda beståndet.Tillsätt 10 ml stamcellsodling till ett separat 15 ml koniskt rör, som kommer att användas för att ladda sprutorna. Skruva loss sprutportens lock för att ta bort dem från kärlet och se till att stoppkranarna är i öppet läge. Stabilisera kärlet och öppna påfyllningsporten försiktigt utan att vidröra påfyllningsportens lockpinne eller O-ringen.Placera locket på en etanoldyna med pinnen eller O-ringen uppåt medan kärlet fylls. Se till att kranarna är i öppet läge. Kärlet kan tömmas genom att hälla materialet från kärlet i en avfallsbehållare med hjälp av en serologisk pipett.Alternativt kan du aspirera mediet med ett sterilt glas förbi din pipett ansluten till ett vakuumsystem. När du använder en pipett eller vakuumsystemet, var noga med att inte vidröra syresättningsmembranet eftersom det kan skada det och göra kärlet oanvändbart. Stäng det 50 ml koniska röret som innehåller den beredda stamcellskulturen ordentligt och vänd det försiktigt några gånger för att blanda innehållet noggrant.Rita upp 10 ml cellodlingsmaterial från 50 ml röret med en färsk steril serologisk pipet. Ta upp kärlet och luta det så att påfyllningsporten är mot toppen. Fördela sedan försiktigt cellodlingsmaterialet i kärlet genom påfyllningsporten.Fyll kärlet direkt till spetsen av påfyllningsporten, medan du lutar fartyget tillbaka ner för att undvika spill. Var försiktig så att du inte vidrör syresättningsmembranet med pipetten eftersom det är mycket ömtåligt. När kärlet är lastat, sätt försiktigt tillbaka påfyllningsportens lock utan att vidröra O-ringen.Ta ut den första 3 ml sprutan ur förpackningen och pumpa den några gånger för att lossa den. Fäst sedan sprutan på en av sprutportarna och se till att sprutan är helt nedtryckt. Stäng det 15 ml koniska röret som innehåller 10 ml alikvotcellodling ordentligt och vänd det försiktigt några gånger för att blanda innehållet ordentligt.På samma sätt, ta bort den andra 3 ml sprutan från förpackningen och pumpa den några gånger. Sänk sedan försiktigt ner denna spruta i cellkulturen från det 15 ml koniska röret och dra upp lite kultur. Minimera luftbubblor genom att helt fördela sprutan tillbaka i röret och dra upp 3 ml kultur.Fäst den fyllda sprutan på den återstående sprutporten och desinficera försiktigt sprutorna och runt påfyllningsporten med en etanoldyna. Få inte etanol på syresättningsmembranet. Upprepa processen för de återstående kärlen.Om det finns en något otillräcklig cellkultur kvar i 50 ml koniska röret för det sista kärlet, återvinn den återstående mängden från det 15 ml koniska röret som används för att ladda sprutorna. Se till att sprutportens stoppkranar är stängda för att begränsa migrationen av celler och bubblor från sprutorna in i kärlen. Vänd kärlet upp och ner och slå det några gånger för att samla de första bubblorna.Vänd snabbt fartyget tillbaka för att vända uppåt och sedan i en liten vinkel uppåt, så att bubblorna alla flyter uppåt på fartyget. Manövrera bubblorna under porten med den tomma sprutan och se dem börja komma in i hamnen. Öppna båda stoppkranarna i sprutporten.Slå försiktigt på kärlet för att uppmuntra bubblorna att flyta upp i den tomma sprutan. Sug långsamt upp de större bubblorna med den tomma sprutan medan du försiktigt trycker in hela sprutan för att bibehålla trycket i kärlet, så att syresättningsmembranet inte spricker. Upprepa denna process några gånger för att säkerställa att alla bubblor tas bort.När bubblorna har avlägsnats effektivt, stäng sprutportens stoppkranar. Behåll sprutorna på under behandlingen för att möjliggöra efterföljande bubbelavlägsnande, vilket säkerställer att volymen i båda sprutorna är ungefär lika. Torka försiktigt av ytan på den roterande basen och bandkabeln med 70% etanol.Se till att bandkabeln är ansluten till strömförsörjningen. Placera den roterande basen i inkubatorn och fäst bandkabeln på basen. Placera strömförsörjningen nära, men utanför inkubatorn.Fäst SMG-behandlingskärlet genom att rikta in kärltrådarna på den roterande pinnen och vrid försiktigt den roterande pinnen på basen moturs. Se till att fartyget är ordentligt fastsatt. Håll inkubatorn vid ca 100%fuktighet genom att fylla vattenbrickan med autoklav RO-vatten.Justera inkubatorns rotationshastighet för att matcha cellernas sedimenteringshastighet, så att cellerna inte faller genom mediet. På den första dagen av inrättande behandling, kontrollera bubbelbildning med några timmars mellanrum som beskrivs i textmanuskriptet. Ta bort bubblorna minst en gång om dagen fram till slutet av önskad behandlingslängd.När den planerade behandlingslängden har förflutit, stoppa rotationen och demontera apparaten. Ta bort behandlingskärlet genom att försiktigt hålla kärlet stillastående medan du vrider enhetens roterande pinne medurs. Ta med kontrollkolven, kontrollkärlet och det behandlade kärlet i ett sterilt biologiskt säkerhetsskåp.Ta varje kärl utom kontrollkolven och vänd det så att det är vänt nedåt. Slå sedan försiktigt på den för att få alla celler i suspension. Vänd sedan kärlet på sidan med påfyllningsporten mot botten och slå det igen för att styra cellerna mot påfyllningsporten för effektiv aspiration.Hantera varje kärl individuellt. Skruva loss sprutorna från de två portarna och fördela dem i det biologiska riskavfallet. Öppna kranarna på sprutportarna.Ta försiktigt bort locket på påfyllningsporten och dra upp innehållet med en steril 10 ml serologisk pipett och luta kärlet när det töms. Fördela innehållet i alla kontroll- och behandlingsgrupper i individuellt märkta 15 ml koniska rör. Stäng varje rör och vänd dem försiktigt några gånger för att säkerställa att de blandas ordentligt.Använd den föredragna metoden för att bestämma koncentrationen och viabiliteten hos den resulterande cellkulturen för att förbereda för efterföljande experimentella analyser. NK-92-cellinjens startviabilitet och sätestätheter jämfördes med den resulterande slutviabiliteten och slutkoncentrationerna. Efter en 72-timmars SMG-behandling jämfördes två fall av negativa och positiva resultat.Som jämförelse var det optimala koncentrationsområdet för NK-92-cellinjen som användes mellan 0,3 och 1,2 miljoner celler per milliliter med en fördubblingstid på cirka två till tre dagar. Spridningen i SMG-behandlingsgruppen var ungefär lika stor i kontroll- och behandlingsgrupperna. Dessa parametrar var avgörande för den experimentella framgången nedströms och de resulterande cellerna från de två kontrollgrupperna utförde på liknande sätt i nedströms experimentella analyser.Det är viktigt att övervaka och redogöra för bubbelbildning under hela behandlingen, särskilt i cellkulturen som utsätts för simulerad mikrogravitation. Stor bubbelbildning kan orsaka störningar i vätskedynamiken i kärlet, och detta kommer i huvudsak att negera det simulerade mikrogravitationstillståndet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primär Neuron odlingssystem för studier av Herpes simplex virus latens och återaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Ändring av primära humana T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Odling Mikroglia från neonatal och vuxna centrala nervsystemet

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolering och Th17 differentiering för naiv CD4 T-lymfocyter

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Bedömning av Innate Sensing av HIV-1 infekterade CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler från Plasmacytoid dendritiska celler med en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Samodlingssystemet.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Visualisering av IL-22-uttryckande lymfocyter med hjälp av Reporter Möss

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Molekylär diffusion i plasmamembran primära lymfocyter Mätt genom fluorescenskorrelationsspektroskopi

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious cellodlingssystem och<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylaktiska effekten av interferoner

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Snabb kvantifiering av Mitogen-inducerad blastogenes i T-lymfocyter för att identifiera immunmodulerande läkemedel

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolera lymfocyter från mus små Intestinal immunförsvaret

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...