Name: culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system
Uploaded: 2022-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

Bu çalışma Kanada Uzay Ajansı (CSA), araştırma hibesi (17ILSRA3, İmmüno Profil) tarafından desteklenmektedir. Yazarlar, Dr. Roxanne Fournier (Toronto Üniversitesi), Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial Üniversitesi) ve Preteesh Mylabathula'ya (Arizona Üniversitesi) bu protokolün ilk sorun giderme konusundaki yardımları için teşekkür etmek ve teşekkür etmek ister.

NOT: Aşağıdaki adımlar steril bir biyolojik güvenlik kabini içinde tamamlanmalıdır.
1. Hücre kültürü için damarların hazırlanması
<ol><li>Kültür kaplarını plastik ambalajdan çıkarın. Janttaki her bir damarı, hangi hücre tipinin / hattının kullanıldığına, kontrol (1G) veya tedavi (SMG) olup olmadığına ve diğer ilgili bilgilere göre etiketleyin.</li>
	<li>Kabı stabilize edin ve dolum portu kapağı mandalına/O-ringine dokunmadan dolum port...

<ol>
	<li>ElGindi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+the+force+be+with+you+(or+not):+the+immune+system+under+microgravity.">May the force be with you (or not): the immune system under microgravity.</a> Cells. 10 (8), 1941 (2021).</li><li>Chouk&#232;r, A., Ullrich, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+system+dysregulation+during+spaceflight:+potential+countermeasures+for+deep+space+exploration+missions.">Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).</li><li>Crucian, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Countermeasures-based+improvements+in+stress,+immune+system+dysregulation+and+latent+herpesvirus+reactivation+onboard+the+International+Space+Station+-+relevance+for+deep+space+missions+and+terrestrial+medicine.">Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station - relevance for deep space missions and terrestrial medicine.</a> Neuroscience &amp; Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).</li><li>Herranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground-based+facilities+for+simulation+of+microgravity:+organism-specific+recommendations+for+their+use,+and+recommended+terminology.">Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology.</a> Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).</li><li>Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+current+microgravity+platforms+for+space+biology+research.">Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research.</a> Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).</li><li>Murphy, K., Weaver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Janeway's Immunobiology 9th Edition. , (2016).</li><li>Dedolph, R. R., Dipert, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+gravity+stimulus+nullification+by+clinostat+rotation.">The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation.</a> Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).</li><li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+suspension+culture:+the+rotating-wall+vessel.">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).</li><li>Crabb&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+proteomic+responses+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+to+spaceflight+conditions+involve+Hfq+regulation+and+reveal+a+role+for+oxygen.">Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).</li><li>Ulbrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+simulated+and+real+microgravity+on+bone+cells+and+mesenchymal+stem+cells.">The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells.</a> BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).</li><li>Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+and+simulated+microgravity+cause+a+significant+reduction+of+key+gene+expression+in+early+T-cell+activation.">Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).</li><li>Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+cell+line+(NK-92)+with+phenotypical+and+functional+characteristics+of+activated+natural+killer+cells.">Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.</a> Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).</li><li>Williams, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+NK-92+cells+for+refractory+hematological+malignancies+relapsing+after+autologous+hematopoietic+cell.">A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell.</a> Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).</li><li>Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol">https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol</a> (2022)</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2022)</li><li>Mylabathula, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+disarms+human+NK-cells+and+inhibits+anti-tumor+cytotoxicity+in+vitro.">Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro.</a> Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+simulated+microgravity+on+primary+human+NK+cells.">Effects of simulated microgravity on primary human NK cells.</a> Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).</li><li>Shao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+effect+of+simulated+microgravity+on+the+cytotoxicity+of+NK+cells+following+the+DNA+methylation+of+NKG2D+and+the+expression+of+DAP10.">Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10.</a> Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).</li><li>Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+attachment-independent+biofilm+formation+and+repression+of+hfq+expression+by+low-fluid-shear+culture+of+Staphylococcus+aureus.">Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).</li><li>Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air+bubble-isolating+rotating+wall+vessel+bioreactor+for+improved+spheroid/organoid+formation.">An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).</li></ol>

İnsanlık Ay ve Mars'a daha uzun uzay görevlerine hazırlanırken, astronotlardaki ciddi sağlık risklerini azaltmak için daha fazla araştırma yapılması gerekiyor. İnsan fizyolojisini etkileyen uzay ortamının önemli bir yönü mikro yerçekimidir. Burada, ticari olarak temin edilebilen bir döner hücre kültürü sistemi kullanılarak lenfositleri SMG'ye maruz bırakmak için bir hücre kültürü yöntemi tanımlanmıştır.
Bu protokol, kullanılan hücre türüne veya satıra b...

Uzay uçuşunun, bağışıklık sistemi de dahil olmak üzere insan fizyolojisinin birçok yönünü etkilediği gösterilmiştir. Birçok çalışma, in vivo uzay uçuşu ve in vitro 1,2,3,4 simüle edilmiş mikro yerçekimine (SMG) maruz kalmanın bir sonucu olarak immün disregülasyonun kanıtlarını göstermiştir. İnsan fizyolojisini etkileyen uzay ortamının önemli bir yönü mikro yerçekimidir. Mikro yerçekimi, uzay ortamındaki düşük yerçekimi kuvvetleri nedeniyle yaşanan "ağırlıksızlığı" ifade eder5. İnsanlık Ay ve Mars'a daha uzun uzay görevlerine hazırlanırken, astronotlardaki ciddi sağlık risklerini azaltmak için daha fazla araştırma yapılması gerekiyor.
Bilimsel araştırmalar için gerçek mikro yerçekimi koşulları, Uluslararası Uzay İstasyonu'ndaki (ISS) uzayda veya yörüngeye fırlatılan nanouydularda elde edilebilir; ancak, bu seçeneklerin düzenlenmesi inanılmaz derecede maliyetli ve karmaşık olabilir. Uzayda biyolojik araştırma yapmanın mevcut sınırlamaları göz önüne alındığında, Dünya'da gerçek mikro yerçekimi ve SMG'yi indüklemek için çeşitli seçenekler mevcuttur. Düşme kuleleri, parabolik uçuş ve sondaj roketleri de dahil olmak üzere Dünya'da kısa süreli gerçek mikro yerçekimi üretebilen büyük ölçekli operasyonlar mevcuttur. Bununla birlikte, bu yöntemler, büyük ölçüde kısa süreli mikro yerçekimi muamelesi (yani, saniyeler ila 20 dakika) nedeniyle, mikro yerçekiminin biyolojik sistemler üzerindeki etkilerini incelemek için aşırı derecede uygun değildir. Bu yöntemler başka yerlerde daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır 5,6. Biyolojik hücre kültürü için uygun olan seçenekler arasında 2D klinostatlar veya döner duvar kabı (RWV) cihazları ve 3D klinostatlar veya rastgele konumlandırma makineleri (RPM) gibi küçük ölçekli cihazlar bulunur. Bu cihazlar, 37 ° C ve% 5 CO2'de tutulan hücre kültürü inkübatörlerinin içine kurulabilir ve hücre kültürünü yatay bir eksende (2D) veya iki dikey eksende (3D)5 döndürürler. Bununla birlikte, bu kültürleme yöntemlerinin, biyolojik araştırma bağlamları için uzayda en uygun şekilde elde edilen gerçek mikro yerçekiminin aksine SMG ürettiğini vurgulamak önemlidir.
Bu makalenin amacı, 2D klinostat sınıflandırmasına giren ticari olarak temin edilebilen bir RWV cihazı (Malzeme Tablosu) kullanarak lenfositleri SMG'ye maruz bırakma adımlarını özetlemektir. Bu cihazı çalıştırmak için üreticiden genel bir protokol mevcut olsa da, mevcut makale sorun giderme ve optimizasyon adımlarını daha ayrıntılı olarak ele almayı amaçlamaktadır. Bu makale ayrıca, bu cihazın süspansiyon hücre kültüründe, özellikle lenfositlerle SMG üretmek için nasıl çalıştığının arkasındaki teoriyi de kapsamaktadır. Bu bağlamda, süspansiyon hücre kültürü, herhangi bir ek iskeleye bağlı kalmadan, takviye edilmiş kültür ortamında serbestçe büyüyen hücreleri ifade eder. Birçok hücre tipi, lenfositler de dahil olmak üzere süspansiyon hücre kültüründe yetiştirilir. Lenfositler, lenfoid organlarda ve kan dolaşımında bulunan T, B ve Doğal Öldürücü (NK) hücreleri de dahil olmak üzere bağışıklık sisteminin hücreleridir7.
Burada tarif edilen RWV 2D klinostat, zaman ortalamalı yerçekimi vektörü nullification 5,6,8,9 prensibi üzerinde çalışır, bu sayede yerçekimi vektörü, hücre kültürünün yatay bir eksen üzerinde dönmesiyle randomize edilir. Bu, kültür kabının dönme hızını hücrelerin çökeltme hızıyla eşleştirerek elde edilir. Kültür kabının dönme hızı, hücrelerin çökelme hızıyla iyi eşleştiği sürece, hücreler serbest düşüşte tutulur ve uzay ortamında yaşandığı gibi çökelemez. İlk hızlanma aşamasından sonra, kültür kabındaki ortam zamanla "katı vücut rotasyonuna" ulaşır. Bu yatay rotasyon aynı zamanda hücre kültürü damarında laminer akışı indükler. Bu, laminer akışla hücreler üzerinde indüklenen kayma stresinin türbülanslı akıştan çok daha az olduğu göz önüne alındığında, "düşük kesme" ortamı yaratır. Bununla birlikte, klinostatın mükemmel bir sistem olmadığı göz önüne alındığında, hücreler üzerinde minimum kayma stresi yaratan bazı küçük, laminer sıvı hareketleri vardır. Bu nedenle, medyada asılı kalan hücreler, dönme sırasında bu akış tarafından sürüklenir. Yatay dönme sırasında, yerçekimi vektörü hücrelere etki eder ve onları Şekil 1'de görselleştirildiği gibi salınımlı bir yörüngeye getirir. Bir başka küçük kayma stresi kaynağı, hücrelerin ortamdan "düşmesi" ve hücrelerin etrafında laminer akışa neden olmasından kaynaklanır. Kültür kabı yatay bir eksen üzerinde dönerken, hücrelerin deneyimlediği yerçekimi vektörü de döner. Zamanla, bu dönen yerçekimi vektörü sıfıra yaklaşmak için ortalamaya ulaşır; Bu fenomene zaman ortalamalı yerçekimi vektörü nullifikasyonu denir ve SMG 5,6,8,9 durumunu indükler. Bu cihaz, SMG'nin bazıları10,11,12 referanslarında ele alınan birçok hücre tipi üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılmıştır. Daha fazla örnek, cihaz üreticisinin web sitesinde bulunabilir.
Bu RWV cihazı, cihaz üreticisi tarafından sunulan özel "yüksek en boy oranlı kaplar" (HARV'ler) kullanır. Bu HARR'ların her biri 10 mL hücre kültürü tutar; ancak 50 mL HARV'ler de mevcuttur. 10 mL veya 50 mL HARV'ler, tartışma bölümünde daha ayrıntılı olarak özetlenen herhangi bir aşağı akış deneysel tahlilini tamamlamak için kaç hücreye ihtiyaç duyulduğuna bağlı olarak kullanılabilir. HARV'ler polikarbonattan yapılmıştır ve hücre kültürü sırasında gaz değişimine izin vermek için bir silikon oksijenasyon membranı içerir. Bu, hücre ortamının pH'ını korur ve verimli hücresel solunuma izin verir. Kabın yüzünde bir ana dolum portu ve iki adet kapaklı şırınga portu bulunmaktadır (Şekil 2A). Hücre kültürünü ana dolum portundan yükledikten sonra, kabarcığın çıkarılmasına yardımcı olmak için kaba iki şırınga yüklenir. 10 mL'lik damarları kullanırken, iki adet 3 mL'lik şırınga iyi çalışır. Bir şırınga cihaza boş olarak bağlanır, şırınga tamamen bastırılır ve diğeri 3 mL hücre kültürü ile doldurulur (Şekil 2E). Bunlar, SMG tedavisini sürdürmek için önemli olan kabarcıkları damardan çıkarmak için kombinasyon halinde kullanılır. Genel olarak, "Flask" kontrolü ve "1G" kontrolü olarak adlandırılabilecek iki negatif kontrolün kurulması önerilir. "Flask" kontrolü, standart bir T25 süspansiyon hücre kültürü şişesinde yetiştirilen hücrelere karşılık gelir. 1G kontrolü, inkübatöre basitçe yerleştirilen (yani, SMG işlemine tabi tutulmadan) özel 10 mL kültür kabında yetiştirilen hücrelere karşılık gelir. Denetimler hakkında daha fazla ayrıntı için lütfen Tartışma bölümüne bakın.
Burada açıklanan yöntem, SMG'nin lenfositler üzerindeki etkilerini incelemek isteyen herhangi bir araştırmacı için, NK92 hücre hattı13'ü kullanarak NK hücrelerine özel bir odaklanma ile uygundur. Bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar, uzay uçuşunun insan bağışıklık sistemi üzerindeki olumsuz etkilerini daha iyi anlamamıza ve hafifletmemize yardımcı olabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>D-410</td>
			<td>Gamma sterilized culture vessels (4/box)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok tip syringes (3 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>For attaching to the 10 mL HARVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92 Cell-line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4D</td>
			<td>Rotating wall vessel device; 2D clinostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-809-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarsedt sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 suspension culture flasks</td>
			<td>Sarsedt</td>
			<td>83.3910.502</td>
			<td>For flask control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing lymphocytes in simulated microgravity using a rotary cell culture system

Uzayda biyolojik araştırma yapmanın mevcut sınırlamaları göz önüne alındığında, hücre kültürünü Dünya'daki simüle edilmiş mikro yerçekimine (SMG) maruz bırakmak için birkaç seçenek vardır. Bu seçenekler yöntemlerine, prensiplerine ve süspansiyon hücre kültürü ile kullanıma uygunluklarına göre değişir. Burada, lenfositleri, 2D klinostat veya dönen duvar kabı (RWV) cihazı olarak da bilinen, ticari olarak temin edilebilen bir döner hücre kültürü sistemi kullanarak simüle edilmiş mikro yerçekimine maruz bırakmak için bir hücre kültürü yöntemi açıklanmaktadır. Bu hücre kültürü yöntemi, hücreleri yatay bir eksende döndürerek mikro yerçekimini simüle etmek için zaman ortalamalı yerçekimi vektörü nullifikasyonu prensibini kullanır. Bu sistemde kültürlenen hücreler, simüle edilmiş mikro yerçekiminin hücresel fonksiyon ve fizyoloji üzerindeki etkilerini değerlendirmek için birçok farklı deneysel tahlilde toplanabilir ve kullanılabilir. Kültürleme tekniği, kullanılan hücre tipine veya çizgisine bağlı olarak biraz değişebilir, ancak burada açıklanan yöntem herhangi bir süspansiyon tipi hücre kültürüne uygulanabilir.

Bu kültürleme yöntemi, 1) hücrelerin çoğalması kontrol grupları (ve ideal olarak tüm deney grupları) arasında yaklaşık olarak tutarlıysa, 2) tohumlama yoğunluğu, tedavinin uzunluğu ve hücre tipinin / hattının iki katına çıkma süresi göz önüne alındığında çoğalma uygunsa ve 3) hasat edilen hücrelerin yaşayabilirliği% 85 veya daha yüksekse başarılı kabul edilir (Tablo 1 ). İdeal olarak, elde edilen hücreler, özellikle sonraki deneylerde ve tahlillerde kullanılmak...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System at JoVE.com

Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System

Bu, özel tek kullanımlık kültür kapları kullanarak simüle edilmiş mikro yerçekiminde lenfositleri kültürlemek için ticari olarak temin edilebilen bir döner hücre kültürü sistemi kullanmak için adım adım bir kılavuzdur. Bu kültürleme yöntemi herhangi bir süspansiyon tipi hücre kültürüne uygulanabilir.

Bir Döner Hücre Kültür Sistemi Kullanarak Simüle Edilmiş Mikrogravitede Lenfositlerin Kültürlenmesi

Given the current limitations of conducting biological research in space, a few options exist for subjecting cell culture to simulated microgravity (SMG) ...

Bu teknik, uzay ortamının yönlerinin insan fizyolojisini moleküler düzeyde nasıl etkilediğini daha iyi anlamamıza yardımcı olmak için simüle edilmiş mikro yerçekiminin bağışıklık hücreleri üzerindeki etkilerini incelememizi sağlar. Bu teknik ekonomik olarak uygulanabilir ve hücre kültürünü uzaya göndermeye veya hücre kültürünü yeryüzündeki simüle edilmiş mikro yerçekimine maruz bırakmanın diğer yöntemlerine kıyasla kurulumu ve bakımı nispeten kolaydır. Taşma ve dökülmeyi önlemek için kapları doldururken yavaş gitmeniz önerilir.İlk kabarcık çıkarıldıktan sonra, şırıngaları kullanarak damarların tamamen dolu olduğundan emin olun. Bu, tedavi boyunca büyük kabarcık oluşumu olasılığını en aza indirecektir. Kültür kaplarını plastik ambalajdan çıkararak başlayın.Janttaki her bir damarı, kullanılan hücre tipine veya hattına, kontrol veya tedavide olup olmadığına ve diğer ilgili bilgilere göre etiketleyin. Kabı stabilize edin ve dolum portu kapağı mandalına veya O-ring'e dokunmadan dolum portunu dikkatlice açın. Kapağı, kap doldurulurken mandal veya O-ring yukarı bakacak şekilde bir etanol pedi üzerine yerleştirin.Kapakları şırınga bağlantı noktalarından çıkarmayın. Steril bir serolojik pipet kullanarak kabı hücre kültürü için 10 mL uygun komple ortam ile yükleyin ve kapağı dikkatlice dolum portuna yerleştirin. Şırınga bağlantı noktası kapaklarının ve dolum portunun güvenli bir şekilde kapatıldığından emin olun.Ardından, damarları hücre kültürü için hazırlamak için sonraki adımları gerçekleştirirken doldurulmuş kapları bir inkübatöre yerleştirin. Medya astarlanmış kapları inkübatörden alın. Bir şişe kontrolü için, yukarıda hazırlanan stoktan 10 mL hücre kültürüne sahip bir T25 süspansiyon kültürü şişesi yükleyin.Şırıngaları yüklemek için kullanılacak ayrı bir 15 mL konik tüpe 10 mL stok hücre kültürü ekleyin. Şırınga bağlantı noktası kapaklarını tekneden çıkarmak için sökün ve stok durdurucularının açık konumda olduğundan emin olun. Kabı stabilize edin ve dolum portu kapağı mandalına veya O-ring'e dokunmadan dolum portunu dikkatlice açın.Kapağı, kap doldurulurken mandal veya O-ring yukarı bakacak şekilde bir etanol pedi üzerine yerleştirin. Stopcock'ların açık konumda olduğundan emin olun. Ortam, serolojik bir pipet kullanılarak ortamın kaptan bir çöp konteynerine dökülmesiyle boşaltılabilir.Alternatif olarak, vakum sistemine bağlı pipetinizin yanından steril bir cam kullanarak ortamı aspire edin. Bir pipet veya vakum sistemi kullanırken, oksijenasyon membranına dokunmadığınızdan emin olun, çünkü bu ona zarar verebilir ve kabı kullanılamaz hale getirebilir. Hazırlanan stok hücre kültürünü içeren 50 mL konik tüpü sıkıca kapatın ve içeriği iyice karıştırmak için birkaç kez hafifçe ters çevirin.Taze steril serolojik pipet ile 50 mL tüpten 10 mL hücre kültürü stoğu çekin. Kabı alın ve eğin, böylece doldurma portu üste doğru olacaktır. Daha sonra hücre kültürü stoğunu dolum portundan kabın içine dikkatlice dağıtın.Dökülmeyi önlemek için kabı tekrar aşağı doğru eğerken, kabı doldurma portunun ucuna kadar doldurun. Çok kırılgan olduğu için oksijenasyon membranına pipetle dokunmamaya dikkat edin. Gemi yüklendikten sonra, dolum portu kapağını O-ringine dokunmadan dikkatlice tekrar takın.İlk 3 mL şırıngayı paketinden çıkarın ve gevşetmek için birkaç kez pompalayın. Daha sonra şırıngayı şırınga portlarından birine takın ve şırınganın tamamen bastırılmasını sağlayın. 10 mL aliquot hücre kültürü içeren 15 mL konik tüpü sıkıca kapatın ve içeriği iyice karıştırmak için birkaç kez hafifçe ters çevirin.Benzer şekilde, ikinci 3 mL şırıngayı paketinden çıkarın ve birkaç kez pompalayın. Daha sonra bu şırıngayı 15 mL konik tüpten hücre kültürüne dikkatlice yarıya batırın ve bir miktar kültür hazırlayın. Şırıngayı tamamen tüpe geri dağıtarak ve 3 mL kültür çekerek hava kabarcıklarını en aza indirin.Doldurulmuş şırıngayı kalan şırınga portuna takın ve şırıngaları ve dolum portunun etrafını bir etanol pedi ile dikkatlice sterilize edin. Oksijenasyon membranına etanol almayın. Kalan gemiler için işlemi tekrarlayın.Son damar için 50 mL konik tüpte biraz yetersiz bir hücre kültürü kalırsa, kalan miktarı şırıngaları yüklemek için kullanılan 15 mL konik tüpten geri kazanın. Hücrelerin ve kabarcıkların şırıngalardan damarlara göçünü sınırlamak için şırınga portu stopcocklarının kapalı olduğundan emin olun. Gemiyi baş aşağı çevirin ve ilk kabarcıkları toplamak için birkaç kez yan tarafa vurun.Kabı yukarı bakacak şekilde hızlı bir şekilde geri çevirin ve ardından hafif bir açıyla uzağa bakın, böylece kabarcıkların tümü kabın yukarı tarafına doğru yüzer. Limanın altındaki kabarcıkları boş şırıngayla manevra yapın ve limana girmeye başlamalarını izleyin. Şırınga portu stopcock'larının her ikisini de açın.Kabarcıkları boş şırıngaya doğru yüzmeye teşvik etmek için gemiye yavaşça vurun. Oksijenasyon zarının patlamaması için kaptaki basıncı korumak için tam şırıngayı dikkatlice bastırırken, boş şırınga ile daha büyük kabarcıkları yavaşça emer. Tüm kabarcıkların çıkarıldığından emin olmak için bu işlemi birkaç kez tekrarlayın.Kabarcıklar etkili bir şekilde çıkarıldığında, şırınga portu stopcock'larını kapatın. Daha sonra kabarcıkların çıkarılmasına izin vermek için tedavi sırasında şırıngaları açık tutun ve her iki şırıngadaki hacmin yaklaşık olarak eşit olmasını sağlayın. Dönen tabanın ve şerit kablonun yüzeyini %70 etanol ile dikkatlice silin.Şerit kablonun güç kaynağına bağlı olduğundan emin olun. Dönen tabanı inkübatöre yerleştirin ve şerit kablosunu tabana takın. Güç kaynağını inkübatörün yakınına, ancak dışına yerleştirin.SMG arıtma kabını, kap dişlerini dönen mandala dizerek ve dönen mandalı tabanda saat yönünün tersine yavaşça çevirerek takın. Geminin güvenli bir şekilde takıldığından emin olun. Su tepsisini otoklav RO suyuyla doldurarak inkübatörü yaklaşık% 100 nemde tutun.İnkübatörün dönme hızını, hücrelerin çökeltme hızına uyacak şekilde ayarlayın, böylece hücreler ortamdan düşmez. Tedaviyi kurmanın ilk gününde, metin makalesinde açıklandığı gibi birkaç saatte bir kabarcık oluşumunu kontrol edin. Kabarcıkları, istenen tedavi uzunluğunun sonuna kadar ileriye doğru günde en az bir kez çıkarın.Planlanan işlem süresi geçtikten sonra, dönüşü durdurun ve aparatı sökün. Cihazın dönen mandalını saat yönünde çevirirken kabı yavaşça sabit tutarak arıtma kabını çıkarın. Kontrol şişesini, kontrol ve arıtılmış kabı steril bir biyolojik güvenlik kabinine getirin.Kontrol şişesi hariç her bir kabı alın ve aşağı bakacak şekilde çevirin. Sonra tüm hücreleri süspansiyona getirmek için yavaşça vurun. Ardından, kabı dolum portu ile dibe doğru kendi tarafına çevirin ve etkili aspirasyon için hücreleri dolum portuna doğru yönlendirmek için tekrar vurun.Her gemiyi ayrı ayrı tutun. Şırıngaları iki porttan sökün ve biyolojik tehlike atıklarına dağıtın. Şırınga portlarındaki tapaları açın.Doldurma portu kapağını dikkatlice çıkarın ve steril bir 10 mL serolojik pipet kullanarak içeriği çizin ve kabı boşaltırken eğin. Tüm kontrol ve tedavi gruplarının içeriklerini ayrı ayrı etiketlenmiş 15 mL konik tüplere dağıtın. Her tüpü kapatın ve düzgün bir şekilde karıştırıldıklarından emin olmak için birkaç kez yavaşça ters çevirin.Daha sonraki deneysel testlere hazırlanmak için elde edilen hücre kültürünün konsantrasyonunu ve canlılığını belirlemek için tercih edilen yöntemi kullanın. NK-92 hücre hattı başlangıç canlılığı ve oturma yoğunlukları, ortaya çıkan son canlılık ve son konsantrasyonlarla karşılaştırıldı. 72 saatlik bir SMG tedavisinden sonra, iki negatif ve pozitif sonuç örneği karşılaştırıldı.Karşılaştırma için, kullanılan NK-92 hücre hattının optimal konsantrasyon aralığı, mililitre başına 0.3 ila 1.2 milyon hücre arasındaydı ve yaklaşık iki ila üç günlük bir iki katına çıkma süresi vardı. SMG tedavi grubunda proliferasyon, kontrol ve tedavi gruplarında yaklaşık olarak eşitti. Bu parametreler aşağı akış deneysel başarısı için gerekliydi ve iki kontrol grubundan elde edilen hücreler aşağı akış deneysel tahlillerinde benzer şekilde gerçekleştirildi.Tedavi boyunca, özellikle simüle edilmiş mikro yerçekimine maruz kalan hücre kültüründe, kabarcık oluşumunu izlemek ve hesaba katmak çok önemlidir. Büyük kabarcık oluşumu, gemi içindeki akışkan dinamiklerinde bozulmaya neden olabilir ve bu, simüle edilmiş mikro yerçekimi durumunu esasen olumsuz yönde etkileyecektir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi<sup&gt; +</sup&gt; Bir kullanılması plazmositoid dendritik hücreler tarafından T Hücreleri<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kültür sistemi.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Raportör fareler kullanılarak IL-22 eksprese eden lenfositlerin Görselleştirme

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn Vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Bağışıklık ilaçlarının tanımlanmasında T lenfositlerinde mitojen kaynaklı blastojenez hızlı bir şekilde belirlenmesini

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...