Name: microfluidic acoustophoresis for flowthrough separation of gram-negative bacteria using aptamer affinity beads
Uploaded: 2022-10-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Acoustophoresis for Flowthrough Separation of Gram-Negative Bacteria using Aptamer Affinity Beads at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la subvention de la Fondation nationale de la recherche de Corée (NRF) financée par le gouvernement coréen (ministère des Sciences et des TIC). (Non. NRF-2021R1A2C1011380)

1. Conception de puce d’acoustophorèse microfluidique
REMARQUE : La figure 1 montre un schéma de la séparation et de la collecte des microbilles cibles des microcanaux par acoustophorèse. La puce d’acoustophorèse microfluidique est conçue avec un programme de CAO.
<ol><li>Concevoir une puce d’acoustophorèse microfluidique qui utilise un mélange de billes modifiées par aptamère et de billes de polystyrène (PS) enrobées de strept...

<ol>
	<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustofluidic+separation+of+cells+and+particles.">Acoustofluidic separation of cells and particles.</a> Microsystem &amp; Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).</li><li>Lee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+affinity-bead+mediated+capture+and+displacement+of+Gram-negative+bacteria+using+acoustophoresis.">Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis.</a> Micromachines. 10 (11), 770 (2019).</li><li>Hirvonen, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+numerical+simulation+of+acoustophoretic+motion+induced+by+boundary-driven+acoustic+streaming+in+standing+surface+acoustic+wave+microfluidics.">3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics.</a> Scientific Reports. 11 (1), 11326 (2021).</li><li>Nimjee, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+as+therapeutics.">Aptamer as therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+aptamer+discovery+and+application.">Recent advances in aptamer discovery and application.</a> Molecules. 24 (5), 941 (2019).</li><li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acousto-microfluidics+for+screening+of+ssDNA+aptamer.">Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li><li>Persson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+microfluidic+chip+technology+to+facilitate+automation+of+phage+display+selection.">Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection.</a> The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).</li><li>Van Toan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+processes+for+glass+micromachining.">An investigation of processes for glass micromachining.</a> Micromachines. 7 (3), 51 (2016).</li><li>Jansen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+on+the+reactive+ion+etching+of+silicon+in+microtechnology.">A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14 (1996).</li><li>Hanneborg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon-to-silicon+anodic+bonding+with+a+borosilicate+glass+layer.">Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139 (1991).</li><li>Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+scalable+blood+filtration+device+using+inertial+microfluidics.">Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics.</a> Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+filter+microchip+for+rapid+separation+of+plasma+and+viruses+from+whole+blood.">Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).</li><li>Ai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+Escherichia+coli+bacteria+from+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+standing+surface+acoustic+waves.">Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves.</a> Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).</li><li>Ohlsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+impedance+matched+buffers+enable+separation+of+bacteria+from+blood+cells+at+high+cell+concentrations.">Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+dielectrophoretic+bacterial+separation+and+concentration+from+physiological+media+of+high+conductivity.">Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity.</a> Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).</li><li>Kim, U., Soh, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+sorting+of+multiple+bacterial+targets+using+integrated+Dielectrophoretic-Magnetic+Activated+Cell+Sorter.">Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter.</a> Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).</li><li>Cai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluidic+device+for+immunomagnetic+separation+of+foodborne+bacteria+using+self-assembled+magnetic+nanoparticle+chains.">A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains.</a> Micromachines. 9 (12), 624 (2018).</li></ol>

Nous avons développé un dispositif microfluidique à lévitation sonique pour capturer et transférer les bactéries GN à partir d’échantillons de culture à grande vitesse basé sur une méthode de fonctionnement continu en fonction de leur taille et de leur type, et des microbilles modifiées par aptamère. Le microcanal long et carré permet une conception plus simple et une plus grande rentabilité pour l’acoustophorèse2D que précédemment rapporté 20,21,22,23,24,25,26.<s...

Des plates-formes microfluidiques sont en cours de développement pour isoler les bactéries à partir d’échantillons médicaux et environnementaux, en plus des méthodes basées sur le transfert diélectrique, la magnétophorèse, l’extraction des billes, le filtrage, la microfluidique centrifuge et les effets inertiels, et les ondes acoustiques de surface 1,2. La détection des bactéries pathogènes se poursuit à l’aide de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR), mais elle est généralement laborieuse, complexe et prend beaucoupde temps 3,4. Les systèmes d’acoustophorèse microfluidique sont une solution de rechange pour résoudre ce problème grâce à un débit raisonnable et à une isolation cellulaire sans contact 5,6,7. L’acoustophorèse est une technologie qui sépare ou concentre les perles en utilisant le phénomène du mouvement de la matière à travers une onde sonore. Lorsque les ondes sonores pénètrent dans le microcanal, elles sont triées en fonction de la taille, de la densité, etc., des billes, et les cellules peuvent être séparées en fonction des propriétés biochimiques et électriques du milieu en suspension 7,8. En conséquence, de nombreuses études acoustophorétiques ont été activement poursuivies 9,10,11, et récemment, des simulations numériques 3D du mouvement acoustophorétique induit par l’écoulement acoustique entraîné par les limites dans la microfluidique à ondes acoustiques de surface debout ont été introduites 12.
Des études dans divers domaines examinent comment remplacer les anticorps 2,3. L’aptamère est un matériau cible ayant une sélectivité et une spécificité élevées, et de nombreuses études sont en cours 2,9,10,13. Les aptamères présentent des avantages de petite taille, d’excellente stabilité biologique, de faible coût et de reproductibilité élevée par rapport aux anticorps et sont étudiés dans des applications diagnostiques et thérapeutiques 2,3,14.
Ici, cet article décrit un protocole technologique d’acoustophorèse microfluidique qui peut être utilisé pour la séparation rapide et efficace des bactéries à Gram négatif (GN) d’un milieu à l’aide de microbilles modifiées par aptamère. Ce système génère une onde stationnaire acoustique bidimensionnelle (2D) par actionnement piézoélectrique unique en stimulant simultanément deux résonances orthogonales dans un long microcanal rectangulaire pour aligner et concentrer les microbilles attachées aux aptamères au niveau du nœud et des points anti-nœuds pour l’efficacité de séparation 2,11,15,16 . Il y a un canal bifurqué à l’entrée et à la sortie, permettant la séparation, la purification et la concentration simultanées.
Ce protocole peut être utile dans le domaine du diagnostic précoce des maladies infectieuses bactériennes, ainsi que d’une réponse rapide, sélective et sensible aux infections bactériennes pathogènes grâce à la surveillance de l’eau en temps réel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#181;m polystyrene microbeads</td>
			<td>Bang Laboratories</td>
			<td>PS04001</td>
			<td>Cell size beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;m Streptavidin-coated microbeads</td>
			<td>Bang Laboratories</td>
			<td>CP01007</td>
			<td>Aptamer affinity beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold</td>
			<td>4science</td>
			<td>29-03573-01</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aptamer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>GN3-6&#39;</td>
			<td>RNA for bacteria conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass</td>
			<td>Schott</td>
			<td>BOROFLOAT 33</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Daihan</td>
			<td>CF-10</td>
			<td>Wasing particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>3M</td>
			<td>AD100</td>
			<td>Attach PZT to microchip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>KCTC</td>
			<td>KCTC2571</td>
			<td>Target bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Functional generator</td>
			<td>GW Instek</td>
			<td>AFG-2225</td>
			<td>Generate frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed camera</td>
			<td>Photron</td>
			<td>FASTCAM Mini</td>
			<td>Observation of separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>As one</td>
			<td>HI-1000</td>
			<td>Heating plate for curing of liquid PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe</td>
			<td>Koreavaccine</td>
			<td>22G-10ML</td>
			<td>Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid polydimethylsiloxane, PDMS</td>
			<td>Dow Corning Inc.</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>Cell culture (Luria-Bertani medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus Corp.</td>
			<td>IX-81</td>
			<td>Observation of separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Capricorn scientific</td>
			<td>PBS-1A</td>
			<td>Wasing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK Tubes</td>
			<td>Saint-Gobain Ppl Corp.</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>Inject or collect particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric transducer</td>
			<td>Fuji Ceramics</td>
			<td>C-213</td>
			<td>Generate specific wave in channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power amplifier</td>
			<td>Amplifier Research</td>
			<td>75A250A</td>
			<td>Amplify frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure controller/&#956;flucon</td>
			<td>AMED</td>
			<td>AMED-&#956;flucon</td>
			<td>Control of air pressure/flow controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl buffer</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>15567027</td>
			<td>Wasing particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>SeouLin Bioscience</td>
			<td>SLRM-3</td>
			<td>Modifiying aptamer and bead</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic acoustophoresis for flowthrough separation of gram-negative bacteria using aptamer affinity beads

Cet article décrit la fabrication et le fonctionnement de puces acoustophorétiques microfluidiques à l’aide d’une technique d’acoustophorèse microfluidique et de microbilles modifiées par aptamère qui peuvent être utilisées pour l’isolement rapide et efficace des bactéries à Gram négatif à partir d’un milieu. Cette méthode améliore l’efficacité de séparation en utilisant un mélange de longs microcanaux carrés. Dans ce système, l’échantillon et le tampon sont injectés dans l’orifice d’entrée via un régulateur de débit. Pour le centrage du cordon et la séparation des échantillons, l’alimentation CA est appliquée au transducteur piézoélectrique via un générateur de fonctions avec un amplificateur de puissance pour générer une force de rayonnement acoustique dans le microcanal. Il y a un canal bifurqué à l’entrée et à la sortie, permettant la séparation, la purification et la concentration simultanées. L’appareil a un taux de récupération de >98% et une pureté de 97,8% jusqu’à une concentration de dose 10x. Cette étude a démontré un taux de récupération et une pureté supérieurs aux méthodes existantes de séparation des bactéries, ce qui suggère que le dispositif peut séparer efficacement les bactéries.

La figure 5 montre l’image de l’écoulement du cordon en fonction de la tension PZT (OFF, 0,1 V, 0,5 V, 5 V). Dans le cas de la puce acoustophorétique introduite dans cette étude, il a été confirmé qu’à mesure que la tension du PZT augmentait, la concentration centrale des billes de 10 μm augmentait. La plupart des billes de 10 μm étaient concentrées au centre à 5 V de la tension PZT. Grâce à ce résultat, une fréquence de résonance de 3,66 MHz a été générée dans un...

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Microfluidic Acoustophoresis for Flowthrough Separation of Gram-Negative Bacteria using Aptamer Affinity Beads

Cet article décrit la fabrication et le fonctionnement de puces acoustophorétiques microfluidiques à l’aide de la technique de l’acoustophorèse microfluidique et de microbilles modifiées par aptamères qui peuvent être utilisées pour isoler rapidement et efficacement les bactéries à Gram négatif d’un milieu.

Acoustophorèse microfluidique pour la séparation en continu de bactéries à Gram négatif à l’aide de billes d’affinité aptamères

This article describes the fabrication and operation of microfluidic acoustophoretic chips using a microfluidic acoustophoresis technique and ...

Ce protocole décrit notre technologie d’acoustophorèse microfluidique qui peut être utilisée pour la séparation rapide et efficace des bactéries à Gram négatif d’un milieu à l’aide de microbilles modifiées par aptamère. Les systèmes d’acoustophorèse microfluidique permettent la séparation des bactéries à Gram négatif avec un débit raisonnable et une isolation cellulaire sans contact. L’acoustophorèse microfluidique peut être optimisée pour isoler les bactéries à partir d’échantillons médicaux et environnementaux.Pour commencer, concevez une puce d’acoustophorèse microfluidique qui recueille les billes de PS à la sortie cible et élimine le reste après avoir injecté un mélange d’échantillons de PS dans l’entrée de l’échantillon. Préparez une puce avec les couches au-dessus et au-dessous de la couche de silicium collées au verre borosilicate. Et une troisième couche de verre borosilicate, en utilisant l’anodisation, ajoute 1000 volts et 400 degrés Celsius.Fixez un PZT à la couche de verre borosilicaté le long du canal microfluidique en utilisant moins de 10 microlitres d’adhésif cyanoacrylate. Inoculer les bactéries GN et GP dans le milieu Luria-Bertani et les incuber à 37 degrés Celsius et 220 tours par minute pendant 16 heures. Centrifuger les bactéries cultivées à 9 056 FCR pendant une minute à température ambiante.Ensuite, lavez deux fois avec 1X tampon PBS. Préparer les bactéries GN et GP sélectionnées pour l’analyse en les remettant en suspension dans le tampon de liaison. Remettez en suspension le mélange de microbilles enrobées de streptavidine de 10 micromètres avant utilisation.Vortex le mélange pendant 20 secondes. Préparez l’aptamère en le dénaturant à 95 degrés Celsius pendant trois minutes, puis en le repliant à zéro degré Celsius pendant deux minutes. Transférez 250 microlitres du mélange de microbilles recouvertes de streptavidine en suspension dans un tube de 1,5 millilitre et ajoutez 100 microlitres d’aptamère d’ADN biotinylé dans le tube.Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 minutes tout en tournant à 25 tours par minute. Centrifuger le mélange réactionnel à 9, 056 RCF pendant 40 secondes à température ambiante. Ensuite, lavez le tube deux fois avec 200 microlitres de tampon Tris-HCl.Ajouter 10 microlitres de 100 milligrammes par millilitre de BSA au tube d’échantillon lavé et incuber pendant 30 minutes à température ambiante tout en tournant à 25 tours par minute. Enfin, laver deux fois les microbilles modifiées aptamères dans le tampon Tris-HCl par centrifugation à 9, 056 RCF pendant 40 secondes à température ambiante. Connectez les tubes en PEEK aux deux entrées pour injecter deux échantillons et un tampon, ainsi qu’aux deux sorties pour la collecte et le rejet des déchets.À l’aide d’une seringue de 10 millilitres, remplir le canal d’acoustophorèse microfluidique avec de l’eau déminéralisée sans bulles. Préparez un régulateur de pression de précision avec deux canaux de sortie ou plus pour contrôler le débit du fluide. Après avoir préparé le dispositif, injecter l’échantillon et le tampon en appliquant une pression de deux kilopascals à l’entrée de l’échantillon et de quatre kilopascals à l’entrée du tampon à l’aide du dispositif de contrôle de pression de précision.À l’aide d’un microscope, faites la mise au point sur une bille et déplacez-la vers le centre du canal microfluidique à l’aide du PZT. Générez une fréquence de résonance de 3,66 mégahertz à l’aide d’un générateur de fonction à canal unique et amplifiez un signal typique de 16 décibels à l’aide d’un amplificateur de puissance. Observez les processus de séparation et d’enrichissement sur la puce acoustofluidique avec un microscope à fluorescence et une caméra haute vitesse fonctionnant à 1 200 images par seconde.La puce acoustophorétique introduite dans cette étude a confirmé que, à mesure que la tension du PZT augmentait, la concentration centrale des billes de 10 micromètres augmentait. À cinq volts de la tension PZT, la plupart des billes de 10 micromètres étaient concentrées au centre. Le rapport entre le nombre de billes collectées à la sortie et le nombre total de billes injectées de 10 micromètres a été appelé taux de récupération.Le rapport entre le nombre de perles de taille micrométrique et le nombre total de perles collectées a été appelé pureté. Les résultats ont indiqué que l’appareil avait une efficacité de séparation élevée pour les billes d’une taille de 10 micromètres. Le nombre de bactéries GN et GP liées à chaque microbille modifiée aptamère a été mesuré à l’aide d’un microscope équipé d’une caméra à grande vitesse.Les cinq bactéries GN étaient liées aux billes tandis que beaucoup moins de bactéries GP étaient liées aux substances testées. L’intensité du signal différait significativement entre les bactéries GN et GP. L’adhésif utilisé pour fixer le PZT doit être utilisé le moins possible pour la précision de l’ondulation et le PZT et le microcanal doivent être parallèles.Ce dispositif peut être utilisé pour détecter des bactéries vivantes ou des biomarqueurs dérivés de bactéries pendant la période de diagnostic précoce des maladies infectieuses bactériennes.

Research

JoVE Journal

Engineering

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Solvent Bonding for Fabrication of PMMA and COP Microfluidic Devices

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Thermoplastic microfluidic devices offer many advantages over those made from silicone elastomers, but bonding procedures must be developed for each ...

A Modular Microfluidic Technology for Systematic Studies of Colloidal Semiconductor Nanocrystals

Une technologie Microfluidic modulaire pour l’étude systématique des nanocristaux semiconducteurs colloïdal

Colloidal semiconductor nanocrystals, known as quantum dots (QDs), are a rapidly growing class of materials in commercial electronics, such as light ...

A Pipette-Tip Based Method for Seeding Cells to Droplet Microfluidic Platforms

Méthode fondée sur un embout de la Pipette pour semis de cellules aux plateformes microfluidiques Droplet

Amongst various microfluidic platform designs frequently used for cellular analysis, droplet-microfluidics provides a robust tool for isolating and ...