Name: microfluidic acoustophoresis for flowthrough separation of gram-negative bacteria using aptamer affinity beads
Uploaded: 2022-10-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Acoustophoresis for Flowthrough Separation of Gram-Negative Bacteria using Aptamer Affinity Beads at JoVE.com

इस काम को कोरियाई सरकार (विज्ञान और आईसीटी मंत्रालय) द्वारा वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। (नं. एनआरएफ-2021आर1ए2सी1011380)

1. माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस चिप डिजाइन
नोट: चित्रा 1 ध्वनिकफोरेसिस द्वारा माइक्रोचैनलों से लक्ष्य माइक्रोबीड्स के पृथक्करण और संग्रह का एक योजनाबद्ध दिखाता है। माइ...

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	<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustofluidic+separation+of+cells+and+particles.">Acoustofluidic separation of cells and particles.</a> Microsystem &amp; Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).</li><li>Lee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+affinity-bead+mediated+capture+and+displacement+of+Gram-negative+bacteria+using+acoustophoresis.">Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis.</a> Micromachines. 10 (11), 770 (2019).</li><li>Hirvonen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+sample+preparation+of+positive+blood+cultures+for+the+direct+detection+of+methicillin-sensitive+and+-resistant+Staphylococcus+aureus+and+methicillin-resistant+coagulase-negative+staphylococci+within+one+hour+using+the+automated+GenomEra+CDXTM+PCR+system.">One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).</li><li>Swaminathan, B., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+food-borne+pathogenic+bacteria.">Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria.</a> Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).</li><li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+manipulation+of+single+microparticles,+cells,+and+organisms+using+surface+acoustic+waves.">On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).</li><li>Karthick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+impedance-based+size+independent+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+blood+using+acoustophoresis.">Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 2802 (2018).</li><li>Lenshof, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustofluidics+8:+Applications+of+acoustophoresis+in+continuous+flow+microsystems.">Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems.</a> Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).</li><li>Persson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+microfluidic+chip+technology+to+facilitate+automation+of+phage+display+selection.">Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection.</a> The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).</li><li>Klussmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications. , (2006).</li><li>Ellington, A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li><li>Namnabat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+numerical+simulation+of+acoustophoretic+motion+induced+by+boundary-driven+acoustic+streaming+in+standing+surface+acoustic+wave+microfluidics.">3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics.</a> Scientific Reports. 11 (1), 11326 (2021).</li><li>Nimjee, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+as+therapeutics.">Aptamer as therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+aptamer+discovery+and+application.">Recent advances in aptamer discovery and application.</a> Molecules. 24 (5), 941 (2019).</li><li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acousto-microfluidics+for+screening+of+ssDNA+aptamer.">Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li><li>Persson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+microfluidic+chip+technology+to+facilitate+automation+of+phage+display+selection.">Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection.</a> The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).</li><li>Van Toan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+processes+for+glass+micromachining.">An investigation of processes for glass micromachining.</a> Micromachines. 7 (3), 51 (2016).</li><li>Jansen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+on+the+reactive+ion+etching+of+silicon+in+microtechnology.">A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14 (1996).</li><li>Hanneborg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon-to-silicon+anodic+bonding+with+a+borosilicate+glass+layer.">Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139 (1991).</li><li>Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+scalable+blood+filtration+device+using+inertial+microfluidics.">Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics.</a> Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+filter+microchip+for+rapid+separation+of+plasma+and+viruses+from+whole+blood.">Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).</li><li>Ai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+Escherichia+coli+bacteria+from+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+standing+surface+acoustic+waves.">Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves.</a> Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).</li><li>Ohlsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+impedance+matched+buffers+enable+separation+of+bacteria+from+blood+cells+at+high+cell+concentrations.">Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+dielectrophoretic+bacterial+separation+and+concentration+from+physiological+media+of+high+conductivity.">Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity.</a> Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).</li><li>Kim, U., Soh, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+sorting+of+multiple+bacterial+targets+using+integrated+Dielectrophoretic-Magnetic+Activated+Cell+Sorter.">Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter.</a> Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).</li><li>Cai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluidic+device+for+immunomagnetic+separation+of+foodborne+bacteria+using+self-assembled+magnetic+nanoparticle+chains.">A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains.</a> Micromachines. 9 (12), 624 (2018).</li></ol>

हमने अपने आकार और प्रकार के अनुसार निरंतर चलने वाली विधि के आधार पर उच्च गति पर संस्कृति के नमूनों से जीएन बैक्टीरिया को कैप्चर करने और स्थानांतरित करने के लिए एक ध्वनि उत्तोलन माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइ?...

ढांकता हुआ हस्तांतरण, मैग्नेटोफोरेसिस, मनका निष्कर्षण, फ़िल्टरिंग, केन्द्रापसारक माइक्रोफ्लुइडिक्स और जड़त्वीय प्रभाव, और सतह ध्वनिक तरंगों 1,2 पर आधारित तरीकों के अलावा, चिकित्सा और पर्यावरणीय नमूनों से बैक्टीरिया को अलग करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिकप्लेटफार्मों को विकसित किया जा रहा है। रोगजनक बैक्टीरिया का पता लगाना पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग करके जारी रखा जाता है, लेकिन यह आमतौर पर श्रमसाध्य, जटिल और समय लेने वाला 3,4 होता है। माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस सिस्टम उचित थ्रूपुट और गैर-संपर्क सेल अलगाव 5,6,7 के माध्यम से इसे संबोधित करने का एक विकल्प है। ध्वनिकोफोरेसिस एक ऐसी तकनीक है जो ध्वनि तरंग के माध्यम से सामग्री आंदोलन की घटना का उपयोग करके मोतियों को अलग या केंद्रित करती है। जब ध्वनि तरंगें माइक्रोचैनल में प्रवेश करती हैं, तो उन्हें मोतियों के आकार, घनत्व आदि के अनुसार क्रमबद्ध किया जाता है, और कोशिकाओं को निलंबन माध्यम 7,8 के जैव रासायनिक और विद्युत गुणों के अनुसार अलग किया जा सकता है। तदनुसार, कई ध्वनिक अध्ययनों को सक्रिय रूप से 9,10,11 का पीछा किया गया है, और हाल ही में, खड़े सतह ध्वनिक तरंग माइक्रोफ्लुइडिक्स में सीमा-चालित ध्वनिक स्ट्रीमिंग द्वारा प्रेरित ध्वनिक गति के 3 डी संख्यात्मक सिमुलेशन पेश किए गए हैं।
विभिन्न क्षेत्रों में अध्ययन एंटीबॉडी 2,3 को बदलने के तरीके की जांच कर रहे हैं। एप्टामर एक लक्ष्य सामग्री है जिसमें उच्च चयनात्मकता और विशिष्टता है, और कई अध्ययन 2,9,10,13 आयोजित किए जा रहे हैं। एप्टामर्स में एंटीबॉडी की तुलना में छोटे आकार, उत्कृष्ट जैविक स्थिरता, कम लागत और उच्च प्रजनन क्षमता के फायदे हैं और नैदानिक और चिकित्सीय अनुप्रयोगों 2,3,14 में अध्ययन किया जा रहा है।
यहां, यह लेख एक माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस प्रौद्योगिकी प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जिसका उपयोग एप्टामर-संशोधित माइक्रोबीड्स का उपयोग करके माध्यम से ग्राम-नकारात्मक (जीएन) बैक्टीरिया के तेजी से, कुशल पृथक्करण के लिए किया जा सकता है। यह प्रणाली एकल पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएशन के माध्यम से एक द्वि-आयामी (2 डी) ध्वनिक स्थायी तरंग उत्पन्न करती है, साथ ही एक लंबे आयताकार माइक्रोचैनल के भीतर दो ऑर्थोगोनल अनुनादों को उत्तेजित करके नोड पर एप्टामर-संलग्न माइक्रोबीड्स को संरेखित और फोकस करने के लिए और पृथक्करण दक्षता 2,11,15,16 के लिए एंटी-नोड बिंदुओं को उत्तेजित करती है . इनलेट और आउटलेट दोनों पर एक विभाजित चैनल है, जो एक साथ पृथक्करण, शुद्धिकरण और एकाग्रता को सक्षम करता है।
यह प्रोटोकॉल बैक्टीरिया संक्रामक रोगों के प्रारंभिक निदान के क्षेत्र में सहायक हो सकता है, साथ ही वास्तविक समय के पानी की निगरानी के माध्यम से रोगजनक जीवाणु संक्रमण के लिए तेजी से, चयनात्मक और संवेदनशील प्रतिक्रिया भी हो सकती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#181;m polystyrene microbeads</td>
			<td>Bang Laboratories</td>
			<td>PS04001</td>
			<td>Cell size beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;m Streptavidin-coated microbeads</td>
			<td>Bang Laboratories</td>
			<td>CP01007</td>
			<td>Aptamer affinity beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold</td>
			<td>4science</td>
			<td>29-03573-01</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aptamer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>GN3-6&#39;</td>
			<td>RNA for bacteria conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass</td>
			<td>Schott</td>
			<td>BOROFLOAT 33</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Daihan</td>
			<td>CF-10</td>
			<td>Wasing particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>3M</td>
			<td>AD100</td>
			<td>Attach PZT to microchip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>KCTC</td>
			<td>KCTC2571</td>
			<td>Target bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Functional generator</td>
			<td>GW Instek</td>
			<td>AFG-2225</td>
			<td>Generate frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed camera</td>
			<td>Photron</td>
			<td>FASTCAM Mini</td>
			<td>Observation of separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>As one</td>
			<td>HI-1000</td>
			<td>Heating plate for curing of liquid PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe</td>
			<td>Koreavaccine</td>
			<td>22G-10ML</td>
			<td>Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid polydimethylsiloxane, PDMS</td>
			<td>Dow Corning Inc.</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>Cell culture (Luria-Bertani medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus Corp.</td>
			<td>IX-81</td>
			<td>Observation of separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Capricorn scientific</td>
			<td>PBS-1A</td>
			<td>Wasing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK Tubes</td>
			<td>Saint-Gobain Ppl Corp.</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>Inject or collect particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric transducer</td>
			<td>Fuji Ceramics</td>
			<td>C-213</td>
			<td>Generate specific wave in channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power amplifier</td>
			<td>Amplifier Research</td>
			<td>75A250A</td>
			<td>Amplify frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure controller/&#956;flucon</td>
			<td>AMED</td>
			<td>AMED-&#956;flucon</td>
			<td>Control of air pressure/flow controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl buffer</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>15567027</td>
			<td>Wasing particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>SeouLin Bioscience</td>
			<td>SLRM-3</td>
			<td>Modifiying aptamer and bead</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic acoustophoresis for flowthrough separation of gram-negative bacteria using aptamer affinity beads

यह लेख माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस तकनीक और एप्टामर-संशोधित माइक्रोबीड्स का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोरेटिक चिप्स के निर्माण और संचालन का वर्णन करता है जिसका उपयोग माध्यम से ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के तेज, कुशल अलगाव के लिए किया जा सकता है। यह विधि लंबे, चौकोर माइक्रोचैनलों के मिश्रण का उपयोग करके पृथक्करण दक्षता को बढ़ाती है। इस प्रणाली में, नमूना और बफर को प्रवाह नियंत्रक के माध्यम से इनलेट पोर्ट में इंजेक्ट किया जाता है। मनका केंद्रित और नमूना पृथक्करण के लिए, एसी पावर माइक्रोचैनल में ध्वनिक विकिरण बल उत्पन्न करने के लिए पावर एम्पलीफायर के साथ एक फ़ंक्शन जनरेटर के माध्यम से पीजोइलेक्ट्रिक ट्रांसड्यूसर पर लागू होता है। इनलेट और आउटलेट दोनों पर एक विभाजित चैनल है, जो एक साथ पृथक्करण, शुद्धिकरण और एकाग्रता को सक्षम करता है। डिवाइस में >98% की रिकवरी दर और 10x खुराक एकाग्रता तक 97.8% की शुद्धता है। इस अध्ययन ने बैक्टीरिया को अलग करने के लिए मौजूदा तरीकों की तुलना में अधिक वसूली दर और शुद्धता का प्रदर्शन किया है, यह सुझाव देते हुए कि डिवाइस बैक्टीरिया को कुशलतापूर्वक अलग कर सकता है।

चित्रा 5 पीजेडटी वोल्टेज (ऑफ, 0.1 वी, 0.5 वी, 5 वी) के एक समारोह के रूप में मनका प्रवाह की छवि दिखाता है। इस अध्ययन में पेश किए गए ध्वनिक चिप के मामले में, यह पुष्टि की गई थी कि जैसे-जैसे पीजेडटी का वोल्ट...

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Microfluidic Acoustophoresis for Flowthrough Separation of Gram-Negative Bacteria using Aptamer Affinity Beads

यह पत्र माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस तकनीक और एप्टामर-संशोधित माइक्रोबीड्स का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोरेटिक चिप्स के निर्माण और संचालन का वर्णन करता है जिसका उपयोग माध्यम से ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के तेज, कुशल अलगाव के लिए किया जा सकता है।

एप्टामर आत्मीयता मोतियों का उपयोग करके ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के पृथक्करण के माध्यम से प्रवाह के लिए माइक्रोफ्लुइडिक एकोस्टोफोरेसिस

This article describes the fabrication and operation of microfluidic acoustophoretic chips using a microfluidic acoustophoresis technique and ...

यह प्रोटोकॉल हमारे माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस तकनीक का वर्णन करता है जिसका उपयोग एप्टामर-संशोधित सूक्ष्म मोतियों का उपयोग करके माध्यम से ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के तेजी से, कुशल पृथक्करण के लिए किया जा सकता है। माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस सिस्टम ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया को उचित थ्रूपुट और गैर-संपर्क सेल अलगाव के साथ अलग करने में सक्षम बनाता है। चिकित्सा और पर्यावरणीय नमूनों से बैक्टीरिया को अलग करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस को अनुकूलित किया जा सकता है।शुरू करने के लिए, एक माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस चिप डिज़ाइन करें जो लक्ष्य आउटलेट पर पीएस मोती एकत्र करता है और नमूना इनलेट में पीएस नमूना मिश्रण को इंजेक्ट करने के बाद बाकी को त्याग देता है। बोरोसिलिकेट ग्लास से बंधे सिलिकॉन परत के ऊपर और नीचे की परतों के साथ एक चिप तैयार करें। और एक तीसरी बोरोसिलिकेट ग्लास परत, एनोडाइजेशन का उपयोग करके, 1000 वोल्ट और 400 डिग्री सेल्सियस जोड़ती है।साइनोएक्रिलेट चिपकने वाले के 10 से कम माइक्रोलीटर का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के साथ बोरोसिलिकेट ग्लास परत में एक पीजेडटी संलग्न करें। लुरिया-बर्टानी माध्यम में जीएन और जीपी बैक्टीरिया को टीका लगाएं और इसे 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 220 क्रांति प्रति मिनट पर सेते हैं। कमरे के तापमान पर एक मिनट के लिए 9, 056 आरसीएफ पर सुसंस्कृत बैक्टीरिया को अपकेंद्रित्र करें।फिर 1 एक्स पीबीएस बफर के साथ दो बार धो लें। बाध्यकारी बफर में उन्हें फिर से निलंबित करके विश्लेषण के लिए चयनित जीएन और जीपी बैक्टीरिया तैयार करें। उपयोग करने से पहले 10 माइक्रोमीटर स्ट्रेप्टाविडिन लेपित सूक्ष्म मनका मिश्रण को फिर से निलंबित करें।मिश्रण को 20 सेकंड के लिए भंवर करें। एप्टामर को तीन मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृत करके तैयार करें, और फिर इसे दो मिनट के लिए शून्य डिग्री सेल्सियस पर फिर से मोड़ें। पुन: निलंबित स्ट्रेप्टाविडिन लेपित सूक्ष्म मनका मिश्रण के 250 माइक्रोलीटर को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्यूब में बायोटिनिलेटेड डीएनए एप्टामर के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।प्रति मिनट 25 क्रांतियों पर घूर्णन करते समय 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण सेते हैं। कमरे के तापमान पर 40 सेकंड के लिए 9, 056 आरसीएफ पर प्रतिक्रिया मिश्रण अपकेंद्रित्र। फिर ट्रिस-एचसीएल बफर के 200 माइक्रोलीटर के साथ ट्यूब को दो बार धो लें।धोया नमूना ट्यूब के लिए 100 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर बीएसए के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें और प्रति मिनट 25 क्रांतियों पर घूर्णन करते समय कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। अंत में, एप्टामर संशोधित सूक्ष्म मोतियों को कमरे के तापमान पर 40 सेकंड के लिए 9, 056 आरसीएफ पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा ट्रिस-एचसीएल बफर में दो बार धो लें। दो नमूने और बफर इंजेक्शन के लिए दो इनलेट के लिए पीक ट्यूबों को कनेक्ट करें, और कचरे को इकट्ठा करने और निर्वहन करने के लिए दो आउटलेट।10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके, माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस चैनल को बुलबुला मुक्त डिमिनरलाइज्ड पानी से भरें। द्रव प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए दो या दो से अधिक आउटपुट चैनलों के साथ एक सटीक दबाव नियंत्रक तैयार करें। डिवाइस तैयार करने के बाद, सटीक दबाव नियंत्रण डिवाइस का उपयोग करके नमूना इनलेट में दो किलोपास्कल और बफर इनलेट में चार किलोपास्कल का दबाव लागू करके नमूना और बफर इंजेक्ट करें।माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, एक मनका पर ध्यान केंद्रित करें और इसे पीजेडटी का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के केंद्र में ले जाएं। एक एकल चैनल फ़ंक्शन जनरेटर का उपयोग करके 3.66 मेगाहर्ट्ज की अनुनाद आवृत्ति उत्पन्न करें और पावर एम्पलीफायर का उपयोग करके 16 डेसिबल द्वारा एक विशिष्ट सिग्नल को बढ़ाएं। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और 1, 200 फ्रेम प्रति सेकंड पर काम कर रहे एक उच्च गति कैमरे के साथ ध्वनिक चिप पर पृथक्करण और संवर्धन प्रक्रियाओं का निरीक्षण करें।इस अध्ययन में पेश किए गए ध्वनिक चिप ने पुष्टि की कि, जैसे-जैसे पीजेडटी का वोल्टेज बढ़ता गया, 10 माइक्रोमीटर आकार के मोतियों की केंद्रीय एकाग्रता में वृद्धि हुई। पीजेडटी वोल्टेज के पांच वोल्ट पर, 10 माइक्रोमीटर आकार के अधिकांश मोती केंद्र में केंद्रित थे। आउटलेट पर एकत्र किए गए मोतियों की संख्या का अनुपात इंजेक्शन 10 माइक्रोमीटर आकार के मोतियों की कुल संख्या के लिए वसूली दर के रूप में जाना जाता था।एकत्र किए गए मोतियों की कुल संख्या के लिए 10 माइक्रोमीटर आकार के मोतियों की संख्या के अनुपात को शुद्धता के रूप में संदर्भित किया गया था। परिणामों ने संकेत दिया कि डिवाइस में 10 माइक्रोमीटर के आकार के साथ मोतियों के लिए एक उच्च पृथक्करण दक्षता थी। प्रत्येक एप्टामर संशोधित माइक्रो बीड से बंधे जीएन और जीपी बैक्टीरिया की संख्या को उच्च गति वाले कैमरे के साथ माइक्रोस्कोप का उपयोग करके मापा गया था।सभी पांच जीएन बैक्टीरिया मोतियों से बंधे थे जबकि काफी कम जीपी बैक्टीरिया परीक्षण किए गए पदार्थों से बंधे थे। सिग्नल की ताकत जीएन और जीपी बैक्टीरिया के बीच काफी भिन्न थी। पीजेडटी को संलग्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले चिपकने वाले का उपयोग नालीदार की सटीकता के लिए जितना संभव हो उतना कम किया जाना चाहिए और पीजेडटी और माइक्रोचैनल समानांतर होना चाहिए।इस उपकरण का उपयोग जीवाणु संक्रामक रोगों के प्रारंभिक निदान की अवधि में जीवित बैक्टीरिया या बैक्टीरिया व्युत्पन्न बायोमार्कर का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Engineering

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Spatial Separation of Molecular Conformers and Clusters

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Here, we demonstrate a simple method for the rapid production of size-controllable, monodisperse, W/O microdroplets using a capillary-based centrifugal ...

Solvent Bonding for Fabrication of PMMA and COP Microfluidic Devices

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A Pipette-Tip Based Method for Seeding Cells to Droplet Microfluidic Platforms

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Amongst various microfluidic platform designs frequently used for cellular analysis, droplet-microfluidics provides a robust tool for isolating and ...