Name: microfluidic acoustophoresis for flowthrough separation of gram-negative bacteria using aptamer affinity beads
Uploaded: 2022-10-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Acoustophoresis for Flowthrough Separation of Gram-Negative Bacteria using Aptamer Affinity Beads at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (Ministero della Scienza e delle TIC). (No. NRF-2021R1A2C1011380)

1. Progettazione di chip di acoustophoresis microfluidica
NOTA: La Figura 1 mostra uno schema della separazione e della raccolta delle microsfere target dai microcanali mediante acustoforesi. Il chip di acoustophoresis microfluidica è progettato con un programma CAD.
<ol><li>Progettare un chip di acoustophoresis microfluidica che utilizza una miscela di perle modificate con aptamero e perle di polistirene (PS) rivestite di streptavidina corrisp...

<ol>
	<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustofluidic+separation+of+cells+and+particles.">Acoustofluidic separation of cells and particles.</a> Microsystem &amp; Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).</li><li>Lee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+affinity-bead+mediated+capture+and+displacement+of+Gram-negative+bacteria+using+acoustophoresis.">Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis.</a> Micromachines. 10 (11), 770 (2019).</li><li>Hirvonen, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+numerical+simulation+of+acoustophoretic+motion+induced+by+boundary-driven+acoustic+streaming+in+standing+surface+acoustic+wave+microfluidics.">3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics.</a> Scientific Reports. 11 (1), 11326 (2021).</li><li>Nimjee, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+as+therapeutics.">Aptamer as therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+aptamer+discovery+and+application.">Recent advances in aptamer discovery and application.</a> Molecules. 24 (5), 941 (2019).</li><li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acousto-microfluidics+for+screening+of+ssDNA+aptamer.">Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li><li>Persson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+microfluidic+chip+technology+to+facilitate+automation+of+phage+display+selection.">Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection.</a> The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).</li><li>Van Toan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+processes+for+glass+micromachining.">An investigation of processes for glass micromachining.</a> Micromachines. 7 (3), 51 (2016).</li><li>Jansen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+on+the+reactive+ion+etching+of+silicon+in+microtechnology.">A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14 (1996).</li><li>Hanneborg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon-to-silicon+anodic+bonding+with+a+borosilicate+glass+layer.">Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139 (1991).</li><li>Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+scalable+blood+filtration+device+using+inertial+microfluidics.">Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics.</a> Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+filter+microchip+for+rapid+separation+of+plasma+and+viruses+from+whole+blood.">Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).</li><li>Ai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+Escherichia+coli+bacteria+from+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+standing+surface+acoustic+waves.">Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves.</a> Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).</li><li>Ohlsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+impedance+matched+buffers+enable+separation+of+bacteria+from+blood+cells+at+high+cell+concentrations.">Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+dielectrophoretic+bacterial+separation+and+concentration+from+physiological+media+of+high+conductivity.">Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity.</a> Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).</li><li>Kim, U., Soh, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+sorting+of+multiple+bacterial+targets+using+integrated+Dielectrophoretic-Magnetic+Activated+Cell+Sorter.">Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter.</a> Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).</li><li>Cai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluidic+device+for+immunomagnetic+separation+of+foodborne+bacteria+using+self-assembled+magnetic+nanoparticle+chains.">A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains.</a> Micromachines. 9 (12), 624 (2018).</li></ol>

Abbiamo sviluppato un dispositivo microfluidico a levitazione sonica per catturare e trasferire i batteri GN da campioni di coltura ad alta velocità basato su un metodo di funzionamento continuo in base alle loro dimensioni e tipo e microsfere modificate con aptamero. Il microcanale lungo e quadrato consente una progettazione più semplice e una maggiore efficienza in termini di costi per l'acoustophoresis 2D rispetto a 20,21,22,23,24,25,26 precedentemente riportati.<...

Sono in fase di sviluppo piattaforme microfluidiche per isolare batteri da campioni medici e ambientali, oltre a metodi basati su trasferimento dielettrico, magnetoforesi, estrazione di perline, filtraggio, microfluidica centrifuga ed effetti inerziali e onde acustiche superficiali 1,2. La rilevazione di batteri patogeni viene continuata utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR), ma di solito è laboriosa, complessa e richiede tempo 3,4. I sistemi di acoustophoresis microfluidica sono un'alternativa per affrontare questo problema attraverso una produttività ragionevole e l'isolamento cellulare senza contatto 5,6,7. L'acoustophoresis è una tecnologia che separa o concentra le perle utilizzando il fenomeno del movimento del materiale attraverso un'onda sonora. Quando le onde sonore entrano nel microcanale, vengono ordinate in base alle dimensioni, alla densità, ecc. delle perle e le cellule possono essere separate in base alle proprietà biochimiche ed elettriche del mezzo di sospensione 7,8. Di conseguenza, molti studi acustoforetici sono stati attivamente perseguiti 9,10,11, e recentemente sono state introdotte simulazioni numeriche 3D del moto acustoforetico indotto dal flusso acustico guidato dal confine nella microfluidica delle onde acustiche della superficie stazionaria12.
Studi in vari campi stanno esaminando come sostituire gli anticorpi 2,3. L'aptamero è un materiale bersaglio con elevata selettività e specificità e molti studi sono in corso 2,9,10,13. Gli aptameri hanno vantaggi di piccole dimensioni, eccellente stabilità biologica, basso costo e alta riproducibilità rispetto agli anticorpi e sono in fase di studio in applicazioni diagnostiche e terapeutiche 2,3,14.
Qui, questo articolo descrive un protocollo tecnologico di acoustophoresis microfluidica che può essere utilizzato per la separazione rapida ed efficiente dei batteri Gram-negativi (GN) da un mezzo utilizzando microsfere modificate con aptamero. Questo sistema genera un'onda stazionaria acustica bidimensionale (2D) attraverso una singola attuazione piezoelettrica stimolando simultaneamente due risonanze ortogonali all'interno di un lungo microcanale rettangolare per allineare e focalizzare le microsfere attaccate all'aptamero nei punti del nodo e dell'antinodo per l'efficienza di separazione 2,11,15,16 . C'è un canale biforcato sia all'ingresso che all'uscita, consentendo la separazione, la purificazione e la concentrazione simultanee.
Questo protocollo può essere utile nel campo della diagnosi precoce delle malattie infettive batteriche, nonché una risposta rapida, selettiva e sensibile alle infezioni batteriche patogene attraverso il monitoraggio dell'acqua in tempo reale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#181;m polystyrene microbeads</td>
			<td>Bang Laboratories</td>
			<td>PS04001</td>
			<td>Cell size beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;m Streptavidin-coated microbeads</td>
			<td>Bang Laboratories</td>
			<td>CP01007</td>
			<td>Aptamer affinity beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold</td>
			<td>4science</td>
			<td>29-03573-01</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aptamer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>GN3-6&#39;</td>
			<td>RNA for bacteria conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass</td>
			<td>Schott</td>
			<td>BOROFLOAT 33</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Daihan</td>
			<td>CF-10</td>
			<td>Wasing particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>3M</td>
			<td>AD100</td>
			<td>Attach PZT to microchip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>KCTC</td>
			<td>KCTC2571</td>
			<td>Target bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Functional generator</td>
			<td>GW Instek</td>
			<td>AFG-2225</td>
			<td>Generate frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed camera</td>
			<td>Photron</td>
			<td>FASTCAM Mini</td>
			<td>Observation of separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>As one</td>
			<td>HI-1000</td>
			<td>Heating plate for curing of liquid PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe</td>
			<td>Koreavaccine</td>
			<td>22G-10ML</td>
			<td>Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid polydimethylsiloxane, PDMS</td>
			<td>Dow Corning Inc.</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>Cell culture (Luria-Bertani medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus Corp.</td>
			<td>IX-81</td>
			<td>Observation of separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Capricorn scientific</td>
			<td>PBS-1A</td>
			<td>Wasing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK Tubes</td>
			<td>Saint-Gobain Ppl Corp.</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>Inject or collect particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric transducer</td>
			<td>Fuji Ceramics</td>
			<td>C-213</td>
			<td>Generate specific wave in channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power amplifier</td>
			<td>Amplifier Research</td>
			<td>75A250A</td>
			<td>Amplify frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure controller/&#956;flucon</td>
			<td>AMED</td>
			<td>AMED-&#956;flucon</td>
			<td>Control of air pressure/flow controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl buffer</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>15567027</td>
			<td>Wasing particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>SeouLin Bioscience</td>
			<td>SLRM-3</td>
			<td>Modifiying aptamer and bead</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic acoustophoresis for flowthrough separation of gram-negative bacteria using aptamer affinity beads

Questo articolo descrive la fabbricazione e il funzionamento di chip acustoforetici microfluidici utilizzando una tecnica di acoustophoresis microfluidica e microsfere modificate con aptamero che possono essere utilizzate per l'isolamento rapido ed efficiente di batteri Gram-negativi da un mezzo. Questo metodo migliora l'efficienza di separazione utilizzando un mix di microcanali lunghi e quadrati. In questo sistema, il campione e il buffer vengono iniettati nella porta di ingresso attraverso un regolatore di flusso. Per il centraggio delle sfere e la separazione del campione, l'alimentazione CA viene applicata al trasduttore piezoelettrico tramite un generatore di funzioni con un amplificatore di potenza per generare forza di radiazione acustica nel microcanale. C'è un canale biforcato sia all'ingresso che all'uscita, consentendo la separazione, la purificazione e la concentrazione simultanee. Il dispositivo ha un tasso di recupero del >98% e una purezza del 97,8% fino a una concentrazione di dose 10x. Questo studio ha dimostrato un tasso di recupero e una purezza superiori ai metodi esistenti per separare i batteri, suggerendo che il dispositivo può separare i batteri in modo efficiente.

La figura 5 mostra l'immagine del flusso del tallone in funzione della tensione PZT (OFF, 0,1 V, 0,5 V, 5 V). Nel caso del chip acustoforetico introdotto in questo studio, è stato confermato che all'aumentare della tensione del PZT, la concentrazione centrale delle perle di dimensioni 10 μm è aumentata. La maggior parte delle perle di dimensioni 10 μm erano concentrate al centro a 5 V della tensione PZT. Attraverso questo risultato, è stata generata una frequenza di risonanza di 3,66 MH...

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Microfluidic Acoustophoresis for Flowthrough Separation of Gram-Negative Bacteria using Aptamer Affinity Beads

Questo articolo descrive la fabbricazione e il funzionamento di chip acustoforetici microfluidici utilizzando la tecnica dell'acoustophoresis microfluidica e microsfere modificate con aptamero che possono essere utilizzate per un isolamento rapido ed efficiente di batteri Gram-negativi da un mezzo.

Auustofori microfluidica per la separazione flowthrough di batteri Gram-negativi utilizzando perline di affinità aptamero

This article describes the fabrication and operation of microfluidic acoustophoretic chips using a microfluidic acoustophoresis technique and ...

Questo protocollo descrive la nostra tecnologia di acoustophoresis microfluidica che può essere utilizzata per la separazione rapida ed efficiente dei batteri Gram-negativi da un mezzo utilizzando micro sfere modificate con aptamero. I sistemi di acoustophoresis microfluidica consentono la separazione dei batteri Gram-negativi con un throughput ragionevole e l'isolamento cellulare senza contatto. L'acoustophoresis microfluidica può essere ottimizzata per isolare i batteri da campioni medici e ambientali.Per iniziare, progettare un chip di acoustophoresis microfluidica che raccoglie le sfere di PS all'uscita di destinazione e scarta il resto dopo aver iniettato una miscela di campioni PS nell'ingresso del campione. Preparare un chip con gli strati sopra e sotto lo strato di silicio legato al vetro borosilicato. E un terzo strato di vetro borosilicato, usando l'anodizzazione, aggiunge 1000 volt e 400 gradi Celsius.Attaccare un PZT allo strato di vetro borosilicato lungo il canale microfluidico utilizzando meno di 10 microlitri di adesivo cianoacrilato. Inoculare i batteri GN e GP nel mezzo Luria-Bertani e incubarlo a 37 gradi Celsius e 220 giri al minuto per 16 ore. Centrifugare i batteri coltivati a 9, 056 RCF per un minuto a temperatura ambiente.Quindi lavare due volte con tampone PBS 1X. Preparare i batteri GN e GP selezionati per l'analisi risospendendoli nel tampone di legame. Risospendere la miscela di microsfere rivestita di streptavidina da 10 micrometri prima dell'uso.Vortice la miscela per 20 secondi. Preparare l'aptamero denaturandolo a 95 gradi Celsius per tre minuti, quindi ripiegandolo a zero gradi Celsius per due minuti. Trasferire 250 microlitri della miscela di microsfere rivestita di streptavidina ricoperta in un tubo da 1,5 millilitri e aggiungere 100 microlitri di aptamero di DNA biotinilato al tubo.Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti ruotando a 25 giri al minuto. Centrifugare la miscela di reazione a 9, 056 RCF per 40 secondi a temperatura ambiente. Quindi lavare il tubo due volte con 200 microlitri di tampone Tris-HCl.Aggiungere 10 microlitri di 100 milligrammi per millilitro di BSA alla provetta lavata e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente ruotando a 25 giri al minuto. Infine, lavare due volte le microsfere modificate aptamero nel tampone Tris-HCl mediante centrifugazione a 9.056 RCF per 40 secondi a temperatura ambiente. Collegare i tubi PEEK ai due ingressi per iniettare due campioni e tampone e le due uscite per la raccolta e lo scarico dei rifiuti.Utilizzando una siringa da 10 millilitri, riempire il canale di acoustophoresis microfluidica con acqua demineralizzata senza bolle. Preparare un regolatore di pressione di precisione con due o più canali di uscita per controllare il flusso del fluido. Dopo aver preparato il dispositivo, iniettare il campione e il tampone applicando una pressione di due kilopascal all'ingresso del campione e quattro kilopascal all'ingresso del tampone utilizzando il dispositivo di controllo della pressione di precisione.Utilizzando un microscopio, concentrarsi su una perlina e spostarla al centro del canale microfluidico utilizzando il PZT. Generare una frequenza di risonanza di 3,66 megahertz utilizzando un generatore di funzioni a canale singolo e amplificare un segnale tipico di 16 decibel utilizzando un amplificatore di potenza. Osservare i processi di separazione e arricchimento sul chip acustofluidico con un microscopio a fluorescenza e una telecamera ad alta velocità funzionante a 1.200 fotogrammi al secondo.Il chip acustoforetico introdotto in questo studio ha confermato che, all'aumentare della tensione del PZT, la concentrazione centrale delle perle di dimensioni 10 micrometriche è aumentata. A cinque volt della tensione PZT, la maggior parte delle perle di dimensioni di 10 micrometri erano concentrate al centro. Il rapporto tra il numero di perle raccolte all'uscita e il numero totale di perle iniettate di dimensioni di 10 micrometri è stato indicato come tasso di recupero.Il rapporto tra il numero di perle di dimensioni di 10 micrometri e il numero totale di perle raccolte è stato indicato come purezza. I risultati hanno indicato che il dispositivo aveva un'elevata efficienza di separazione per perline con una dimensione di 10 micrometri. Il numero di batteri GN e GP legati a ciascun micro tallone modificato aptamero è stato misurato utilizzando un microscopio con una telecamera ad alta velocità.Tutti e cinque i batteri GN erano legati alle perle mentre significativamente meno batteri GP erano legati alle sostanze testate. La potenza del segnale differiva significativamente tra i batteri GN e GP. L'adesivo utilizzato per fissare il PZT deve essere usato il meno possibile per la precisione dell'ondulazione e il PZT e il microcanale devono essere paralleli.Questo dispositivo può essere utilizzato per rilevare batteri vivi o biomarcatori derivati da batteri nel periodo di diagnosi precoce delle malattie infettive batteriche.

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Engineering

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