Name: microfluidic acoustophoresis for flowthrough separation of gram-negative bacteria using aptamer affinity beads
Uploaded: 2022-10-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Acoustophoresis for Flowthrough Separation of Gram-Negative Bacteria using Aptamer Affinity Beads at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno coreano (Ministerio de Ciencia y TIC). (No. NRF-2021R1A2C1011380)

1. Diseño del chip de acustoforesis microfluídica
NOTA: La Figura 1 muestra un esquema de la separación y recolección de microperlas diana de microcanales por acustoforesis. El chip de acustoforesis microfluídica está diseñado con un programa CAD.
<ol><li>Diseñe un chip de acustoforesis microfluídica que utilice una mezcla de perlas modificadas con aptámero y perlas de poliestireno (PS) recubiertas de estreptavidina correspondientes al...

<ol>
	<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustofluidic+separation+of+cells+and+particles.">Acoustofluidic separation of cells and particles.</a> Microsystem &amp; Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).</li><li>Lee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+affinity-bead+mediated+capture+and+displacement+of+Gram-negative+bacteria+using+acoustophoresis.">Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis.</a> Micromachines. 10 (11), 770 (2019).</li><li>Hirvonen, J. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li><li>Namnabat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+numerical+simulation+of+acoustophoretic+motion+induced+by+boundary-driven+acoustic+streaming+in+standing+surface+acoustic+wave+microfluidics.">3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics.</a> Scientific Reports. 11 (1), 11326 (2021).</li><li>Nimjee, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+as+therapeutics.">Aptamer as therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+aptamer+discovery+and+application.">Recent advances in aptamer discovery and application.</a> Molecules. 24 (5), 941 (2019).</li><li>Park, J. 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J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+scalable+blood+filtration+device+using+inertial+microfluidics.">Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics.</a> Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+filter+microchip+for+rapid+separation+of+plasma+and+viruses+from+whole+blood.">Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).</li><li>Ai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+Escherichia+coli+bacteria+from+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+standing+surface+acoustic+waves.">Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves.</a> Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).</li><li>Ohlsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+impedance+matched+buffers+enable+separation+of+bacteria+from+blood+cells+at+high+cell+concentrations.">Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+dielectrophoretic+bacterial+separation+and+concentration+from+physiological+media+of+high+conductivity.">Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity.</a> Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).</li><li>Kim, U., Soh, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+sorting+of+multiple+bacterial+targets+using+integrated+Dielectrophoretic-Magnetic+Activated+Cell+Sorter.">Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter.</a> Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).</li><li>Cai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluidic+device+for+immunomagnetic+separation+of+foodborne+bacteria+using+self-assembled+magnetic+nanoparticle+chains.">A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains.</a> Micromachines. 9 (12), 624 (2018).</li></ol>

Desarrollamos un dispositivo microfluídico de levitación sónica para capturar y transferir bacterias GN de muestras de cultivo a alta velocidad basado en un método de funcionamiento continuo según su tamaño y tipo, y microperlas modificadas con aptámero. El microcanal largo y cuadrado permite un diseño más simple y una mayor rentabilidad para la acustoforesis 2D que la reportada anteriormente 20,21,22,23,24,25,26.<...

Se están desarrollando plataformas microfluídicas para aislar bacterias de muestras médicas y ambientales, además de métodos basados en transferencia dieléctrica, magnetoforesis, extracción de perlas, filtrado, microfluídica centrífuga y efectos inerciales, y ondas acústicas superficiales 1,2. La detección de bacterias patógenas se continúa mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), pero suele ser laboriosa, compleja ylenta 3,4. Los sistemas de acustoforesis microfluídica son una alternativa para abordar esto a través de un rendimiento razonable y aislamiento celular sin contacto 5,6,7. La acustoforesis es una tecnología que separa o concentra cuentas utilizando el fenómeno del movimiento del material a través de una onda sonora. Cuando las ondas sonoras entran en el microcanal, se clasifican según el tamaño, la densidad, etc., de las perlas, y las células se pueden separar de acuerdo con las propiedades bioquímicas y eléctricas del medio de suspensión 7,8. En consecuencia, se han realizado activamente muchos estudios acustoforéticos 9,10,11, y recientemente, se han introducido simulaciones numéricas 3D del movimiento acustoforético inducido por la corriente acústica impulsada por límites en microfluídica de onda acústica de superficie estacionaria 12.
Estudios en diversos campos están examinando cómo reemplazar los anticuerpos 2,3. El aptámero es un material diana de alta selectividad y especificidad, y se están realizando muchos estudios 2,9,10,13. Los aptámeros tienen ventajas de pequeño tamaño, excelente estabilidad biológica, bajo costo y alta reproducibilidad en comparación con los anticuerpos y están siendo estudiados en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas 2,3,14.
Aquí, este artículo describe un protocolo de tecnología de acustoforesis microfluídica que se puede utilizar para la separación rápida y eficiente de bacterias Gram-negativas (GN) de un medio utilizando microperlas modificadas con aptámero. Este sistema genera una onda estacionaria acústica bidimensional (2D) a través de un solo accionamiento piezoeléctrico al estimular simultáneamente dos resonancias ortogonales dentro de un microcanal rectangular largo para alinear y enfocar microperlas unidas a aptámeros en los puntos nodo y antinodo para una eficiencia de separación 2,11,15,16 . Hay un canal bifurcado tanto en la entrada como en la salida, lo que permite la separación, purificación y concentración simultáneas.
Este protocolo puede ser útil en el campo del diagnóstico temprano de enfermedades infecciosas bacterianas, así como una respuesta rápida, selectiva y sensible a las infecciones bacterianas patógenas a través del monitoreo del agua en tiempo real.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#181;m polystyrene microbeads</td>
			<td>Bang Laboratories</td>
			<td>PS04001</td>
			<td>Cell size beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;m Streptavidin-coated microbeads</td>
			<td>Bang Laboratories</td>
			<td>CP01007</td>
			<td>Aptamer affinity beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold</td>
			<td>4science</td>
			<td>29-03573-01</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aptamer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>GN3-6&#39;</td>
			<td>RNA for bacteria conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass</td>
			<td>Schott</td>
			<td>BOROFLOAT 33</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Daihan</td>
			<td>CF-10</td>
			<td>Wasing particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>3M</td>
			<td>AD100</td>
			<td>Attach PZT to microchip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>KCTC</td>
			<td>KCTC2571</td>
			<td>Target bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Functional generator</td>
			<td>GW Instek</td>
			<td>AFG-2225</td>
			<td>Generate frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed camera</td>
			<td>Photron</td>
			<td>FASTCAM Mini</td>
			<td>Observation of separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>As one</td>
			<td>HI-1000</td>
			<td>Heating plate for curing of liquid PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe</td>
			<td>Koreavaccine</td>
			<td>22G-10ML</td>
			<td>Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid polydimethylsiloxane, PDMS</td>
			<td>Dow Corning Inc.</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>Cell culture (Luria-Bertani medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus Corp.</td>
			<td>IX-81</td>
			<td>Observation of separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Capricorn scientific</td>
			<td>PBS-1A</td>
			<td>Wasing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK Tubes</td>
			<td>Saint-Gobain Ppl Corp.</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>Inject or collect particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric transducer</td>
			<td>Fuji Ceramics</td>
			<td>C-213</td>
			<td>Generate specific wave in channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power amplifier</td>
			<td>Amplifier Research</td>
			<td>75A250A</td>
			<td>Amplify frequency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure controller/&#956;flucon</td>
			<td>AMED</td>
			<td>AMED-&#956;flucon</td>
			<td>Control of air pressure/flow controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl buffer</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>15567027</td>
			<td>Wasing particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>SeouLin Bioscience</td>
			<td>SLRM-3</td>
			<td>Modifiying aptamer and bead</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic acoustophoresis for flowthrough separation of gram-negative bacteria using aptamer affinity beads

Este artículo describe la fabricación y operación de chips acústoforéticos microfluídicos utilizando una técnica de acustoforesis microfluídica y microperlas modificadas con aptámero que se pueden usar para el aislamiento rápido y eficiente de bacterias Gram-negativas de un medio. Este método mejora la eficiencia de separación utilizando una mezcla de microcanales largos y cuadrados. En este sistema, la muestra y el búfer se inyectan en el puerto de entrada a través de un controlador de flujo. Para el centrado de cuentas y la separación de muestras, la alimentación de CA se aplica al transductor piezoeléctrico a través de un generador de funciones con un amplificador de potencia para generar fuerza de radiación acústica en el microcanal. Hay un canal bifurcado tanto en la entrada como en la salida, lo que permite la separación, purificación y concentración simultáneas. El dispositivo tiene una tasa de recuperación del >98% y una pureza del 97,8% hasta una concentración de dosis 10x. Este estudio ha demostrado una tasa de recuperación y pureza más alta que los métodos existentes para separar las bacterias, lo que sugiere que el dispositivo puede separar las bacterias de manera eficiente.

La Figura 5 muestra la imagen del flujo de cuentas en función del voltaje PZT (OFF, 0.1 V, 0.5 V, 5 V). En el caso del chip acústoforético introducido en este estudio, se confirmó que a medida que aumentaba el voltaje del PZT, aumentaba la concentración central de las perlas de 10 μm. La mayoría de las perlas de 10 μm se concentraron en el centro a 5 V del voltaje PZT. A través de este resultado, se generó una frecuencia resonante de 3.66 MHz en un generador de funciones de un solo...

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Microfluidic Acoustophoresis for Flowthrough Separation of Gram-Negative Bacteria using Aptamer Affinity Beads

Este documento describe la fabricación y operación de chips acústoforeticos microfluídicos utilizando la técnica de acustoforesis microfluídica y microperlas modificadas con aptámero que se pueden usar para el aislamiento rápido y eficiente de bacterias Gram-negativas de un medio.

Acustoforesis microfluídica para la separación fluvial de bacterias gramnegativas utilizando perlas de afinidad aptámero

This article describes the fabrication and operation of microfluidic acoustophoretic chips using a microfluidic acoustophoresis technique and ...

Este protocolo describe nuestra tecnología de acustoforesis microfluídica que se puede utilizar para la separación rápida y eficiente de bacterias Gram-negativas de un medio utilizando microperlas modificadas con aptámero. Los sistemas de acustoforesis microfluídica permiten la separación de bacterias gramnegativas con un rendimiento razonable y aislamiento celular sin contacto. La acustoforesis microfluídica se puede optimizar para aislar bacterias de muestras médicas y ambientales.Para comenzar, diseñe un chip de acustoforesis microfluídica que recolecte perlas de PS en la salida objetivo y descarte el resto después de inyectar una mezcla de muestra de PS en la entrada de muestra. Prepare un chip con las capas por encima y por debajo de la capa de silicio unidas al vidrio de borosilicato. Y una tercera capa de vidrio de borosilicato, usando anodización, agrega 1000 voltios y 400 grados centígrados.Fije un PZT a la capa de vidrio de borosilicato a lo largo del canal microfluídico utilizando menos de 10 microlitros de adhesivo de cianoacrilato. Inocular las bacterias GN y GP en medio Luria-Bertani e incubarlo a 37 grados centígrados y 220 revoluciones por minuto durante 16 horas. Centrifugar las bacterias cultivadas a 9, 056 RCF durante un minuto a temperatura ambiente.Luego lavar dos veces con 1X PBS buffer. Prepare las bacterias GN y GP seleccionadas para el análisis resuspendiéndolas en el tampón de unión. Vuelva a suspender la mezcla de microperlas recubierta de estreptavidina de 10 micrómetros antes de usarla.Vortex la mezcla durante 20 segundos. Prepare el aptámero desnaturalizándolo a 95 grados centígrados durante tres minutos, y luego volviéndolo a doblar a cero grados centígrados durante dos minutos. Transfiera 250 microlitros de la mezcla de microperlas recubierta de estreptavidina resuspendida a un tubo de 1.5 mililitros y agregue 100 microlitros de aptámero de ADN biotinilado al tubo.Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras gira a 25 revoluciones por minuto. Centrifugar la mezcla de reacción a 9, 056 RCF durante 40 segundos a temperatura ambiente. Luego lave el tubo dos veces con 200 microlitros de tampón Tris-HCl.Agregue 10 microlitros de 100 miligramos por mililitro BSA al tubo de muestra lavado e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente mientras gira a 25 revoluciones por minuto. Finalmente, lave las microperlas modificadas con aptámero dos veces en tampón Tris-HCl por centrifugación a 9, 056 RCF durante 40 segundos a temperatura ambiente. Conecte los tubos de PEEK a las dos entradas para inyectar dos muestras y tampón, y las dos salidas para recoger y descargar los residuos.Con una jeringa de 10 mililitros, llene el canal de acustoforesis microfluídica con agua desmineralizada sin burbujas. Prepare un controlador de presión de precisión con dos o más canales de salida para controlar el flujo de fluido. Después de preparar el dispositivo, inyecte la muestra y el tampón aplicando una presión de dos kilopascales a la entrada de la muestra y cuatro kilopascales a la entrada del tampón utilizando el dispositivo de control de presión de precisión.Usando un microscopio, enfóquese en una cuenta y muévala al centro del canal microfluídico usando el PZT. Genere una frecuencia de resonancia de 3,66 megahercios utilizando un generador de funciones de un solo canal y amplifique una señal típica en 16 decibelios utilizando un amplificador de potencia. Observe los procesos de separación y enriquecimiento en el chip acustofluídico con un microscopio de fluorescencia y una cámara de alta velocidad que funciona a 1.200 fotogramas por segundo.El chip acústoforético introducido en este estudio confirmó que, a medida que aumentaba el voltaje del PZT, aumentaba la concentración central de las perlas de 10 micrómetros. A cinco voltios del voltaje PZT, la mayoría de las perlas de 10 micrómetros se concentraron en el centro. La relación entre el número de perlas recogidas en la salida y el número total de perlas inyectadas de 10 micrómetros se denominó tasa de recuperación.La relación entre el número de cuentas de 10 micrómetros y el número total de cuentas recolectadas se denominó pureza. Los resultados indicaron que el dispositivo tenía una alta eficiencia de separación para perlas con un tamaño de 10 micrómetros. El número de bacterias GN y GP unidas a cada microperla modificada con aptámero se midió utilizando un microscopio con una cámara de alta velocidad.Las cinco bacterias GN se unieron a las perlas, mientras que significativamente menos bacterias GP se unieron a las sustancias probadas. La intensidad de la señal difirió significativamente entre las bacterias GN y GP. El adhesivo utilizado para fijar el PZT debe usarse lo menos posible para la precisión de la corrugación y el PZT y el microcanal deben ser paralelos.Este dispositivo se puede utilizar para detectar bacterias vivas o biomarcadores derivados de bacterias en el período de diagnóstico temprano de enfermedades infecciosas bacterianas.

Research

JoVE Journal

Engineering

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