Name: delivery of exogenous artificially synthesized mirna mimic to the kidney using polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models at JoVE.c

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door JSPS KAKENHI (Grant No. 21K08233). Wij danken Edanz (https://jp.edanz.com/ac) voor het redigeren van kladversies van dit manuscript.

Alle dierexperimentele protocollen werden goedgekeurd door de dierethische commissie van de Jichi Medical University en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor gebruik en verzorging van proefdieren uit de Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals. Hier toonden we miRNA-nabootsing van toediening aan de nier aan, wat resulteerde in overexpressie met behulp van UUO-muizen. Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Jichi Medical University [Goedkeuring nrs. 19-12 voor nierfibros...

<ol>
	<li>Mohr, A. M., Mott, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+microRNA+biology.">Overview of microRNA biology.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).</li><li>Bushati, N., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+functions.">microRNA functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).</li><li>Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs+in+diabetic+nephropathy:+From+biomarkers+to+therapy.">microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy.</a> Current Diabetes Reports. 16 (3), 35 (2016).</li><li>Yheskel, M., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+microRNAs+in+polycystic+kidney+disease.">Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+revolution:+RNA+interference+as+basic+biology,+research+tool,+and+therapeutic.">The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic.</a> Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+treatment:+siRNAs+as+small+molecule+drugs.">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li><li>Stewart, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells.">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li><li>Deng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klotho+gene+delivery+ameliorates+renal+hypertrophy+and+fibrosis+in+streptozotocin-induced+diabetic+rats+by+suppressing+the+Rho-associated+coiled-coil+kinase+signaling+pathway.">Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressor+of+cytokine+signaling+(SOCS)+2+attenuates+renal+lesions+in+rats+with+diabetic+nephropathy.">Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy.</a> Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).</li><li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors.">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).</li><li>Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+therapy:+Current+state+and+clinical+perspectives.">Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives.</a> Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).</li><li>Morishita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+microRNA-146a+with+polyethylenimine+nanoparticles+inhibits+renal+fibrosis+in+vivo.">Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).</li><li>Ishii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+diabetic+kidney+disease.">MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).</li><li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+acute+kidney+injury.">MicroRNA expression profiling in acute kidney injury.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).</li><li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+non-viral+gene+delivery+systems.">Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li><li>Swami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+and+highly+efficient+nonviral+DNA/siRNA+delivery+system+based+on+PEI-bisepoxide+nanoparticles.">A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).</li><li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+microRNA+expression+in+the+kidneys+of+immunoglobulin+a+nephropathic+mice.">Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535 (2020).</li><li>Yanai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+evaluation+of+microRNA+expressions+in+mouse+kidney+with+unilateral+ureteral+obstruction.">Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383 (2020).</li><li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+detection+method+for+microRNAs+in+the+kidney+of+an+ischemic+kidney+injury+mouse+model.">A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378 (2020).</li><li>Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+anti-fibrotic+activity+of+plasmid+DNA+expressing+small+interference+RNA+for+TGF-beta+type+II+receptor+for+a+mouse+model+of+obstructive+nephropathy+by+cationized+gelatin+prepared+from+different+amine+compounds.">Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).</li><li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+renal+tubulointerstitial+fibrosis+by+small+interfering+RNA+targeting+heat+shock+protein+47.">Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47.</a> American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+transfer+of+hepatocyte+growth+factor+to+skeletal+muscle+prevents+changes+in+rat+kidneys+after+5/6+nephrectomy.">In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy.</a> American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).</li><li>Hamar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+interfering+RNA+targeting+Fas+protects+mice+against+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).</li><li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenon+preconditioning+protects+against+renal+ischemic-reperfusion+injury+via+HIF-1alpha+activation.">Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+hairpin+RNA+knockdown+of+connective+tissue+growth+factor+by+ultrasound-targeted+microbubble+destruction+improves+renal+fibrosis.">Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).</li></ol>

Met behulp van het protocol dat in dit manuscript wordt gepresenteerd, kunnen PEI-NP's miRNA-nabootsingen aan de nier leveren om overexpressie van doel-miRNA's te induceren, wat resulteert in behandelingseffecten in in vivo muismodellen van verschillende nierziekten, waaronder nierfibrose, diabetische nierziekte en AKI.
De methode om het complex van PEI-NP's en miRNA-mimiek te bereiden is heel eenvoudig. Het positief geladen oppervlak van PEI-NP's vangt de miRNA-nabootsing in wanneer ...

miRNA's, kleine niet-coderende RNA's (21-25 basen) die niet worden vertaald in eiwitten, remmen veel doelboodschapper-RNA's (mRNA's) door ze te destabiliseren en hun vertaling bij verschillende nierziekten te remmen 1,2. Daarom is gentherapie met exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsers of -remmers een potentiële nieuwe optie om de ontwikkeling van veel nierziekten te remmen 3,4,5.
Ondanks de belofte van miRNA-nabootsers of -remmers voor gentherapie, blijft levering aan doelorganen een grote hindernis voor in vivo experimenten om hun klinische potentieel te ontwikkelen. Omdat kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsers of -remmers onderhevig zijn aan onmiddellijke afbraak door serum-RNase, wordt hun halfwaardetijd verkort bij systemische toediening in vivo6. Bovendien is de efficiëntie van miRNA-nabootsers of -remmers om het plasmamembraan en transfect cytoplasma te passeren over het algemeen veel lager zonder geschikte vectoren 7,8. Deze bewijslijnen suggereren dat de ontwikkeling van het miRNA-nabootsings- of remmersysteem voor de nier nodig is om het gebruik ervan in klinische omgevingen mogelijk te maken en ze een nieuwe behandelingsoptie te maken voor patiënten met verschillende nierziekten.
Virale vectoren zijn gebruikt als dragers om exogene miRNA-nabootsers of -remmers aan de nier te leveren 9,10. Hoewel ze zijn ontwikkeld voor bioveiligheid en transfectie-werkzaamheid, kunnen virale vectoren nog steeds een interferonrespons en / of genetische instabiliteit veroorzaken11,12. Om deze zorgen weg te nemen, ontwikkelden we een miRNA-nabootsingssysteem voor de nier met behulp van polyethylenimine nanodeeltjes (PEI-NP's), een niet-virale vector, in verschillende muismodellen van nierziekte13,14,15.
PEI-NP's zijn lineaire op polymeren gebaseerde NP's die oligonucleotiden, inclusief miRNA-nabootsers, effectief aan de nier kunnen afleveren en worden beschouwd als de voorkeur voor het bereiden van niet-virale vectoren vanwege hun veiligheid op lange termijn en biocompatibiliteit13,16,17.
Deze studie toont de effecten aan van systematische exogene miRNA-nabootsing toediening met PEI-NP's via staartaderinjectie in nierfibrosemodelmuizen geproduceerd door unilaterale ureterobstructie (UUO). Daarnaast demonstreren we de effecten van systematische exogene miRNA-nabootsing met PEI-NP's via staartaderinjectie in diabetische nierziektemodelmuizen (db / db-muizen: C57BLKS / J Iar -+ Lepr db / + Leprdb) en acute nierbeschadigingsmodelmuizen geproduceerd door nierischemie-reperfusieletsel (IRI).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RPE</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3&#8217; (sense) 
			5&#8217;-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3&#8242; (antisense)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-labeled double-strand oligonucleotides</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>MIR7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories Inc</td>
			<td>FL-1321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo-jetPEI</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>101000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU 
			UT-3&#8242; (sense) 5&#8217;-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3&#8242; (antisense)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-146a-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001638</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Gene design</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG 
			GUU-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-181b-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00006083</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Gene design</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-5100-primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00042952</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)</td>
			<td>Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of exogenous artificially synthesized mirna mimic to the kidney using polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models

microRNA's (miRNA's), kleine niet-coderende RNA's (21-25 basen) die niet worden vertaald in eiwitten, remmen veel doelboodschapper-RNA's (mRNA's) door hun vertaling bij verschillende nierziekten te destabiliseren en te remmen. Daarom is afwisseling van miRNA-expressie door exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsingen een potentieel nuttige behandelingsoptie voor het remmen van de ontwikkeling van veel nierziekten. Omdat serumRNAase echter onmiddellijk systematisch toegediende exogene miRNA-nabootsingen in vivo afbreekt, blijft de afgifte van miRNA aan de nier een uitdaging. Daarom zijn vectoren nodig die exogene miRNA-nabootsingen kunnen beschermen tegen afbraak door RNAase en ze aanzienlijk aan de nier kunnen afleveren. Veel studies hebben virale vectoren gebruikt om exogene miRNA-nabootsers of -remmers aan de nier te leveren. Virale vectoren kunnen echter een interferonrespons en/of genetische instabiliteit veroorzaken. Daarom is de ontwikkeling van virale vectoren ook een hindernis voor het klinische gebruik van exogene miRNA-nabootsers of -remmers. Om deze zorgen met betrekking tot virale vectoren weg te nemen, ontwikkelden we een niet-virale vectormethode om miRNA-nabootsingen aan de nier af te leveren met behulp van staartaderinjectie van polyethylenimine nanodeeltjes (PEI-NP's), wat leidde tot significante overexpressie van doel-miRNA's in verschillende muismodellen van nierziekte.

De hieronder beschreven doel-miRNA's voor nierfibrose, diabetische nefropathie en AKI werden geselecteerd op basis van de microarray, qRT-PCR en / of database-onderzoek voor gentherapietoepassingen. Voor nadere bijzonderheden wordt verwezen naar de vorige publicaties13,14,15.
Toediening en effecten van miRNA-146a-5p-mimic met behulp van PEI-NP's bij nierfibrosemuizen<sup class...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models at JoVE.c

Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

Hier leveren we exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsingen aan de nier via staartaderinjectie van een niet-virale vector en polyethylenimine nanodeeltjes in verschillende nierziektemuismodellen. Dit leidde tot significante overexpressie van doelmiRNA in de nier, wat resulteerde in geremde progressie van nierziekte in verschillende muismodellen.

Levering van exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsing aan de nier met behulp van polyethylenimine nanodeeltjes in verschillende nierziektemuismodellen

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de therapie van microRNA naar de nier, wat een uitdaging blijft. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de therapie van microRNA-nabootsingen naar de nier mogelijk maakt zonder een interferonrespons of genetische instabiliteit te veroorzaken. Begin met het oplossen van 10 microliter PEI-NP's in 90 microliter 5% glucose-oplossing in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Draai vervolgens de buis zachtjes en draai naar beneden. Meng 50 microliter kunstmatig gesynthetiseerde miRNA's opgelost in 100 micromolair nucleasevrij water met 50 micromolair 10% glucoseoplossing in microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter. Draai de buis zachtjes en draai naar beneden.Dit proces levert miRNA opgelost in 5% glucose-oplossing. Meng vervolgens 100 microliter PEI-NP's in 5% glucose-oplossing en 100 microliter miRNA-mimiek in 5% glucose-oplossing. Draai de buis zachtjes en draai naar beneden.Incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om een stabiel complex van PEI-NPs miRNA-nabootsing te bereiden. Los twee microliter PEI-NP's op in 98 microliter 10% glucoseoplossing in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Draai de buis zachtjes en draai naar beneden.Voeg vervolgens 100 microliter Cy3-gelabelde miRNA-mimiek toe aan 100 microliter PEI-NP's in 10% glucose-oplossing en draai de buis voorzichtig. Incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om een stabiel complex van PEI-NPs-Cy3-gelabelde-miRNA-mimic te bereiden. Plaats de UUO-muis met het hoofd in een centrifugebuis van 50 milliliter zonder verdoving en plaats de staart vervolgens door een voorbereid gat in de dop.Vul een spuit van één milliliter met een naald van 30 gauge met 200 microliter PEI-NPs-Cy3-gelabeld-miRNA-mimic-complex en injecteer het complex via de staartader van de muis. Maak vervolgens een incisie in de huid, spieren en ribben met een chirurgische schaar en tang om het hart bloot te leggen. Na het maken van een incisie in het rechter atrium, injecteert u PBS in de linker ventrikel totdat de nierkleur verandert in lichtgeel.Dit geeft aan dat het hele muislichaam is doordrenkt met PBS. Na het verzamelen van de nieren, verwijder de niercapsules en was ze twee keer met PBS. Sluit de nierweefselmonsters in OCT-verbinding in en vries ze in vloeibare stikstof in.Gebruik een cryostaat om secties voor te bereiden en monteer de secties op silaan-gecoate glazen dia's. Bevestig ze met 4% paraformaldehyde en was de dia's voorzichtig twee keer met PBS. Visualiseer ten slotte de fluorescentiekleuring door fluorescentiemicroscopie bij 100x en 400x vergroting en geschikte beeldvormingssoftware.De representatieve afbeelding toont de structuur van het PEI-NPs-miRNA-mimic-complex. De toediening en effecten van miRNA-146a-5p-mimic met behulp van PEI-NP's bij nierfibrose worden in deze afbeeldingen weergegeven. Fluorescerende microscopie-analyse toonde aan dat staart-aderinjectie van PEI-NP's de miRNA-nabootsing aan de tubulo-interstitiële ruimte kon leveren.Bij nierfibrosemuizen geproduceerd door UUO, omvatte dit renale buisvormige cellen die geen regelmatige vorm hebben in de nier en de glomerulus. qRT-PCR-analyse toonde aan dat injectie van PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic significante overexpressie van miRNA-146a-5p in de nier veroorzaakte. De histologische analyse met Sirius rode kleuring wordt hier getoond.Fluorescerende microscopie-analyse toonde aan dat staartaderinjectie van PEI-NP's miRNA-nabootsing kon leveren aan de glomerulus- en tubulo-interstitiële ruimte in nieren van diabetische niermodelmuizen in vivo. Bovendien toonde de qRT-PCR-analyse aan dat injectie van PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic significante overexpressie van miRNA-181b-5p in de nier veroorzaakte. Histologische analyse met periodieke zuur-Schiff-kleuring toonde aan dat injectie van PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic eenmaal per week van 10 tot 20 weken oud de progressie van diabetische nierziekte bij muizen remde.Toediening en effecten van PEI-NPs-miRNA-5100-mimic in acute nierbeschadigingsmodelmuizen geproduceerd door ischemiereperfusieletsel worden hier weergegeven. De gegevens van de fluorescerende microscopie-analyse qRT-PCR-analyse om de overexpressie-effecten van miRNA-5100 na injectie van PEI-NPs-miRNA-5100-mimic en de histologische analyse van hematoxyline-eosine gekleurde nieren te evalueren, zijn weergegeven in deze afbeeldingen. PEI-NP's geïnjecteerd via de staartader twee dagen voor de ischemie reperfusie letsel, of IRI, procedure voorkomen acute nierschade progressie geïnduceerd door IRI.Bereid bij het uitvoeren van deze techniek vijf micrometer dikke secties voor die zoveel mogelijk nierweefsel bevatten. Je kunt ook zeven micrometer dikke secties bereiden.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Een methode voor Murine Islet Isolatie en subcapsulaire Niertransplantatie

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Spectral Karyotypering naar chromosoomafwijkingen bij mensen en muizen Studie met polycysteuze nierziekte

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Evaluatie van de vaatfunctie bij patiënten met chronische nierziekte

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Een mogelijke zebravis model van PKD: Knockdown van<em&gt; Wnt5a</em&gt; Oorzaken Cysten in zebravis Nieren

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Muis Niertransplantatie: Modellen van transplantaatafstoting

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Het gebruik van ultra-hoge gebied MRI in kleine knaagdieren Modellen van Polycystic voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Fenotypering and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Murine Kidney Transplant Technique

Muizen Niertransplantatie Techniek

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normotherme<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Nier Perfusie voor het Behoud van de Nier transplantaten voorafgaand aan de transplantatie

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney

Intravasculaire Levering van Biologics aan de Rat Kidney

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Beoordeling van de nierfunctie in muismodellen van glomerulaire ziekte

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...