Name: delivery of exogenous artificially synthesized mirna mimic to the kidney using polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models at JoVE.c

Questo lavoro è stato parzialmente supportato da JSPS KAKENHI (Grant No. 21K08233). Ringraziamo Edanz (https://jp.edanz.com/ac) per aver curato le bozze di questo manoscritto.

Tutti i protocolli sperimentali sugli animali sono stati approvati dal comitato etico animale della Jichi Medical University ed eseguiti in conformità con le linee guida sull'uso e la cura degli animali sperimentali della Guida della Jichi Medical University per gli animali da laboratorio. Qui, abbiamo dimostrato la consegna miRNA mimica al rene con conseguente sovraespressione utilizzando topi UUO. Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico della Jichi Medical University [Approvazione n. 19-12 per la fibrosi r...

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	<li>Mohr, A. M., Mott, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+microRNA+biology.">Overview of microRNA biology.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).</li><li>Bushati, N., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+functions.">microRNA functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).</li><li>Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs+in+diabetic+nephropathy:+From+biomarkers+to+therapy.">microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy.</a> Current Diabetes Reports. 16 (3), 35 (2016).</li><li>Yheskel, M., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+microRNAs+in+polycystic+kidney+disease.">Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+revolution:+RNA+interference+as+basic+biology,+research+tool,+and+therapeutic.">The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic.</a> Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+treatment:+siRNAs+as+small+molecule+drugs.">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li><li>Stewart, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells.">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li><li>Deng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klotho+gene+delivery+ameliorates+renal+hypertrophy+and+fibrosis+in+streptozotocin-induced+diabetic+rats+by+suppressing+the+Rho-associated+coiled-coil+kinase+signaling+pathway.">Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressor+of+cytokine+signaling+(SOCS)+2+attenuates+renal+lesions+in+rats+with+diabetic+nephropathy.">Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy.</a> Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).</li><li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors.">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).</li><li>Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+therapy:+Current+state+and+clinical+perspectives.">Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives.</a> Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).</li><li>Morishita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+microRNA-146a+with+polyethylenimine+nanoparticles+inhibits+renal+fibrosis+in+vivo.">Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).</li><li>Ishii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+diabetic+kidney+disease.">MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).</li><li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+acute+kidney+injury.">MicroRNA expression profiling in acute kidney injury.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).</li><li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+non-viral+gene+delivery+systems.">Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li><li>Swami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+and+highly+efficient+nonviral+DNA/siRNA+delivery+system+based+on+PEI-bisepoxide+nanoparticles.">A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).</li><li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+microRNA+expression+in+the+kidneys+of+immunoglobulin+a+nephropathic+mice.">Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535 (2020).</li><li>Yanai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+evaluation+of+microRNA+expressions+in+mouse+kidney+with+unilateral+ureteral+obstruction.">Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383 (2020).</li><li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+detection+method+for+microRNAs+in+the+kidney+of+an+ischemic+kidney+injury+mouse+model.">A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378 (2020).</li><li>Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+anti-fibrotic+activity+of+plasmid+DNA+expressing+small+interference+RNA+for+TGF-beta+type+II+receptor+for+a+mouse+model+of+obstructive+nephropathy+by+cationized+gelatin+prepared+from+different+amine+compounds.">Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).</li><li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+renal+tubulointerstitial+fibrosis+by+small+interfering+RNA+targeting+heat+shock+protein+47.">Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47.</a> American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+transfer+of+hepatocyte+growth+factor+to+skeletal+muscle+prevents+changes+in+rat+kidneys+after+5/6+nephrectomy.">In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy.</a> American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).</li><li>Hamar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+interfering+RNA+targeting+Fas+protects+mice+against+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).</li><li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenon+preconditioning+protects+against+renal+ischemic-reperfusion+injury+via+HIF-1alpha+activation.">Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+hairpin+RNA+knockdown+of+connective+tissue+growth+factor+by+ultrasound-targeted+microbubble+destruction+improves+renal+fibrosis.">Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).</li></ol>

Utilizzando il protocollo presentato in questo manoscritto, le PEI-NP possono fornire miRNA imitazioni al rene per indurre la sovraespressione dei miRNA bersaglio, con conseguenti effetti del trattamento in modelli murini in vivo di diverse malattie renali, tra cui la fibrosi renale, la malattia renale diabetica e l'AKI.
Il metodo per preparare il complesso di PEI-NPs e miRNA mimic è molto semplice. La superficie caricata positivamente delle NP PEI intrappola il miRNA mimo quando son...

I miRNA, piccoli RNA non codificanti (21-25 basi) che non sono tradotti in proteine, inibiscono molti RNA messaggeri bersaglio (mRNA) destabilizzandoli e inibendo la loro traduzione in varie malattie renali 1,2. Pertanto, la terapia genica che impiega miRNA esogeni sintetizzati artificialmente o inibitori è una potenziale nuova opzione per inibire lo sviluppo di molte malattie renali 3,4,5.
Nonostante la promessa di miRNA imitatori o inibitori per la terapia genica, la consegna agli organi bersaglio rimane un grosso ostacolo per gli esperimenti in vivo per sviluppare il loro potenziale clinico. Poiché i miRNA sintetizzati artificialmente o gli inibitori sono soggetti a degradazione immediata da parte della RNasi sierica, la loro emivita è ridotta dopo somministrazione sistemica in vivo6. Inoltre, l'efficienza dei miRNA imitatori o inibitori di attraversare la membrana plasmatica e trasfettare il citoplasma è generalmente molto più bassa senza vettori appropriati 7,8. Queste linee di evidenza suggeriscono che è necessario lo sviluppo di miRNA imitatori o inibitori del sistema di rilascio per il rene, per consentire il loro uso in contesti clinici e renderli una nuova opzione di trattamento per i pazienti con varie malattie renali.
I vettori virali sono stati utilizzati come vettori per fornire miRNA esogeni o inibitori al rene 9,10. Sebbene siano stati sviluppati per la biosicurezza e l'efficacia della trasfezione, i vettori virali possono ancora causare una risposta all'interferone e/o instabilità genetica11,12. Per superare queste preoccupazioni, abbiamo sviluppato un sistema di rilascio di miRNA che imita il rene utilizzando nanoparticelle di polietilenimina (PEI-NP), un vettore non virale, in diversi modelli murini di malattia renale13,14,15.
Le PEI-NP sono NP lineari a base di polimeri che possono effettivamente rilasciare oligonucleotidi, comprese le imitazioni dei miRNA, al rene e sono considerate preferibili per la preparazione di vettori non virali a causa della loro sicurezza e biocompatibilità a lungo termine13,16,17.
Questo studio dimostra gli effetti dei miRNA esogeni sistematici che imitano la consegna con PEI-NP tramite iniezione di vene caudali in topi modello di fibrosi renale prodotti da ostruzione unilaterale dell'uretere (UUO). Inoltre, dimostriamo gli effetti della somministrazione sistematica di miRNA esogeno con PEI-NPs tramite iniezione di vena caudale in topi modello di malattia renale diabetica (topi db / db: C57BLKS / J Iar -+ Lepr db / + Leprdb) e topi modello di danno renale acuto prodotto da danno da ischemia-riperfusione renale (IRI).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RPE</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3&#8217; (sense) 
			5&#8217;-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3&#8242; (antisense)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-labeled double-strand oligonucleotides</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>MIR7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories Inc</td>
			<td>FL-1321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo-jetPEI</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>101000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU 
			UT-3&#8242; (sense) 5&#8217;-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3&#8242; (antisense)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-146a-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001638</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Gene design</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG 
			GUU-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-181b-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00006083</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Gene design</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-5100-primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00042952</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)</td>
			<td>Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of exogenous artificially synthesized mirna mimic to the kidney using polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models

I microRNA (miRNA), piccoli RNA non codificanti (21-25 basi) che non sono tradotti in proteine, inibiscono molti RNA messaggeri bersaglio (mRNA) destabilizzando e inibendo la loro traduzione in varie malattie renali. Pertanto, l'alternanza dell'espressione di miRNA da parte di miRNA esogeni sintetizzati artificialmente è un'opzione di trattamento potenzialmente utile per inibire lo sviluppo di molte malattie renali. Tuttavia, poiché la RNAasi sierica degrada immediatamente i miRNA esogeni sistematicamente somministrati in vivo, la consegna di miRNA al rene rimane una sfida. Pertanto, sono necessari vettori in grado di proteggere i miRNA esogeni dalla degradazione da parte della RNAasi e consegnarli significativamente al rene. Molti studi hanno utilizzato vettori virali per fornire miRNA esogeni o inibitori al rene. Tuttavia, i vettori virali possono causare una risposta all'interferone e/o instabilità genetica. Pertanto, lo sviluppo di vettori virali è anche un ostacolo per l'uso clinico di miRNA esogeni o inibitori. Per superare queste preoccupazioni riguardanti i vettori virali, abbiamo sviluppato un metodo vettoriale non virale per fornire miRNA imitatori al rene utilizzando l'iniezione di nanoparticelle di polietilenimina (PEI-NP), che ha portato a una significativa sovraespressione dei miRNA bersaglio in diversi modelli murini di malattia renale.

I miRNA target per la fibrosi renale, la nefropatia diabetica e l'AKI descritti di seguito sono stati selezionati sulla base della ricerca di microarray, qRT-PCR e / o database per applicazioni di terapia genica. Per ulteriori dettagli si rimanda alle precedenti pubblicazioni13,14,15.
Rilascio ed effetti di miRNA-146a-5p-mimic utilizzando PEI-NPs in topi con fibrosi renale<sup...

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Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

Qui, forniamo miRNA esogeni sintetizzati artificialmente al rene tramite iniezione di vena della coda di un vettore non virale e nanoparticelle di polietilenimina in diversi modelli murini di malattie renali. Ciò ha portato a una significativa sovraespressione del miRNA bersaglio nel rene, con conseguente progressione inibita della malattia renale in diversi modelli murini.

Rilascio di miRNA esogeno sintetizzato artificialmente al rene utilizzando nanoparticelle di polietilenimina in diversi modelli murini di malattie renali

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella terapia del microRNA al rene, che rimane una sfida. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ha permesso la terapia dei microRNA imitando il rene senza causare una risposta all'interferone o instabilità genetica. Iniziare sciogliendo 10 microlitri di PEI-NPs in 90 microlitri di soluzione di glucosio al 5% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.Quindi vortice delicatamente il tubo e girare verso il basso. Mescolare 50 microlitri di miRNA sintetizzati artificialmente disciolti in 100 micromolari di acqua priva di nucleasi con 50 micromolari di soluzione di glucosio al 10% in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.Questo processo produce miRNA disciolti in una soluzione di glucosio al 5%. Quindi mescolare 100 microlitri di PEI-NPs in soluzione di glucosio al 5% e 100 microlitri di miRNA mimic in soluzione di glucosio al 5%. Vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.Incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente per preparare un complesso stabile di miRNA PEI-NPs. Sciogliere due microlitri di PEI-NP in 98 microlitri di soluzione di glucosio al 10% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.Quindi aggiungere 100 microlitri di miRNA marcati con Cy3 a 100 microlitri di PEI-NPs in soluzione di glucosio al 10% e vortice delicatamente il tubo. Incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente per preparare un complesso stabile di PEI-NPs-Cy3-marcato-miRNA-mimic. Posizionare il topo UUO a testa in giù in un tubo da centrifuga da 50 millilitri senza anestesia e quindi posizionare la coda attraverso un foro preparato nel cappuccio.Riempire una siringa da un millilitro con un ago calibro 30 con 200 microlitri di complesso miRNA-mimico marcato con PEI-NPs-Cy3 e iniettare il complesso attraverso la vena caudale del topo. Successivamente, praticare un'incisione nella pelle, nei muscoli e nelle costole con forbici chirurgiche e pinze per esporre il cuore. Dopo aver praticato un'incisione nell'atrio destro, iniettare PBS nel ventricolo sinistro fino a quando il colore del rene diventa giallo pallido.Ciò indica che l'intero corpo del mouse è perfuso con PBS. Dopo aver raccolto i reni, rimuovere le capsule renali e lavarle due volte con PBS. Incorporare i campioni di tessuto renale nel composto OCT e congelarli in azoto liquido.Utilizzare un criostato per preparare le sezioni e montare le sezioni su vetrini rivestiti di silano. Fissarli con il 4% di paraformaldeide e lavare delicatamente i vetrini due volte con PBS. Infine, visualizzare la colorazione a fluorescenza mediante microscopia a fluorescenza con ingrandimento 100x e 400x e software di imaging appropriato.L'immagine rappresentativa mostra la struttura del complesso PEI-NPs-miRNA-mimimi. La consegna e gli effetti di miRNA-146a-5p-mimic utilizzando PEI-NPs nella fibrosi renale sono rappresentati in queste immagini. L'analisi al microscopio fluorescente ha mostrato che l'iniezione di PEI-NP potrebbe fornire la mimica miRNA allo spazio tubulointerstiziale.Nei topi con fibrosi renale prodotti da UUO, questo includeva cellule tubulari renali che non hanno una forma regolare nel rene e nel glomerulo. L'analisi qRT-PCR ha mostrato che l'iniezione di PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic ha indotto una significativa sovraespressione di miRNA-146a-5p nel rene. L'analisi istologica con colorazione rossa Sirio è mostrata qui.L'analisi al microscopio fluorescente ha mostrato che l'iniezione di PEI-NP potrebbe fornire miRNA mimic al glomerulo e allo spazio tubulointerstiziale nei reni di topi modello di rene diabetico in vivo. Inoltre, l'analisi qRT-PCR ha mostrato che l'iniezione di PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic ha indotto una significativa sovraespressione di miRNA-181b-5p nel rene. L'analisi istologica con colorazione periodica acido-Schiff ha mostrato che l'iniezione di PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic una volta alla settimana da 10 a 20 settimane di età ha inibito la progressione della malattia renale diabetica nei topi.La consegna e gli effetti di PEI-NPs-miRNA-5100-mimic in topi modello di danno renale acuto prodotti da danno da ischemia da riperfusione sono mostrati qui. In queste immagini sono illustrati i dati dell'analisi al microscopio fluorescente qRT-PCR per valutare gli effetti di sovraespressione di miRNA-5100 dopo iniezione di PEI-NPs-miRNA-5100-mimic e l'analisi istologica del rene colorato con ematossilina-eosina. Le PEI-NP iniettate attraverso la vena caudale due giorni prima della procedura di danno da riperfusione da ischemia, o IRI, prevengono la progressione del danno renale acuto indotta dall'IRI.Quando si esegue questa tecnica, preparare sezioni spesse cinque micrometri che includano più tessuto renale possibile. Puoi anche preparare sezioni spesse sette micrometri.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Un metodo per isolamento Islet murini e trapianto renale subcapsulare

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Ricerca

Medicina

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Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

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Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

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Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

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Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

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