Name: delivery of exogenous artificially synthesized mirna mimic to the kidney using polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models at JoVE.c

本研究の一部はJSPS科研費(課題研究(課題番号21K08233)の支援を受けて行われました。この原稿の草稿を編集してくれたEdanz (https://jp.edanz.com/ac)に感謝します。

すべての動物実験プロトコルは、自治医科大学の動物倫理委員会によって承認され、自治医科大学実験動物ガイドの実験動物の使用と管理のガイドラインに従って実施されました。ここでは、UUOマウスを使用して、腎臓へのmiRNA模倣送達により過剰発現を実証しました。本試験は自治医科大学倫理委員会の承認を受けました[腎線維症については承認番号19-12、急性腎感染症(AKI)については17-024...

<ol>
	<li>Mohr, A. M., Mott, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+microRNA+biology.">Overview of microRNA biology.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).</li><li>Bushati, N., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+functions.">microRNA functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).</li><li>Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs+in+diabetic+nephropathy:+From+biomarkers+to+therapy.">microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy.</a> Current Diabetes Reports. 16 (3), 35 (2016).</li><li>Yheskel, M., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+microRNAs+in+polycystic+kidney+disease.">Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+revolution:+RNA+interference+as+basic+biology,+research+tool,+and+therapeutic.">The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic.</a> Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+treatment:+siRNAs+as+small+molecule+drugs.">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li><li>Stewart, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells.">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li><li>Deng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klotho+gene+delivery+ameliorates+renal+hypertrophy+and+fibrosis+in+streptozotocin-induced+diabetic+rats+by+suppressing+the+Rho-associated+coiled-coil+kinase+signaling+pathway.">Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressor+of+cytokine+signaling+(SOCS)+2+attenuates+renal+lesions+in+rats+with+diabetic+nephropathy.">Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy.</a> Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).</li><li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors.">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).</li><li>Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+therapy:+Current+state+and+clinical+perspectives.">Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives.</a> Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).</li><li>Morishita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+microRNA-146a+with+polyethylenimine+nanoparticles+inhibits+renal+fibrosis+in+vivo.">Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).</li><li>Ishii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+diabetic+kidney+disease.">MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).</li><li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+acute+kidney+injury.">MicroRNA expression profiling in acute kidney injury.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).</li><li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+non-viral+gene+delivery+systems.">Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li><li>Swami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+and+highly+efficient+nonviral+DNA/siRNA+delivery+system+based+on+PEI-bisepoxide+nanoparticles.">A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).</li><li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+microRNA+expression+in+the+kidneys+of+immunoglobulin+a+nephropathic+mice.">Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535 (2020).</li><li>Yanai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+evaluation+of+microRNA+expressions+in+mouse+kidney+with+unilateral+ureteral+obstruction.">Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383 (2020).</li><li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+detection+method+for+microRNAs+in+the+kidney+of+an+ischemic+kidney+injury+mouse+model.">A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378 (2020).</li><li>Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+anti-fibrotic+activity+of+plasmid+DNA+expressing+small+interference+RNA+for+TGF-beta+type+II+receptor+for+a+mouse+model+of+obstructive+nephropathy+by+cationized+gelatin+prepared+from+different+amine+compounds.">Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).</li><li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+renal+tubulointerstitial+fibrosis+by+small+interfering+RNA+targeting+heat+shock+protein+47.">Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47.</a> American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+transfer+of+hepatocyte+growth+factor+to+skeletal+muscle+prevents+changes+in+rat+kidneys+after+5/6+nephrectomy.">In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy.</a> American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).</li><li>Hamar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+interfering+RNA+targeting+Fas+protects+mice+against+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).</li><li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenon+preconditioning+protects+against+renal+ischemic-reperfusion+injury+via+HIF-1alpha+activation.">Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+hairpin+RNA+knockdown+of+connective+tissue+growth+factor+by+ultrasound-targeted+microbubble+destruction+improves+renal+fibrosis.">Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).</li></ol>

この原稿で提示されたプロトコルを使用して、PEI-NPはmiRNA模倣物を腎臓に送達して標的miRNAの過剰発現を誘導し、腎線維症、糖尿病性腎疾患、AKIを含むいくつかの腎疾患の in vivo マウスモデルで治療効果をもたらします。
PEI-NPとmiRNA模倣体の複合体を調製する方法は非常に簡単です。PEI-NPの正に帯電した表面は、それらがちょうど混合されたときにmiRNA模倣?...

タンパク質に翻訳されない小さなノンコーディングRNA(21〜25塩基)であるmiRNAは、さまざまな腎臓病において、それらを不安定にし、それらの翻訳を阻害することにより、多くの標的メッセンジャーRNA(mRNA)を阻害します1,2。したがって、外因性の人工的に合成されたmiRNA模倣物または阻害剤を使用する遺伝子治療は、多くの腎臓病の発症を抑制するための潜在的な新しい選択肢である3、4、5。
遺伝子治療のためのmiRNA模倣物または阻害剤の約束にもかかわらず、標的臓器への送達は、その臨床的可能性を開発するためのin vivo実験にとって依然として大きなハードルです。人工的に合成されたmiRNA模倣物または阻害剤は血清RNaseによる即時分解を受けやすいため、それらの半減期はin vivoでの全身投与時に短縮されます6。さらに、原形質膜およびトランスフェクト細胞質を通過するmiRNA模倣物または阻害剤の効率は、適切なベクターなしでは一般にはるかに低い7、8。これらの一連の証拠は、臨床現場での使用を可能にし、さまざまな腎臓病患者の新しい治療選択肢となるために、腎臓用のmiRNA模倣体または阻害剤送達システムの開発が必要であることを示唆しています。
ウイルスベクターは、外因性miRNA模倣物または阻害剤を腎臓に送達するための担体として使用されてきた9、10。それらはバイオセーフティーおよびトランスフェクションの有効性のために開発されてきたが、ウイルスベクターは依然としてインターフェロン応答および/または遺伝的不安定性を引き起こす可能性がある11,12。これらの懸念を克服するために、腎臓病のいくつかのマウスモデルで、非ウイルスベクターであるポリエチレンイミンナノ粒子(PEI-NP)を使用して腎臓のmiRNA模倣送達システムを開発しました13,14,15。
PEI-NPは、miRNA模倣物を含むオリゴヌクレオチドを腎臓に効果的に送達することができる線状ポリマーベースのNPであり、その長期的な安全性および生体適合性のために非ウイルスベクターの調製に好ましいと考えられている13,16,17。
この研究は、片側尿管閉塞(UUO)によって産生された腎線維症モデルマウスにおける尾静脈注射を介したPEI-NPによる系統的外因性miRNA送達の効果を示しています。さらに、糖尿病性腎疾患モデルマウス(db/dbマウス:C57BLKS/J Iar -+Lepr db/+Leprdb)および腎虚血再灌流障害(IRI)によって作製された急性腎障害モデルマウスにおいて、尾静脈注射によるPEI-NPによる系統的外因性miRNA模倣送達の効果を実証する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RPE</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3&#8217; (sense) 
			5&#8217;-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3&#8242; (antisense)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-labeled double-strand oligonucleotides</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>MIR7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories Inc</td>
			<td>FL-1321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo-jetPEI</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>101000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU 
			UT-3&#8242; (sense) 5&#8217;-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3&#8242; (antisense)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-146a-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001638</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Gene design</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG 
			GUU-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-181b-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00006083</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Gene design</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-5100-primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00042952</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)</td>
			<td>Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of exogenous artificially synthesized mirna mimic to the kidney using polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models

タンパク質に翻訳されない小さなノンコーディングRNA(21〜25塩基)であるマイクロRNA(miRNA)は、さまざまな腎臓病においてそれらの翻訳を不安定化および阻害することにより、多くの標的メッセンジャーRNA(mRNA)を阻害します。したがって、外因性人工的に合成されたmiRNA模倣物によるmiRNA発現の交替は、多くの腎臓病の発症を抑制するための潜在的に有用な治療選択肢である。しかし、血清RNAaseはin vivoで系統的に投与された外因性miRNA模倣物を直ちに分解するため、腎臓へのmiRNAの送達は依然として課題です。そのため、外因性miRNA模倣体をRNAaseによる分解から保護し、腎臓に有意に送達できるベクターが必要です。多くの研究では、ウイルスベクターを使用して、外因性miRNA模倣物または阻害剤を腎臓に送達しています。しかしながら、ウイルスベクターは、インターフェロン応答および/または遺伝的不安定性を引き起こす可能性がある。したがって、ウイルスベクターの開発は、外因性miRNA模倣物または阻害剤の臨床使用のためのハードルでもある。ウイルスベクターに関するこれらの懸念を克服するために、ポリエチレンイミンナノ粒子(PEI-NP)の尾静脈注射を使用してmiRNA模倣物を腎臓に送達する非ウイルスベクター法を開発し、腎臓病のいくつかのマウスモデルで標的miRNAの有意な過剰発現をもたらしました。

下記の腎線維症、糖尿病性腎症、およびAKIの標的miRNAは、マイクロアレイ、qRT-PCR、および/または遺伝子治療アプリケーションのためのデータベース研究に基づいて選択されました。詳細については、以前の出版物13、14、15を参照してください。
腎線維化マウスにおけるPEI-NPを用いたmiRNA-146a-5p-?...

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Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

ここでは、いくつかの腎臓病モデルマウスにおいて、非ウイルスベクターとポリエチレンイミンナノ粒子の尾静脈注射 を介して 、外因性人工的に合成されたmiRNA模倣物を腎臓に送達します。これにより、腎臓における標的miRNAの有意な過剰発現がもたらされ、その結果、いくつかのマウスモデルにおいて腎臓病の進行が抑制された。

いくつかの腎臓病モデルマウスにおけるポリエチレンイミンナノ粒子を用いた外因性人工合成miRNA模倣体の腎臓への送達

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...

この方法は、腎臓へのマイクロRNAの治療における重要な質問に答えるのに役立ちますが、これは依然として課題です。この技術の主な利点は、インターフェロン反応や遺伝的不安定性を引き起こすことなく、腎臓へのマイクロRNA模倣物の治療を可能にすることです。10マイクロリットルのPEI-NPを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブ内の90マイクロリットルの5%グルコース溶液に溶解することから始めます。次に、チューブを静かに渦巻き、回転させます。100マイクロモルのヌクレアーゼフリー水に溶解した50マイクロリットルの人工合成miRNAと50マイクロモルの10%グルコース溶液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで混合します。チューブを静かに渦巻き、回転させます。このプロセスにより、5%グルコース溶液に溶解したmiRNAが得られます。次に、100マイクロリットルのPEI-NPを5%グルコース溶液に混合し、100マイクロリットルのmiRNA模倣物を5%グルコース溶液に混合します。チューブを静かに渦巻き、回転させます。混合物を室温で15分間インキュベートして、PEI-NPsmiRNA模倣物の安定な複合体を調製する。2マイクロリットルのPEI-NPを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブ内の98マイクロリットルの10%グルコース溶液に溶解します。チューブを静かに渦巻き、回転させます。次に、100マイクロリットルのCy3標識miRNA模倣物を10%グルコース溶液中の100マイクロリットルのPEI-NPに加え、チューブを穏やかにボルテックスします。混合物を室温で15分間インキュベートして、PEI-NPs-Cy3標識-miRNA模倣体の安定な複合体を調製します。UUOマウスの頭を麻酔なしで50ミリリットルの遠沈管に入れ、次にキャップの準備された穴に尾を通します。1ミリリットルの注射器に、200マイクロリットルのPEI-NPs-Cy3標識miRNA模倣複合体を含む30ゲージの針を充填し、マウスの尾静脈を介して複合体を注入します。次に、外科用ハサミと鉗子で皮膚、筋肉、肋骨を切開し、心臓を露出させます。右心房を切開した後、腎臓の色が淡黄色に変わるまで左心室にPBSを注入します。これは、マウスの体全体がPBSで灌流されていることを示しています。腎臓を集めた後、腎カプセルを取り外し、PBSで2回洗浄します。腎臓組織サンプルをOCTコンパウンドに埋め込み、液体窒素で凍結します。クライオスタットを使用して切片を準備し、シランコーティングされたスライドガラスに切片を取り付けます。それらを4%パラホルムアルデヒドで固定し、スライドをPBSで2回静かに洗浄します。最後に、100倍および400倍の倍率の蛍光顕微鏡と適切なイメージングソフトウェアによって蛍光染色を視覚化します。代表的な画像は、PEI-NPs-miRNA模倣複合体の構造を示す。腎線維症におけるPEI-NPを用いたmiRNA-146a-5p-模倣体の送達および効果をこれらの画像に示している。蛍光顕微鏡分析は、PEI-NPの尾静脈注射がmiRNA模倣体を尿細管間質腔に送達できることを示しました。UUOによって作製された腎線維症マウスでは、これには腎臓および糸球体に規則的な形態を持たない腎尿細管細胞が含まれていた。qRT-PCR分析は、PEI-NPs-miRNA-146a-5p-模倣物の注射が腎臓におけるmiRNA-146a-5pの有意な過剰発現を誘導することを示した。シリウス赤色染色による組織学的分析をここに示す。蛍光顕微鏡分析により、PEI-NPの尾静脈注射は、in vivoで糖尿病腎臓モデルマウスの腎臓の糸球体および尿細管間質腔にmiRNA模倣体を送達できることを示しました。さらに、qRT-PCR分析は、PEI-NPs-miRNA-181b-5p-模倣物の注射が腎臓におけるmiRNA-181b-5pの有意な過剰発現を誘導することを示した。周期的酸-シッフ染色による組織学的分析は、10〜20週齢の週1回、PEI-NPs-miRNA-181b-5p-模倣物の注射がマウスの糖尿病性腎疾患の進行を抑制することを示した。虚血再灌流傷害により作製した急性腎障害モデルマウスにおけるPEI-NPs-miRNA-5100-模倣体の送達および効果をここに示す。PEI-NPs-miRNA-5100-模倣体の注射後のmiRNA-5100の過剰発現効果を評価するための蛍光顕微鏡分析qRT-PCR分析のデータと、ヘマトキシリン-エオジン染色された腎臓の組織学的分析がこれらの画像に描かれています。虚血再灌流障害(IRI)の2日前に尾静脈を介して注射されたPEI-NPは、IRIによって誘発される急性腎障害の進行を防ぎます。この技術を実行するときは、できるだけ多くの腎臓組織を含む5マイクロメートルの厚さの切片を準備してください。厚さ7マイクロメートルの切片も用意できます。

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

マウス膵島の単離と被膜下腎移植のための方法

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

多発性嚢胞腎疾患で、ヒトとマウスの染色体異常を研究するためにスペクトル核型分析

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

慢性腎臓病患者における血管機能の評価

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

多発性嚢胞腎疾患の可能性のあるゼブラフィッシュモデル：のノックダウン<em&gt; WNT5A</em&gt;ゼブラフィッシュ腎臓で嚢胞を引き起こす

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

マウス腎臓移植：同種移植片拒絶のモデル

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

のための多発性嚢胞腎疾患の小齧歯類モデルにおける超高磁場MRIの使用<em&gt;インビボ</em&gt;表現型と薬物モニタリング

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Murine Kidney Transplant Technique

マウスの腎臓移植​​技術

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

正常温度の<em&gt;エクスビボ</em&gt;腎臓の保全のための腎臓の灌流は移植前の移植片

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney

ラット腎臓への生物製剤の血管内デリバリー

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

糸球体疾患のマウス ・ モデルにおける腎機能の評価

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...