Name: delivery of exogenous artificially synthesized mirna mimic to the kidney using polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models at JoVE.c

이 작업은 JSPS KAKENHI (보조금 번호 21K08233)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 이 원고의 초안을 편집해 주신 Edanz (https://jp.edanz.com/ac)에게 감사드립니다.

모든 동물 실험 프로토콜은 Jichi Medical University의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았으며 Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals의 실험 동물 사용 및 관리 지침에 따라 수행되었습니다. 여기에서 우리는 UUO 마우스를 사용하여 과발현을 초래하는 신장으로의 miRNA 모방 전달을 입증했습니다. 본 연구는 Jichi 의과대학 윤리위원회의 승인을 받았다[신장섬유증 19-12호, 급성신장감염(AKI) 17-024호, 당당뇨?...

<ol>
	<li>Mohr, A. M., Mott, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+microRNA+biology.">Overview of microRNA biology.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).</li><li>Bushati, N., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+functions.">microRNA functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).</li><li>Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs+in+diabetic+nephropathy:+From+biomarkers+to+therapy.">microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy.</a> Current Diabetes Reports. 16 (3), 35 (2016).</li><li>Yheskel, M., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+microRNAs+in+polycystic+kidney+disease.">Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+revolution:+RNA+interference+as+basic+biology,+research+tool,+and+therapeutic.">The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic.</a> Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+treatment:+siRNAs+as+small+molecule+drugs.">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li><li>Stewart, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells.">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li><li>Deng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klotho+gene+delivery+ameliorates+renal+hypertrophy+and+fibrosis+in+streptozotocin-induced+diabetic+rats+by+suppressing+the+Rho-associated+coiled-coil+kinase+signaling+pathway.">Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressor+of+cytokine+signaling+(SOCS)+2+attenuates+renal+lesions+in+rats+with+diabetic+nephropathy.">Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy.</a> Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).</li><li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors.">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).</li><li>Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+therapy:+Current+state+and+clinical+perspectives.">Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives.</a> Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).</li><li>Morishita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+microRNA-146a+with+polyethylenimine+nanoparticles+inhibits+renal+fibrosis+in+vivo.">Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).</li><li>Ishii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+diabetic+kidney+disease.">MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).</li><li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+acute+kidney+injury.">MicroRNA expression profiling in acute kidney injury.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).</li><li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+non-viral+gene+delivery+systems.">Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li><li>Swami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+and+highly+efficient+nonviral+DNA/siRNA+delivery+system+based+on+PEI-bisepoxide+nanoparticles.">A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).</li><li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+microRNA+expression+in+the+kidneys+of+immunoglobulin+a+nephropathic+mice.">Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535 (2020).</li><li>Yanai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+evaluation+of+microRNA+expressions+in+mouse+kidney+with+unilateral+ureteral+obstruction.">Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383 (2020).</li><li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+detection+method+for+microRNAs+in+the+kidney+of+an+ischemic+kidney+injury+mouse+model.">A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378 (2020).</li><li>Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+anti-fibrotic+activity+of+plasmid+DNA+expressing+small+interference+RNA+for+TGF-beta+type+II+receptor+for+a+mouse+model+of+obstructive+nephropathy+by+cationized+gelatin+prepared+from+different+amine+compounds.">Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).</li><li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+renal+tubulointerstitial+fibrosis+by+small+interfering+RNA+targeting+heat+shock+protein+47.">Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47.</a> American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+transfer+of+hepatocyte+growth+factor+to+skeletal+muscle+prevents+changes+in+rat+kidneys+after+5/6+nephrectomy.">In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy.</a> American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).</li><li>Hamar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+interfering+RNA+targeting+Fas+protects+mice+against+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).</li><li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenon+preconditioning+protects+against+renal+ischemic-reperfusion+injury+via+HIF-1alpha+activation.">Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+hairpin+RNA+knockdown+of+connective+tissue+growth+factor+by+ultrasound-targeted+microbubble+destruction+improves+renal+fibrosis.">Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).</li></ol>

이 원고에 제시된 프로토콜을 사용하여 PEI-NP는 miRNA 모방체를 신장에 전달하여 표적 miRNA의 과발현을 유도하여 신장 섬유증, 당뇨병성 신장 질환 및 AKI를 포함한 여러 신장 질환의 생체 내 마우스 모델에서 치료 효과를 얻을 수 있습니다.
PEI-NPs 및 miRNA 모방체의 복합체를 제조하는 방법은 매우 간단하다. PEI-NP의 양전하를 띤 표면은 13,14,15,16,17<s...

단백질로 번역되지 않는 작은 비암호화 RNA(21-25 염기)인 miRNA는 다양한 신장 질환에서 표적 메신저 RNA(mRNA)를 불안정하게 만들고 번역을 억제함으로써 많은 표적 메신저 RNA(mRNA)를 억제합니다 1,2. 그러므로, 외인성 인위적으로 합성된 miRNA 모방체 또는 억제제를 사용하는 유전자 요법은 많은 신장 질환의 발병을 억제하기 위한 잠재적인 새로운 옵션이다 3,4,5.
유전자 치료를 위한 miRNA 모방체 또는 억제제의 약속에도 불구하고, 표적 장기로의 전달은 임상 잠재력을 개발하기 위한 생체 내 실험에 여전히 큰 장애물로 남아 있습니다. 인위적으로 합성된 miRNA 모방체 또는 억제제는 혈청 RNase에 의해 즉시 분해되기 때문에, 이들의 반감기는 생체 내 전신 투여시 단축된다 6. 추가로, 원형질막을 가로질러 세포질을 형질감염시키는 miRNA 모방체 또는 억제제의 효율은 일반적으로 적절한 벡터 없이 훨씬 더 낮다[7,8]. 이러한 일련의 증거는 신장에 대한 miRNA 모방체 또는 억제제 전달 시스템의 개발이 임상 환경에서 사용을 가능하게 하고 다양한 신장 질환을 가진 환자를 위한 새로운 치료 옵션으로 만들기 위해 필요함을 시사합니다.
바이러스 벡터는 외인성 miRNA 모조물 또는 억제제를 신장에 전달하기 위한 운반체로서 사용되어 왔다 9,10. 바이러스 벡터는 생물안전성 및 형질감염 효능을 위해 개발되었지만, 여전히 인터페론 반응 및/또는 유전적 불안정성을 유발할 수 있다11,12. 이러한 우려를 극복하기 위해, 우리는 신장 질환의 여러 마우스 모델에서 비바이러스 벡터인 폴리에틸이민 나노입자(PEI-NP)를 사용하여 신장에 대한 miRNA 모방 전달 시스템을 개발했습니다13,14,15.
PEI-NP는 miRNA 모방체를 포함한 올리고뉴클레오티드를 신장에 효과적으로 전달할 수 있는 선형 폴리머 기반 NP이며, 이들의 장기 안전성 및 생체적합성 13,16,17로 인해 비바이러스 벡터를 제조하는 데 바람직한 것으로 간주됩니다.
이 연구는 편측 요관 폐쇄(UUO)에 의해 생성된 신장 섬유증 모델 마우스에서 꼬리 정맥 주사를 통한 체계적인 외인성 miRNA 모방 전달의 효과를 보여줍니다. 또한, 우리는 당뇨병성 신장 질환 모델 마우스(db/db 마우스: C57BLKS/J Iar -+Lepr db/+Leprdb) 및 신장 허혈-재관류 손상(IRI)에 의해 생성된 급성 신장 손상 모델 마우스에서 꼬리 정맥 주사를 통해 PEI-NP를 사용한 체계적인 외인성 miRNA 모방 전달의 효과를 입증합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RPE</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3&#8217; (sense) 
			5&#8217;-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3&#8242; (antisense)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-labeled double-strand oligonucleotides</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>MIR7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories Inc</td>
			<td>FL-1321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo-jetPEI</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>101000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU 
			UT-3&#8242; (sense) 5&#8217;-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3&#8242; (antisense)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-146a-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001638</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Gene design</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG 
			GUU-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-181b-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00006083</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Gene design</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-5100-primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00042952</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)</td>
			<td>Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of exogenous artificially synthesized mirna mimic to the kidney using polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models

단백질로 번역되지 않는 작은 비암호화 RNA(21-25 염기)인 microRNA(miRNA)는 다양한 신장 질환에서 번역을 불안정하게 만들고 억제함으로써 많은 표적 메신저 RNA(mRNA)를 억제합니다. 따라서, 외인성 인공적으로 합성된 miRNA 모조물에 의한 miRNA 발현의 교대는 많은 신장 질환의 발병을 억제하기 위한 잠재적으로 유용한 치료 옵션이다. 그러나, 혈청 RNAase는 생체 내에서 체계적으로 투여된 외인성 miRNA 모방체를 즉시 분해하기 때문에, 신장으로의 miRNA의 전달은 여전히 도전 과제로 남아 있다. 따라서, 외인성 miRNA 모조물을 RNAase에 의한 분해로부터 보호하고, 이를 신장에 현저하게 전달할 수 있는 벡터가 필요하다. 많은 연구에서 바이러스 벡터를 사용하여 외인성 miRNA 모방체 또는 억제제를 신장에 전달했습니다. 그러나 바이러스 벡터는 인터페론 반응 및/또는 유전적 불안정성을 유발할 수 있습니다. 따라서, 바이러스 벡터의 개발은 또한 외인성 miRNA 모방체 또는 억제제의 임상적 사용을 위한 장애물이다. 바이러스 벡터에 대한 이러한 우려를 극복하기 위해 우리는 폴리에틸이민 나노입자(PEI-NP)의 꼬리 정맥 주입을 사용하여 miRNA 모방체를 신장에 전달하는 비바이러스 벡터 방법을 개발했으며, 이는 신장 질환의 여러 마우스 모델에서 표적 miRNA의 상당한 과발현을 유도했습니다.

신장 섬유증, 당뇨병성 신병증 및 AKI에 대한 표적 miRNA는 유전자 치료 응용 분야를 위한 마이크로어레이, qRT-PCR 및/또는 데이터베이스 연구를 기반으로 선택되었습니다. 보다 상세한 내용은 이전 간행물13,14,15를 참조한다.
신장 섬유증 마우스에서 PEI-NP를 사용한 miRNA-146a-5p-모방체의 전달 및 효과</stron...

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Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

여기에서 우리는 여러 신장 질환 마우스 모델에서 비바이러스 벡터 및 폴리에틸렌이민 나노입자의 꼬리 정맥 주입을 통해 외인성 인공 합성 miRNA 모방체를 신장에 전달합니다. 이로 인해 신장에서 표적 miRNA가 크게 과발현되어 여러 마우스 모델에서 신장 질환의 진행이 억제되었습니다.

여러 신장 질환 마우스 모델에서 폴리에틸레니민 나노입자를 사용하여 신장에 외인성 인공 합성 miRNA 모방체의 전달

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...

이 방법은 신장에 대한 microRNA 치료의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 여전히 도전 과제로 남아 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인터페론 반응이나 유전적 불안정성을 일으키지 않고 신장에 대한 microRNA 모방 치료가 가능하다는 것입니다. 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에서 90 마이크로 리터의 5 % 포도당 용액에 10 마이크로 리터의 PEI-NP를 용해시키는 것으로 시작하십시오.그런 다음 튜브를 부드럽게 소용돌이 치고 아래로 회전시킵니다. 100마이크로몰의 뉴클레아제가 없는 물에 용해된 인공적으로 합성된 miRNA 50마이크로리터를 1.5밀리리터 마이크로원심분리기 튜브에서 50마이크로몰의 10% 포도당 용액과 혼합합니다. 튜브를 부드럽게 소용돌이 치고 아래로 돌립니다.이 과정은 5%포도당 용액에 용해된 miRNA를 생성합니다. 그런 다음 5 % 포도당 용액에 100 마이크로 리터의 PEI-NP를 혼합하고 5 % 포도당 용액에 100 마이크로 리터의 miRNA 모방을 혼합합니다. 튜브를 부드럽게 소용돌이 치고 아래로 돌립니다.혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 PEI-NPs miRNA 모조물의 안정한 복합체를 제조하였다. 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브의 10 % 포도당 용액 98 마이크로 리터에 2 마이크로 리터의 PEI-NP를 용해시킵니다. 튜브를 부드럽게 소용돌이 치고 아래로 돌립니다.그런 다음 100 마이크로 리터의 Cy3 표지 miRNA 모방체를 10 % 포도당 용액의 100 마이크로 리터의 PEI-NP에 넣고 튜브를 부드럽게 소용돌이칩니다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 PEI-NPs-Cy3-표지된-miRNA-모방체의 안정한 복합체를 제조하였다. UUO 마우스를 마취없이 50 밀리리터 원심 분리기 튜브에 먼저 넣은 다음 캡의 준비된 구멍을 통해 꼬리를 놓습니다.1밀리리터 주사기에 30게이지 바늘에 200마이크로리터의 PEI-NPs-Cy3-표지-miRNA-모방 복합체를 채우고 마우스의 꼬리 정맥을 통해 복합체를 주입합니다. 다음으로 수술용 가위와 집게로 피부, 근육, 갈비뼈를 절개하여 심장을 노출시킵니다. 우심방을 절개한 후 신장색이 옅은 노란색으로 바뀔 때까지 PBS를 좌심실에 주입합니다.이는 마우스 본체 전체가 PBS로 관류되어 있음을 나타낸다. 신장을 채취 한 후 신장 캡슐을 제거하고 PBS로 두 번 세척하십시오. 신장 조직 샘플을 OCT 화합물에 삽입하고 액체 질소에서 동결시킵니다.저온 유지 장치를 사용하여 섹션을 준비하고 섹션을 실란 코팅 유리 슬라이드에 장착합니다. 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하고 PBS로 슬라이드를 두 번 부드럽게 씻습니다. 마지막으로, 형광 현미경을 100x 및 400x 배율로 시각화하고 적절한 이미징 소프트웨어를 사용하여 형광 염색을 시각화합니다.대표 이미지는 PEI-NPs-miRNA-mimic 복합체의 구조를 보여줍니다. 신장 섬유증에서 PEI-NP를 사용한 miRNA-146a-5p-모방체의 전달 및 효과가 이 이미지에 묘사되어 있습니다. 형광 현미경 분석은 PEI-NP의 꼬리 정맥 주입이 miRNA 모방체를 세뇨관 간질 공간에 전달할 수 있음을 보여주었습니다.UUO에 의해 생산된 신장 섬유증 마우스에서, 이것은 신장 및 사구체에 규칙적인 형태를 갖지 않는 신장 세뇨관 세포를 포함하였다. qRT-PCR 분석은 PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic의 주입이 신장에서 miRNA-146a-5p의 현저한 과발현을 유도한다는 것을 보여주었다. 시리우스 레드 염색을 사용한 조직학적 분석이 여기에 나와 있습니다.형광 현미경 분석은 PEI-NP의 꼬리 정맥 주사가 생체 내에서 당뇨병성 신장 모델 마우스의 신장에 있는 사구체 및 세뇨관 간질 공간에 miRNA 모방을 전달할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, qRT-PCR 분석은 PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic의 주입이 신장에서 miRNA-181b-5p의 현저한 과발현을 유도하는 것으로 나타났다. Periodic acid-Schiff 염색을 이용한 조직학적 분석은 10주령에서 20주령까지 일주일에 한 번 PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic을 주사하면 마우스에서 당뇨병성 신장 질환의 진행을 억제하는 것으로 나타났습니다.허혈 재관류 손상에 의해 생산된 급성 신장 손상 모델 마우스에서 PEI-NPs-miRNA-5100-mimic의 전달 및 효과가 여기에 제시되어 있다. PEI-NPs-miRNA-5100-mimic 주입 후 miRNA-5100의 과발현 효과를 평가하기 위한 형광 현미경 분석 qRT-PCR 분석의 데이터와 헤마톡실린-에오신 염색 신장의 조직학적 분석이 이 이미지에 묘사되어 있습니다. 허혈 재관류 손상 또는 IRI 시술 2일 전에 꼬리 정맥을 통해 주사된 PEI-NP는 IRI에 의해 유발된 급성 신장 손상 진행을 예방합니다.이 기술을 수행 할 때 가능한 한 많은 신장 조직을 포함하는 5 마이크로 미터 두께의 섹션을 준비하십시오. 7 마이크로 미터 두께의 섹션을 준비 할 수도 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Murine 아일릿 절연 및 Subcapsular 신장 이식을위한 방법

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

연구

의학

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Polycystic 신장 질환과 함께 인간과 마우스의 염색체 이상을 공부하는 스펙트럼 Karyotyping

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

만성 신장 질환 환자에서 혈관 기능의 평가

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

다낭성 신장 질환의 가능한 제브라 피쉬 모델 :의 넉다운<em&gt; wnt5a</em&gt; Zebrafish의 신장의 낭종 원인

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

마우스 신장 이식 : 동종 이식 거부의 모델

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

대한 다낭성 신장 질환의 작은 설치류 모델에서 매우 높은 필드 MRI의 사용<em&gt; 생체</em&gt; 표현형 의약품 모니터링

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Murine Kidney Transplant Technique

쥐 신장 이식 기술

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

정상 체온<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 신장의 보존을위한 신장 관류는 이식 전에 이식

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney

쥐의 신장에 생물의 혈관 배달

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...