Name: delivery of exogenous artificially synthesized mirna mimic to the kidney using polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models at JoVE.c

Dette arbeidet ble delvis støttet av JSPS KAKENHI (Grant No. 21K08233). Vi takker Edanz (https://jp.edanz.com/ac) for redigering av utkast til dette manuskriptet.

Alle dyreforsøksprotokoller ble godkjent av dyreetikkomiteen ved Jichi Medical University og utført i samsvar med retningslinjer for bruk og pleie av forsøksdyr fra Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals. Her demonstrerte vi miRNA-etterligning til nyrene som resulterte i overuttrykk ved bruk av UUO-mus. Denne studien ble godkjent av etikkomiteen ved Jichi Medical University [Godkjenning nr. 19-12 for nyrefibrose, 17-024 for akutt nyreinfeksjon (AKI) og 19-11 for diabetisk nefropati].
<p class="jove_...

<ol>
	<li>Mohr, A. M., Mott, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+microRNA+biology.">Overview of microRNA biology.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).</li><li>Bushati, N., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+functions.">microRNA functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).</li><li>Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs+in+diabetic+nephropathy:+From+biomarkers+to+therapy.">microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy.</a> Current Diabetes Reports. 16 (3), 35 (2016).</li><li>Yheskel, M., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+microRNAs+in+polycystic+kidney+disease.">Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+revolution:+RNA+interference+as+basic+biology,+research+tool,+and+therapeutic.">The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic.</a> Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+treatment:+siRNAs+as+small+molecule+drugs.">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li><li>Stewart, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells.">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li><li>Deng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klotho+gene+delivery+ameliorates+renal+hypertrophy+and+fibrosis+in+streptozotocin-induced+diabetic+rats+by+suppressing+the+Rho-associated+coiled-coil+kinase+signaling+pathway.">Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressor+of+cytokine+signaling+(SOCS)+2+attenuates+renal+lesions+in+rats+with+diabetic+nephropathy.">Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy.</a> Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).</li><li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors.">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).</li><li>Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+therapy:+Current+state+and+clinical+perspectives.">Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives.</a> Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).</li><li>Morishita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+microRNA-146a+with+polyethylenimine+nanoparticles+inhibits+renal+fibrosis+in+vivo.">Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).</li><li>Ishii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+diabetic+kidney+disease.">MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).</li><li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+acute+kidney+injury.">MicroRNA expression profiling in acute kidney injury.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).</li><li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+non-viral+gene+delivery+systems.">Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li><li>Swami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+and+highly+efficient+nonviral+DNA/siRNA+delivery+system+based+on+PEI-bisepoxide+nanoparticles.">A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).</li><li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+microRNA+expression+in+the+kidneys+of+immunoglobulin+a+nephropathic+mice.">Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535 (2020).</li><li>Yanai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+evaluation+of+microRNA+expressions+in+mouse+kidney+with+unilateral+ureteral+obstruction.">Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383 (2020).</li><li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+detection+method+for+microRNAs+in+the+kidney+of+an+ischemic+kidney+injury+mouse+model.">A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378 (2020).</li><li>Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+anti-fibrotic+activity+of+plasmid+DNA+expressing+small+interference+RNA+for+TGF-beta+type+II+receptor+for+a+mouse+model+of+obstructive+nephropathy+by+cationized+gelatin+prepared+from+different+amine+compounds.">Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).</li><li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+renal+tubulointerstitial+fibrosis+by+small+interfering+RNA+targeting+heat+shock+protein+47.">Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47.</a> American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+transfer+of+hepatocyte+growth+factor+to+skeletal+muscle+prevents+changes+in+rat+kidneys+after+5/6+nephrectomy.">In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy.</a> American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).</li><li>Hamar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+interfering+RNA+targeting+Fas+protects+mice+against+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).</li><li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenon+preconditioning+protects+against+renal+ischemic-reperfusion+injury+via+HIF-1alpha+activation.">Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+hairpin+RNA+knockdown+of+connective+tissue+growth+factor+by+ultrasound-targeted+microbubble+destruction+improves+renal+fibrosis.">Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).</li></ol>

Ved hjelp av protokollen som presenteres i dette manuskriptet, kan PEI-NP levere miRNA-etterligninger til nyrene for å indusere overekspresjon av mål-miRNA, noe som resulterer i behandlingseffekter i in vivo musemodeller av flere nyresykdommer, inkludert nyrefibrose, diabetisk nyresykdom og AKI.
Metoden for å forberede komplekset av PEI-NP og miRNA-etterligning er veldig enkel. Den positivt ladede overflaten av PEI-NP fanger miRNA-etterligningen når de bare blandes 13,14,15,16,17<...

miRNAer, små ikke-kodende RNA (21-25 baser) som ikke oversettes til proteiner, hemmer mange målbudbringer-RNA (mRNA) ved å destabilisere dem og hemme deres oversettelse i ulike nyresykdommer 1,2. Derfor er genterapi som bruker eksogene kunstig syntetiserte miRNA-etterligninger eller hemmere et potensielt nytt alternativ for å hemme utviklingen av mange nyresykdommer 3,4,5.
Til tross for løftet om miRNA-etterligninger eller hemmere for genterapi, er levering til målorganer fortsatt et stort hinder for in vivo-eksperimenter for å utvikle sitt kliniske potensial. Fordi kunstig syntetiserte miRNA-etterligninger eller hemmere er gjenstand for umiddelbar nedbrytning av serum-RNase, forkortes halveringstiden ved systemisk administrering in vivo6. I tillegg er effektiviteten til miRNA-etterligninger eller hemmere for å krysse plasmamembranen og transfekt cytoplasma generelt mye lavere uten passende vektorer 7,8. Disse bevisene tyder på at utviklingen av miRNA-etterlignings- eller inhibitorleveringssystemet for nyrene er nødvendig, for å muliggjøre bruk i kliniske omgivelser og gjøre dem til et nytt behandlingsalternativ for pasienter med ulike nyresykdommer.
Virale vektorer har blitt brukt som bærere for å levere eksogene miRNA-etterligninger eller hemmere til nyrene 9,10. Selv om de er utviklet for biosikkerhet og transfeksjonseffekt, kan virale vektorer fortsatt forårsake interferonrespons og/eller genetisk ustabilitet11,12. For å overvinne disse bekymringene utviklet vi et miRNA-etterligningssystem for nyrene ved hjelp av polyetylenimin nanopartikler (PEI-NP), en ikke-viral vektor, i flere musemodeller av nyresykdom13,14,15.
PEI-NP er lineære polymerbaserte NPer som effektivt kan levere oligonukleotider, inkludert miRNA-etterligninger, til nyrene, og anses å foretrekke for fremstilling av ikke-virale vektorer på grunn av deres langsiktige sikkerhet og biokompatibilitet13,16,17.
Denne studien demonstrerer effekten av systematisk eksogen miRNA-etterligning med PEI-NP via haleveneinjeksjon i nyrefibrosemodellmus produsert ved ensidig ureterobstruksjon (UUO). I tillegg demonstrerer vi effekten av systematisk eksogen miRNA-etterligning med PEI-NP via haleveneinjeksjon i diabetisk nyresykdomsmodellmus (db / db mus: C57BLKS / J Iar - + Lepr db / + Leprdb) og akutt nyreskade modell mus produsert av renal iskemi-reperfusjonsskade (IRI).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RPE</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3&#8217; (sense) 
			5&#8217;-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3&#8242; (antisense)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-labeled double-strand oligonucleotides</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>MIR7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories Inc</td>
			<td>FL-1321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo-jetPEI</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>101000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU 
			UT-3&#8242; (sense) 5&#8217;-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3&#8242; (antisense)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-146a-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001638</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Gene design</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG 
			GUU-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-181b-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00006083</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Gene design</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-5100-primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00042952</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)</td>
			<td>Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of exogenous artificially synthesized mirna mimic to the kidney using polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models

mikroRNA (miRNA), små ikke-kodende RNA (21-25 baser) som ikke oversettes til proteiner, hemmer mange målbudbringer-RNA (mRNA) ved å destabilisere og hemme deres oversettelse i ulike nyresykdommer. Derfor er veksling av miRNA-ekspresjon ved eksogene kunstig syntetiserte miRNA-etterligninger et potensielt nyttig behandlingsalternativ for å hemme utviklingen av mange nyresykdommer. Men fordi serum RNAase umiddelbart nedbryter systematisk administrerte eksogene miRNA-etterligninger in vivo, er levering av miRNA til nyrene fortsatt en utfordring. Derfor er vektorer som kan beskytte eksogene miRNA-etterligninger fra nedbrytning av RNAase og levere dem betydelig til nyrene, nødvendige. Mange studier har brukt virale vektorer for å levere eksogene miRNA-etterligninger eller hemmere til nyrene. Imidlertid kan virale vektorer forårsake interferonrespons og/eller genetisk ustabilitet. Derfor er utviklingen av virale vektorer også et hinder for klinisk bruk av eksogene miRNA-etterligninger eller hemmere. For å overvinne disse bekymringene angående virale vektorer, utviklet vi en ikke-viral vektormetode for å levere miRNA-etterligninger til nyrene ved hjelp av haleveneinjeksjon av polyetylenimin nanopartikler (PEI-NP), noe som førte til betydelig overekspresjon av målmiRNA i flere musemodeller av nyresykdom.

MålmiRNAene for nyrefibrose, diabetisk nefropati og AKI beskrevet nedenfor ble valgt basert på mikromatrise, qRT-PCR og / eller databaseforskning for genterapiapplikasjoner. For ytterligere detaljer, se tidligere publikasjoner13,14,15.
Levering og effekter av miRNA-146a-5p-etterligning ved bruk av PEI-NP i nyrefibrosemus13 Fluorescerende m...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models at JoVE.c

Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

Her leverer vi eksogene kunstig syntetiserte miRNA-etterligninger til nyrene via haleveneinjeksjon av en ikke-viral vektor og polyetylenimin nanopartikler i flere musemodeller for nyresykdom. Dette førte til betydelig overekspresjon av mål-miRNA i nyrene, noe som resulterte i hemmet progresjon av nyresykdom i flere musemodeller.

Levering av eksogent kunstig syntetisert miRNA-etterligning til nyrene ved bruk av polyetylenimin nanopartikler i flere musemodeller for nyresykdom

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...

Denne metoden kan bidra til å svare på sentrale spørsmål i terapi av mikroRNA til nyrene, noe som fortsatt er en utfordring. Den største fordelen med denne teknikken er at den muliggjør terapi av mikroRNA-etterligninger til nyrene uten å forårsake en interferonrespons eller genetisk ustabilitet. Begynn med å oppløse 10 mikroliter PEI-NP i 90 mikroliter 5% glukoseoppløsning i et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør.Deretter virvler røret forsiktig og spinner ned. Bland 50 mikroliter kunstig syntetiserte miRNA oppløst i 100 mikromolar nukleasefritt vann med 50 mikromolar 10% glukoseoppløsning i 1,5 milliliter mikrosentrifugerør. Virv røret forsiktig og spinn ned.Denne prosessen gir miRNA oppløst i 5% glukoseoppløsning. Bland deretter 100 mikroliter PEI-NP i 5% glukoseoppløsning og 100 mikroliter miRNA-etterligning i 5% glukoseoppløsning. Virv røret forsiktig og spinn ned.Inkuber blandingen i 15 minutter ved romtemperatur for å fremstille et stabilt kompleks av PEI-NPs miRNA-etterligning. Oppløs to mikroliter PEI-NP i 98 mikroliter 10% glukoseoppløsning i et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør. Virv røret forsiktig og spinn ned.Deretter tilsettes 100 mikroliter Cy3-merket miRNA-etterligning til 100 mikroliter PEI-NP i 10% glukoseoppløsning og virvler røret forsiktig. Inkuber blandingen i 15 minutter ved romtemperatur for å fremstille et stabilt kompleks av PEI-NPs-Cy3-merket-miRNA-etterligning. Plasser UUO-musen med hodet først i et 50 milliliter sentrifugerør uten bedøvelse, og legg deretter halen gjennom et forberedt hull i hetten.Fyll en en-milliliter sprøyte med en 30-gauge nål med 200 mikroliter PEI-NPs-Cy3-merket-miRNA-etterligne kompleks og injiser komplekset via musens haleåre. Deretter gjør du et snitt i huden, musklene og ribbeina med kirurgisk saks og tang for å avsløre hjertet. Etter å ha gjort et snitt i høyre atrium, injiser PBS i venstre ventrikkel til nyrefargen endres til blekgul.Dette indikerer at hele musekroppen er perfusert med PBS. Etter å ha samlet nyrene, fjern nyrekapslene og vask dem to ganger med PBS. Legg inn nyrevevsprøvene i OCT-forbindelsen og frys dem i flytende nitrogen.Bruk en kryostat til å forberede seksjoner og monter seksjonene på silanbelagte glassglassglass. Fest dem med 4% paraformaldehyd og vask lysbildene forsiktig to ganger med PBS. Til slutt, visualiser fluorescensfargingen ved fluorescensmikroskopi ved 100x og 400x forstørrelse og passende bildebehandlingsprogramvare.Det representative bildet viser strukturen til PEI-NPs-miRNA-etterligningskomplekset. Levering og effekter av miRNA-146a-5p-etterligning ved bruk av PEI-NP i nyrefibrose er avbildet i disse bildene. Fluorescerende mikroskopianalyse viste at hale-veneinjeksjon av PEI-NP kunne levere miRNA-etterligningen til tubulointerstitialt rom.I nyrefibrosemus produsert av UUO, inkluderte dette nyretubulære celler som ikke har en regelmessig form i nyrene og glomerulus. qRT-PCR-analyse viste at injeksjon av PEI-NP-miRNA-146a-5p-etterligning induserte signifikant overekspresjon av miRNA-146a-5p i nyrene. Den histologiske analysen med Sirius rød farging er vist her.Fluorescerende mikroskopianalyse viste at hale-veneinjeksjon av PEI-NP kunne levere miRNA-etterligning til glomerulus og tubulointerstitielt rom i nyrer av diabetiske nyremodellmus in vivo. I tillegg viste qRT-PCR-analysen at injeksjon av PEI-NP-miRNA-181b-5p-etterligning induserte signifikant overekspresjon av miRNA-181b-5p i nyrene. Histologisk analyse med periodisk syre-Schiff-farging viste at injeksjon av PEI-NPs-miRNA-181b-5p-etterligning en gang per uke fra 10 til 20 ukers alder hemmet utviklingen av diabetisk nyresykdom hos mus.Levering og effekter av PEI-NPs-miRNA-5100-etterligning i akutt nyreskade modell mus produsert av iskemi reperfusjonsskade er vist her. Dataene fra fluorescerende mikroskopianalyse qRT-PCR-analyse for å evaluere overekspresjonseffektene av miRNA-5100 etter injeksjon av PEI-NPs-miRNA-5100-etterligning og den histologiske analysen av hematoksylin-eosinfarget nyre er avbildet i disse bildene. PEI-NP injisert via halen venen to dager før iskemi reperfusjonsskade, eller IRI, prosedyre forhindre akutt nyreskade progresjon indusert av IRI.Når du utfører denne teknikken, må du forberede fem mikrometer tykke seksjoner som inkluderer så mye nyrevev som mulig. Du kan også forberede syv mikrometer tykke seksjoner.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Spectral Karyotyping å studere kromosomfeil i mennesker og mus med polycystisk nyresykdom

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Vurdering av vaskulær funksjon hos pasienter med kronisk nyresykdom

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

En Mulig Sebrafisk Modell av Polycystisk Nyresykdom: knockdown av<em&gt; Wnt5a</em&gt; Årsaker Cyster i sebrafisk Nyrer

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Mus nyretransplanterte: Modeller av allograft-avstøting

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Bruk av Ultra-high Feltet MR i smågnager modeller av Polycystisk nyresykdom for<em&gt; I Vivo</em&gt; Fenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Murine Kidney Transplant Technique

Muse Kidney Transplant Technique

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normotermisk<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Nyre Perfusjons for Bevaring av Kidney grafts før Transplantasjon

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney

Intravaskulær Levering av Biologics til Rat Nyre

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Vurdering av nyrefunksjon i musen modeller av Glomerular sykdom

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...