Name: delivery of exogenous artificially synthesized mirna mimic to the kidney using polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models at JoVE.c

Detta arbete stöddes delvis av JSPS KAKENHI (bidrag nr 21K08233). Vi tackar Edanz (https://jp.edanz.com/ac) för redigeringen av utkast till detta manuskript.

Alla djurförsöksprotokoll godkändes av djuretikkommittén vid Jichi Medical University och utfördes i enlighet med riktlinjer för användning och vård av försöksdjur från Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals. Här demonstrerade vi miRNA-efterlikning leverans till njuren vilket resulterade i dess överuttryck med UUO-möss. Denna studie godkändes av etikkommittén vid Jichi Medical University [godkännande nr 19-12 för njurfibros, 17-024 för akut njurinfektion (AKI) och 19-11 för diabetisk ne...

<ol>
	<li>Mohr, A. M., Mott, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+microRNA+biology.">Overview of microRNA biology.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).</li><li>Bushati, N., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+functions.">microRNA functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).</li><li>Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs+in+diabetic+nephropathy:+From+biomarkers+to+therapy.">microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy.</a> Current Diabetes Reports. 16 (3), 35 (2016).</li><li>Yheskel, M., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+microRNAs+in+polycystic+kidney+disease.">Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+revolution:+RNA+interference+as+basic+biology,+research+tool,+and+therapeutic.">The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic.</a> Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+treatment:+siRNAs+as+small+molecule+drugs.">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li><li>Stewart, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells.">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li><li>Deng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klotho+gene+delivery+ameliorates+renal+hypertrophy+and+fibrosis+in+streptozotocin-induced+diabetic+rats+by+suppressing+the+Rho-associated+coiled-coil+kinase+signaling+pathway.">Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressor+of+cytokine+signaling+(SOCS)+2+attenuates+renal+lesions+in+rats+with+diabetic+nephropathy.">Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy.</a> Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).</li><li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors.">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).</li><li>Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+therapy:+Current+state+and+clinical+perspectives.">Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives.</a> Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).</li><li>Morishita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+microRNA-146a+with+polyethylenimine+nanoparticles+inhibits+renal+fibrosis+in+vivo.">Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).</li><li>Ishii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+diabetic+kidney+disease.">MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).</li><li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+acute+kidney+injury.">MicroRNA expression profiling in acute kidney injury.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).</li><li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+non-viral+gene+delivery+systems.">Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li><li>Swami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+and+highly+efficient+nonviral+DNA/siRNA+delivery+system+based+on+PEI-bisepoxide+nanoparticles.">A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).</li><li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+microRNA+expression+in+the+kidneys+of+immunoglobulin+a+nephropathic+mice.">Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535 (2020).</li><li>Yanai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+evaluation+of+microRNA+expressions+in+mouse+kidney+with+unilateral+ureteral+obstruction.">Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383 (2020).</li><li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+detection+method+for+microRNAs+in+the+kidney+of+an+ischemic+kidney+injury+mouse+model.">A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378 (2020).</li><li>Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+anti-fibrotic+activity+of+plasmid+DNA+expressing+small+interference+RNA+for+TGF-beta+type+II+receptor+for+a+mouse+model+of+obstructive+nephropathy+by+cationized+gelatin+prepared+from+different+amine+compounds.">Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).</li><li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+renal+tubulointerstitial+fibrosis+by+small+interfering+RNA+targeting+heat+shock+protein+47.">Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47.</a> American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+transfer+of+hepatocyte+growth+factor+to+skeletal+muscle+prevents+changes+in+rat+kidneys+after+5/6+nephrectomy.">In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy.</a> American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).</li><li>Hamar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+interfering+RNA+targeting+Fas+protects+mice+against+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).</li><li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenon+preconditioning+protects+against+renal+ischemic-reperfusion+injury+via+HIF-1alpha+activation.">Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+hairpin+RNA+knockdown+of+connective+tissue+growth+factor+by+ultrasound-targeted+microbubble+destruction+improves+renal+fibrosis.">Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).</li></ol>

Med hjälp av protokollet som presenteras i detta manuskript kan PEI-NPs leverera miRNA-efterlikningar till njurarna för att inducera överuttryck av mål-miRNA, vilket resulterar i behandlingseffekter i in vivo-musmodeller av flera njursjukdomar, inklusive njurfibros, diabetisk njursjukdom och AKI.
Metoden för att förbereda komplexet av PEI-NP och miRNA-efterlikning är mycket enkel. Den positivt laddade ytan av PEI-NPs fångar miRNA-efterlikningen när de bara blandas 13,14,15,1...

miRNA, små icke-kodande RNA (21-25 baser) som inte översätts till proteiner, hämmar massor av målbudbärar-RNA (mRNA) genom att destabilisera dem och hämma deras översättning vid olika njursjukdomar 1,2. Därför är genterapi som använder exogena artificiellt syntetiserade miRNA-härmningar eller hämmare ett potentiellt nytt alternativ för att hämma utvecklingen av många njursjukdomar 3,4,5.
Trots löftet om miRNA-efterlikningar eller hämmare för genterapi är leverans till målorgan fortfarande ett stort hinder för in vivo-experiment att utveckla sin kliniska potential. Eftersom artificiellt syntetiserade miRNA-härmningar eller hämmare utsätts för omedelbar nedbrytning av serum-RNas, förkortas deras halveringstid vid systemisk administrering in vivo6. Dessutom är effektiviteten hos miRNA-härmningar eller hämmare att passera plasmamembranet och transfekt cytoplasma i allmänhet mycket lägre utan lämpliga vektorer 7,8. Dessa bevislinjer tyder på att utvecklingen av miRNA-efterlikningar eller inhibitorer leveranssystem för njuren krävs för att möjliggöra deras användning i kliniska miljöer och göra dem till ett nytt behandlingsalternativ för patienter med olika njursjukdomar.
Virala vektorer har använts som bärare för att leverera exogena miRNA-härmar eller hämmare till njuren 9,10. Även om de har utvecklats för biosäkerhet och transfektionseffekt kan virala vektorer fortfarande orsaka interferonrespons och/eller genetisk instabilitet11,12. För att övervinna dessa problem utvecklade vi ett miRNA-efterliknande leveranssystem för njurarna med hjälp av polyetyleniminnanopartiklar (PEI-NP), en icke-viral vektor, i flera musmodeller av njursjukdom13,14,15.
PEI-NP är linjära polymerbaserade NP som effektivt kan leverera oligonukleotider, inklusive miRNA-efterlikningar, till njurarna och anses vara att föredra för framställning av icke-virala vektorer på grund av deras långsiktiga säkerhet och biokompatibilitet13,16,17.
Denna studie visar effekterna av systematiska exogena miRNA-efterliknar leverans med PEI-NPs via svansveninjektion hos njurfibrosmodellmöss producerade av ensidig urinledarobstruktion (UUO). Dessutom demonstrerar vi effekterna av systematisk exogen miRNA-mimisk leverans med PEI-NPs via svansveninjektion hos diabetiska njursjukdomsmodellmöss (db / db-möss: C57BLKS / J Iar -+Lepr db / + Leprdb) och akuta njurskademodellmöss producerade av njurischemi-reperfusionsskada (IRI).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RPE</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3&#8217; (sense) 
			5&#8217;-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3&#8242; (antisense)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-labeled double-strand oligonucleotides</td>
			<td>Takara Bio Inc.</td>
			<td>MIR7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories Inc</td>
			<td>FL-1321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo-jetPEI</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>101000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU 
			UT-3&#8242; (sense) 5&#8217;-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3&#8242; (antisense)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-146a-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001638</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Gene design</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG 
			GUU-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-181b-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00006083</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA)</td>
			<td>Gene design</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td>5&#8217;-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-5100-primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00042952</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)</td>
			<td>Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of exogenous artificially synthesized mirna mimic to the kidney using polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models

mikroRNA (miRNA), små icke-kodande RNA (21-25 baser) som inte översätts till proteiner, hämmar massor av målbudbärar-RNA (mRNA) genom att destabilisera och hämma deras översättning vid olika njursjukdomar. Därför är växling av miRNA-uttryck genom exogent artificiellt syntetiserat miRNA-härmningar ett potentiellt användbart behandlingsalternativ för att hämma utvecklingen av många njursjukdomar. Men eftersom serum-RNAas omedelbart bryts ned systematiskt administrerade exogena miRNA-härmar in vivo, är leverans av miRNA till njurarna fortfarande en utmaning. Därför är vektorer som kan skydda exogena miRNA-efterlikningar från nedbrytning av RNAas och signifikant leverera dem till njurarna nödvändiga. Många studier har använt virala vektorer för att leverera exogena miRNA-härmningar eller hämmare till njurarna. Virala vektorer kan dock orsaka interferonrespons och/eller genetisk instabilitet. Därför är utvecklingen av virala vektorer också ett hinder för klinisk användning av exogena miRNA-härmningar eller hämmare. För att övervinna dessa problem med virala vektorer utvecklade vi en icke-viral vektormetod för att leverera miRNA-efterlikningar till njurarna med hjälp av svansveninjektion av polyetyleniminnanopartiklar (PEI-NP), vilket ledde till signifikant överuttryck av målmiRNA i flera musmodeller av njursjukdom.

Mål-miRNA för njurfibros, diabetesnefropati och AKI som beskrivs nedan valdes baserat på mikroarray, qRT-PCR och / eller databasforskning för genterapiapplikationer. För ytterligare detaljer, se tidigare publikationer13,14,15.
Leverans och effekter av miRNA-146a-5p-mimic med PEI-NPs i njurfibrosmöss13 Fluorescerande mikroskopianalys vi...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models at JoVE.c

Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

Här levererar vi exogent artificiellt syntetiserade miRNA-efterlikningar till njurarna via svansveninjektion av en icke-viral vektor och polyetyleniminnanopartiklar i flera musmodeller för njursjukdom. Detta ledde till signifikant överuttryck av mål-miRNA i njurarna, vilket resulterade i hämmad progression av njursjukdom i flera musmodeller.

Leverans av exogent artificiellt syntetiserat miRNA-efterlikning till njurarna med användning av polyetyleniminnanopartiklar i flera musmodeller för njursjukdom

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...

Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor vid behandling av mikroRNA till njurarna, vilket fortfarande är en utmaning. Den största fördelen med denna teknik är att den möjliggör behandling av mikroRNA-härmningar till njurarna utan att orsaka interferonrespons eller genetisk instabilitet. Börja med att lösa upp 10 mikroliter PEI-NP i 90 mikroliter 5% glukoslösning i ett 1,5-milliliter mikrocentrifugrör.Vortex sedan röret försiktigt och snurra ner. Blanda 50 mikroliter artificiellt syntetiserade miRNA upplösta i 100 mikromolar nukleasfritt vatten med 50 mikromolar 10% glukoslösning i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Vortex röret försiktigt och snurra ner.Denna process ger miRNA upplöst i 5% glukoslösning. Blanda sedan 100 mikroliter PEI-NP i 5% glukoslösning och 100 mikroliter miRNA efterlikna i 5% glukoslösning. Vortex röret försiktigt och snurra ner.Inkubera blandningen i 15 minuter vid rumstemperatur för att framställa ett stabilt komplex av PEI-NPs miRNA-efterlikna. Lös upp två mikroliter PEI-NP i 98 mikroliter 10% glukoslösning i ett 1,5-milliliter mikrocentrifugrör. Vortex röret försiktigt och snurra ner.Tillsätt sedan 100 mikroliter Cy3-märkt miRNA-efterlikning till 100 mikroliter PEI-NP i 10% glukoslösning och virvla röret försiktigt. Inkubera blandningen i 15 minuter vid rumstemperatur för att framställa ett stabilt komplex av PEI-NPs-Cy3-märkt-miRNA-mimic. Placera UUO-musen med huvudet först i ett 50-milliliters centrifugrör utan anestesi och placera sedan svansen genom ett förberett hål i locket.Fyll en en-milliliter spruta med en 30-gauge nål med 200 mikroliter PEI-NPs-Cy3-märkt-miRNA-mimic-komplex och injicera komplexet via musens svansven. Gör sedan ett snitt i huden, musklerna och revbenen med kirurgisk sax och pincett för att exponera hjärtat. Efter att ha gjort ett snitt i höger förmak, injicera PBS i vänster kammare tills njurfärgen ändras till blekgul.Detta indikerar att hela muskroppen är perfuserad med PBS. Efter insamling av njurarna, ta bort njurkapslarna och tvätta dem två gånger med PBS. Bädda in njurvävnadsproverna i OCT-förening och frys dem i flytande kväve.Använd en kryostat för att förbereda sektioner och montera sektionerna på silanbelagda glasskivor. Fixa dem med 4% paraformaldehyd och tvätta försiktigt bilderna två gånger med PBS. Slutligen visualisera fluorescensfärgningen genom fluorescensmikroskopi vid 100x och 400x förstoring och lämplig bildprogramvara.Den representativa bilden visar strukturen hos PEI-NPs-miRNA-mimic-komplexet. Leveransen och effekterna av miRNA-146a-5p-mimic med PEI-NPs vid njurfibros visas i dessa bilder. Fluorescerande mikroskopianalys visade att svansveninjektion av PEI-NP kunde leverera miRNA-efterlikningen till tubulointerstitiellt utrymme.Hos njurfibrosmöss producerade av UUUO inkluderade detta renala tubulära celler som inte har en regelbunden form i njurarna och glomerulus. qRT-PCR-analys visade att injektion av PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic inducerade signifikant överuttryck av miRNA-146a-5p i njurarna. Den histologiska analysen med Sirius rödfärgning visas här.Fluorescerande mikroskopianalys visade att svansveninjektion av PEI-NPs kunde leverera miRNA-efterlikning till glomerulus och tubulointerstitiellt utrymme i njurar hos diabetiska njurmodellmöss in vivo. Dessutom visade qRT-PCR-analysen att injektion av PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic inducerade signifikant överuttryck av miRNA-181b-5p i njurarna. Histologisk analys med periodisk syra-Schiff-färgning visade att injektion av PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic en gång per vecka från 10 till 20 veckors ålder hämmade utvecklingen av diabetisk njursjukdom hos möss.Leverans och effekter av PEI-NPs-miRNA-5100-mimic i akut njurskada modellmöss producerade av ischemireperfusionsskada visas här. Data från den fluorescerande mikroskopianalysen qRT-PCR-analys för att utvärdera överuttryckseffekterna av miRNA-5100 efter injektion av PEI-NPs-miRNA-5100-mimic och den histologiska analysen av hematoxylin-eosinfärgad njure visas i dessa bilder. PEI-NPs injicerade via svansvenen två dagar före ischemireperfusionsskadan, eller IRI, procedur förhindrar akut njurskada progression inducerad av IRI.När du utför denna teknik, förbered fem mikrometer tjocka sektioner som innehåller så mycket njurvävnad som möjligt. Du kan också förbereda sju mikrometer tjocka sektioner.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

En metod för Murine Islet Isolering och subkapsulär Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Spectral karyotypering att studera kromosomavvikelser hos människor och möss med polycystisk njursjukdom

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Bedömning av kärlfunktionen hos patienter med kronisk njursjukdom

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

En möjlig Zebrafish Modell av polycystisk njursjukdom: Knockdown av<em&gt; Wnt5a</em&gt; Orsaker Cystor i Zebrafish Njurar

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Mus Njurtransplantation: Modeller av allograftavstötning

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Användning av ultrahög Field MRI i Small Gnagare Modeller av polycystisk njursjukdom för<em&gt; In Vivo</em&gt; Fenotypning och narkotikamissbruk

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Murine Kidney Transplant Technique

Murin njurtransplantation Teknik

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normotermisk<em&gt; Ex vivo</em&gt; Njure Perfusion för bevarandet av Njure transplantat före transplantation

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney

Intravaskulär Leverans av Biologics till råttnjure

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Bedömning av njurfunktion i musmodeller av glomerulär sjukdom

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...