Name: terminal h-reflex measurements in mice
Uploaded: 2022-06-16T12:30:00
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Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno di T. Akay, Dalhousie University, durante una visita di MG al suo laboratorio. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Fondazione Friebe (T0498/28960/16) e della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) - Project-ID 431549029 - SFB 1451.

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le leggi europee e nazionali sulla cura degli animali e le linee guida istituzionali e sono stati approvati dal Landesamt für Natur-, Umwelt-, und Verbraucherschutz North Rhine-Westfalia (Az: 81-02.04.2019.A309). Il protocollo è ottimizzato per topi adulti (topi C57Bl/6J di circa 8-16 settimane) e per la registrazione degli arti anteriori. Può essere facilmente adattato stimolando i rispettivi nervi dell'arto posteriore e registrando i muscoli della zampa po...

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	<li>Palmieri, R. M., Ingersoll, C. D., Hoffman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hoffmann+reflex:+methodologic+considerations+and+applications+for+use+in+sports+medicine+and+athletic+training+research.">The Hoffmann reflex: methodologic considerations and applications for use in sports medicine and athletic training research.</a> Journal of Athletic Training. 39 (3), 268-277 (2004).</li><li>Henneman, E., Somjen, G., Carpenter, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitability+and+inhibitibility+of+motoneurons+of+different+sizes.">Excitability and inhibitibility of motoneurons of different sizes.</a> Journal of Neurophysiology. 28 (3), 599-620 (1965).</li><li>Toda, T., Ishida, K., Kiyama, H., Yamashita, T., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+KCC2+expression+and+phosphorylation+in+motoneurons,+and+increases+the+number+of+in+primary+afferent+projections+to+motoneurons+in+mice+with+post-stroke+spasticity.">Down-regulation of KCC2 expression and phosphorylation in motoneurons, and increases the number of in primary afferent projections to motoneurons in mice with post-stroke spasticity.</a> PLoS ONE. 9 (12), 114328 (2014).</li><li>Lee, S., Toda, T., Kiyama, H., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weakened+rate-dependent+depression+of+Hoffmann&#8217;s+reflex+and+increased+motoneuron+hyperactivity+after+motor+cortical+infarction+in+mice.">Weakened rate-dependent depression of Hoffmann&#8217;s reflex and increased motoneuron hyperactivity after motor cortical infarction in mice.</a> Cell Death &amp; Disease. 5 (1), 1007 (2014).</li><li>Knikou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+H-reflex+as+a+probe:+Pathways+and+pitfalls.">The H-reflex as a probe: Pathways and pitfalls.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 1-12 (2008).</li><li>Wieters, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+spasticity+and+related+mouse+models.">Introduction to spasticity and related mouse models.</a> Experimental Neurology. 335, 113491 (2020).</li><li>Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+electrode+configuration+for+recording+electromyographic+activity+in+behaving+mice.">A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 36-42 (2005).</li><li>Akay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+measurement+of+muscle+denervation+and+locomotor+behavior+in+individual+wild-type+and+ALS+model+mice.">Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice.</a> Journal of Neurophysiology. 111 (3), 694-703 (2014).</li><li>Haghighi, S. S., Green, D. K., Oro, J. J., Drake, R. K., Kracke, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depressive+effect+of+isoflurane+anesthesia+on+motor+evoked+potentials.">Depressive effect of isoflurane anesthesia on motor evoked potentials.</a> Neurosurgery. 26 (6), 993 (1990).</li><li>Chang, H. -. Y., Havton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+urethane+and+isoflurane+on+external+urethral+sphincter+electromyography+and+cystometry+in+rats.">Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 295 (4), 1248-1253 (2008).</li><li>Nolan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+4:+Nervous+system+(Br.+J.+Pharmacol).">Section 4: Nervous system (Br. J. Pharmacol).</a> Clinical pharmacology. , 295-310 (2012).</li><li>Struck, M. B., Andrutis, K. A., Ramirez, H. E., Battles, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+short-term+fast+on+ketamine-xylazine+anesthesia+in+rats.">Effect of a short-term fast on ketamine-xylazine anesthesia in rats.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (3), 344-348 (2011).</li><li>Zandieh, S., Hopf, R., Redl, H., Schlag, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ketamine/xylazine+anesthesia+on+sensory+and+motor+evoked+potentials+in+the+rat.">The effect of ketamine/xylazine anesthesia on sensory and motor evoked potentials in the rat.</a> Spinal Cord. 41 (1), 16-22 (2003).</li></ol>

A differenza delle misurazioni del riflesso H transcutaneo precedentemente descritte nel topo6, forniamo una misurazione più diretta e specifica per il nervo. Questo nuovo approccio può essere applicato ai nervi dell'arto anteriore e posteriore (ad esempio, i nervi mediano, ulnare e radiale, e i nervi tibiale e sciatico, rispettivamente), rendendo questo metodo adattabile come strumento diagnostico a molti modelli di malattia (ad esempio, ictus, sclerosi multipla, sclerosi laterale amiotrofica, ...

Il riflesso di Hoffmann (riflesso H), dal nome del fisiologo Paul Hoffmann, può essere evocato dalla stimolazione elettrica dei nervi periferici, che trasportano assoni di neuroni sensoriali e motori che derivano e portano agli stessi muscoli. È l'analogo indotto elettricamente del riflesso di allungamento monosinaptico e condivide lo stesso percorso1. A differenza dell'allungamento muscolare, il riflesso H deriva dalla stimolazione elettrica. Quando i nervi periferici sono stimolati elettricamente a bassa intensità di corrente, le fibre afferenti Ia sono tipicamente depolarizzate prima a causa del loro grande diametro assone2. I loro potenziali d'azione eccitano i motoneuroni alfa (αMN) nel midollo spinale, che a loro volta suscitano potenziali d'azione che viaggiano lungo gli assoni αMN verso il muscolo (Figura 1). Questa cascata genera una risposta muscolare con piccola ampiezza, riflessa nella cosiddetta onda H. Aumentando gradualmente l'intensità dello stimolo, l'ampiezza dell'onda H aumenta a causa del reclutamento di unità motorie aggiuntive. Da una certa intensità di stimolo, i potenziali d'azione negli assoni più sottili degli αMN vengono suscitati direttamente, che viene registrata come onda M. Questa onda M appare con una latenza più breve rispetto all'onda H (Figura 2). Se l'intensità della stimolazione aumenta ulteriormente, l'ampiezza dell'onda M diventa maggiore a causa del reclutamento di più assoni αMN, mentre l'onda H diventa gradualmente più piccola. L'onda H può essere soppressa ad alte intensità di stimolo a causa della retropropagazione antidromica dei potenziali d'azione negli assoni αMN. Questi potenziali d'azione innescati si scontrano con quelli della stimolazione Ia e possono quindi annullarsi a vicenda. A intensità di stimolo sovramassimali, i potenziali d'azione ortodromici (verso il muscolo) e antidromici (verso il midollo spinale) si verificano in tutti gli assoni MN; il primo dà origine all'ampiezza massima dell'onda M (Mmax), mentre il secondo comporta la completa abolizione del riflesso H3.
Per la valutazione della spasticità post-ictus (PSS) o della lesione del midollo spinale (SCI), il riflesso H è stato utilizzato per valutare le basi neurali del movimento e della spasticità nell'uomo1. Una migliore quantificazione della variazione del riflesso H tra le misurazioni e tra i soggetti si ottiene utilizzando il rapporto tra l'onda H e l'onda M (rapporto H/M). In alternativa, viene misurata la depressione dipendente dalla velocità (RDD), utilizzando un insieme di frequenze ascendenti (ad esempio, 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 e 5,0 Hz). L'RDD riflette l'integrità dei circuiti inibitori che possono essere disturbati da ictus o SCI. Quando tutti i circuiti neurali sono intatti, c'è una soppressione uniforme e indipendente dalla frequenza del riflesso H. Tuttavia, se vi è una ridotta inibizione neurale a causa di ictus o SCI, la soppressione del riflesso H diminuisce con l'aumentare della frequenza di stimolazione4.
La corretta registrazione elettrofisiologica mediante elettrodi di superficie può essere difficile e può essere influenzata da compiti motori, meccanismi inibitori ed eccitabilità αMN5. Nella registrazione transcutanea nei roditori, un elettrodo di stimolo viene posizionato vicino al nervo tibiale e un elettrodo di registrazione viene posizionato vicino ai muscoli correlati nella zampa anteriore. Secondo la nostra esperienza, tuttavia, il corretto posizionamento degli elettrodi transcutanei (Figura 1A) è ancora più complesso e variabile nei roditori rispetto al posizionamento degli elettrodi di superficie nell'uomo. Ciò può portare a differenze di lunghezza, frequenza e intensità di stimolazione necessarie per suscitare il riflesso H. Queste sfide metodologiche potrebbero spiegare perché ci sono solo un numero molto limitato di studi di misurazione del riflesso H (ad esempio, nei modelli sperimentali di ictus 3,4 e in altri modelli di spasticità6. Una stimolazione precisa (a lungo termine) e la registrazione del riflesso H sui singoli nervi potrebbero, in linea di principio, essere ottenute utilizzando elettrodi impiantabili che circondano il nervo bersaglio 7,8. A causa dell'impegnativo intervento chirurgico con potenziali effetti collaterali per l'animale e la potenziale instabilità della sonda, questo approccio non è diventato uno standard nel campo. Il metodo qui presentato richiede anche alcune competenze chirurgiche. Tuttavia, consente una stimolazione e una registrazione nuove e precise di nervi isolati in vivo utilizzando basse intensità di stimolazione, che evita la stimolazione simultanea dei nervi vicini.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent underpad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-0684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD converter</td>
			<td>Cambridge Electronic Design, UK</td>
			<td>CED 1401micro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Workshop Zoological Institute, UoC</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital stimulator</td>
			<td>Workshop Zoological Institute, UoC</td>
			<td>MS 501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMG electrodes</td>
			<td>Workshop Zoological Institute, UoC</td>
			<td></td>
			<td>Two twisted, insulated copper wires (50 &#181;m outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Bepanthen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Workshop Zoological Institute, UoC</td>
			<td>-</td>
			<td>Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating box</td>
			<td>MediHeat</td>
			<td>MediHeat V1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>WPI</td>
			<td>61840 Heating pad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hook electrodes</td>
			<td>Workshop Zoological Institute, UoC</td>
			<td>-</td>
			<td>To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>Ketavet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectal probe</td>
			<td>WPI</td>
			<td>RET-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator isolation unit</td>
			<td>Workshop Zoological Institute, UoC</td>
			<td>MI 401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer</td>
			<td>CellPoint Scientific</td>
			<td>Germinator 500</td>
			<td>Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260&#176;C).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>ATC200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

terminal h-reflex measurements in mice

Il riflesso di Hoffmann (H-reflex), come analogo elettrico del riflesso di allungamento, consente la convalida elettrofisiologica dell'integrità dei circuiti neurali dopo lesioni come danni al midollo spinale o ictus. Un aumento della risposta H-riflessa, insieme a sintomi come contrazioni muscolari non volontarie, riflesso di allungamento patologicamente aumentato e ipertonia nel muscolo corrispondente, è un indicatore di spasticità post-ictus (PSS).
In contrasto con le misurazioni transcutanee piuttosto aspecifiche del nervo, qui, presentiamo un protocollo per quantificare il riflesso H direttamente ai nervi ulnare e mediano della zampa anteriore, che è applicabile, con piccole modifiche, al nervo tibiale e sciatico della zampa posteriore. Basato sulla stimolazione diretta e l'adattamento a diversi nervi, il metodo rappresenta uno strumento affidabile e versatile per convalidare i cambiamenti elettrofisiologici nei modelli di malattia correlati alla spasticità.

Da n = 15 prove di stimolazione per frequenza di stimolazione e zampa, selezionare almeno n = 10 registrazioni di successo per l'analisi. Le prove con errori di misurazione (ad esempio, onda M mancante) sono escluse dall'analisi. Analizza ogni prova separatamente e genera una media per i confronti di gruppo / tempo in seguito. La latenza tra la stimolazione e la comparsa dell'onda M e dell'onda H viene registrata per ogni prova. Nella nostra esperienza, l'onda M si verifica circa 2 ms dopo la stimolazione e l'onda H dopo...

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Terminal H-reflex Measurements in Mice

La valutazione clinica della spasticità basata sul riflesso di Hoffmann (H-reflex) e utilizzando la stimolazione elettrica dei nervi periferici è un metodo consolidato. Qui, forniamo un protocollo per una stimolazione nervosa terminale e diretta per la quantificazione del riflesso H nella zampa anteriore del topo.

Misurazioni del riflesso H terminale nei topi

The Hoffmann reflex (H-reflex), as an electrical analog to the stretch reflex, allows electrophysiological validation of the integrity of neural circuits ...

Il riflesso H consente la validazione elettrofisiologica dell'integrità dei neurocircuiti. Presentiamo un protocollo terminale per quantificare il riflesso H direttamente ai nervi della zampa anteriore nei topi. A differenza delle registrazioni transcutanee convenzionali piuttosto nervose, i risultati sono meno variabili tra topi e giorni di misurazione.Simile alle registrazioni H-reflex nei pazienti, poiché la quantificazione precisa consente la caratterizzazione elettrofisiologica in modelli di malattia, ad esempio lesioni del midollo spinale e ictus. Il protocollo richiede solide competenze sperimentali nel lavorare con le apparecchiature chirurgiche nei topi.Se non sei sicuro di come separare i nervi dal tessuto connettivo e dai vasi sanguigni, pratica prima. A dimostrare la procedura sarà Frederique Wieters, una dottoranda del mio laboratorio. Per iniziare, posizionare il topo adulto anestetizzato C57 nero/6J di età compresa tra 8 e 16 settimane sul termoforo coperto e attendere che il topo sia calmo, la respirazione sia stabile e i riflessi siano assenti.Gira il mouse sul dorso. Quindi, fissare le zampe anteriori con del nastro adesivo. Posizionare il nastro in modo tale che gli elettrodi di misurazione siano facilmente inseriti nelle zampe anteriori.Per misurare la temperatura di un mouse inserire una sonda rettale e fissarla con del nastro adesivo. Applicare un unguento per gli occhi per evitare che gli occhi si secchino. Rimuovere accuratamente la pelliccia con un paio di forbici sottili e arrotondate mentre si solleva la pelle con una pinzetta.Successivamente, fai un'incisione di un centimetro nella pelle lungo l'asse ventroposteriore della zampa anteriore con un paio di forbici sottili e arrotondate. Rimuovere con attenzione il tessuto connettivo ed esporre il muscolo e il nervo sottostanti. Quindi rimuovere il muscolo pettorale profondo esposto usando una pinza per valutare il nervo mediano.Rimuovere piccole quantità di sangue e fluido tissutale con carta da tessuto molle. Quindi, tagliare con cura il seno o il muscolo ascellare dall'alto verso il basso per esporre il fascio nervoso. Liberare il fascio nervoso dal tessuto connettivo e muscolare per una lunghezza di circa 1,5 centimetri.Separare attentamente il nervo ulnare e mediano della zampa anteriore usando una pipetta di vetro piegata. Il nervo superiore è il nervo ulnare e il nervo inferiore è il nervo mediano. Disporre gli elettrodi del gancio dello stimolatore in parallelo a una distanza da 0,5 a un millimetro e utilizzare un micromanipolatore per posizionare il doppio gancio vicino al nervo.Utilizzare il gancio di vetro per sollevare il nervo ulnare sugli elettrodi del gancio di stimolazione. Quindi, tirare indietro l'elettrodo con il nervo e separarlo dagli altri nervi. Posizionare gli elettrodi lungo l'asse lungo della zampa per ridurre la diafonia tra i muscoli.Asciugare superficialmente i ganci degli elettrodi attaccati al nervo e applicare vaselina usando una siringa per fornire isolamento elettrico dal tessuto adiacente. Per misurare il riflesso H, posizionare gli elettrodi elettromiografici per via intramuscolare nella zampa anteriore. Quindi, posizionare l'elettrodo di riferimento per via sottocutanea nell'arto posteriore, tenuto da una clip a coccodrillo in miniatura.Quando lo stimolatore è acceso, osservare una stimolazione riuscita come piccole contrazioni della zampa anteriore. La corrente minima di stimolazione per suscitare l'onda M e le piccole contrazioni visibili nella zampa anteriore sono comprese tra 10 e 50 microampere. Eseguire la stimolazione nervosa 15 volte con impulsi lunghi 0,2 millisecondi ciascuno.Con pause di due minuti tra i set di stimoli, la frequenza viene aumentata da 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 a 5 hertz. Un'illustrazione della registrazione impostata nei percorsi per misurare il riflesso di Hoffman e la risposta muscolare è mostrata qui. È stato valutato il rapporto tra l'ampiezza dell'onda H e M.Lo stimolo e il rispettivo artefatto di stimolazione sono stati impostati a zero millisecondi, seguiti dall'onda M diretta e dal successivo picco più piccolo che rappresenta l'onda H. L'onda M si verifica circa due millisecondi dopo la stimolazione e l'onda H dopo sei-otto millisecondi a causa del tempo di transito più lungo attraverso il midollo spinale. Accanto alla separazione dei nervi, l'applicazione della vaselina all'elettrodo e anche tra i due ganci è fondamentale.Questo è un esperimento terminale. Nel nostro laboratorio, questa tecnica ha fornito un nuovo riferimento gold standard per le registrazioni transcutanee del riflesso H.

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