Name: terminal h-reflex measurements in mice
Uploaded: 2022-06-16T12:30:00
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Os autores agradecem o apoio de T. Akay, da Dalhousie University, durante uma visita de MG ao seu laboratório. Este trabalho foi financiado pela Fundação Friebe (T0498/28960/16) e pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação Alemã de Pesquisa) - Project-ID 431549029 - SFB 1451.

Todos os experimentos foram conduzidos em conformidade com as leis europeias e nacionais de cuidados com animais e diretrizes institucionais, e foram aprovados pelo Landesamt für Natur-, Umwelt-, und Verbraucherschutz North Rhine-Westphalia (Az: 81-02.04.2019.A309). O protocolo é otimizado para camundongos adultos (aprox. 8-16 semanas de idade C57Bl/6J) e para o registro do membro torácico. Pode ser facilmente adaptado, estimulando-se os respectivos nervos do membro pélvico e registrando-se os músculos da pata trase...

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	<li>Palmieri, R. M., Ingersoll, C. D., Hoffman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hoffmann+reflex:+methodologic+considerations+and+applications+for+use+in+sports+medicine+and+athletic+training+research.">The Hoffmann reflex: methodologic considerations and applications for use in sports medicine and athletic training research.</a> Journal of Athletic Training. 39 (3), 268-277 (2004).</li><li>Henneman, E., Somjen, G., Carpenter, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitability+and+inhibitibility+of+motoneurons+of+different+sizes.">Excitability and inhibitibility of motoneurons of different sizes.</a> Journal of Neurophysiology. 28 (3), 599-620 (1965).</li><li>Toda, T., Ishida, K., Kiyama, H., Yamashita, T., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+KCC2+expression+and+phosphorylation+in+motoneurons,+and+increases+the+number+of+in+primary+afferent+projections+to+motoneurons+in+mice+with+post-stroke+spasticity.">Down-regulation of KCC2 expression and phosphorylation in motoneurons, and increases the number of in primary afferent projections to motoneurons in mice with post-stroke spasticity.</a> PLoS ONE. 9 (12), 114328 (2014).</li><li>Lee, S., Toda, T., Kiyama, H., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weakened+rate-dependent+depression+of+Hoffmann&#8217;s+reflex+and+increased+motoneuron+hyperactivity+after+motor+cortical+infarction+in+mice.">Weakened rate-dependent depression of Hoffmann&#8217;s reflex and increased motoneuron hyperactivity after motor cortical infarction in mice.</a> Cell Death &amp; Disease. 5 (1), 1007 (2014).</li><li>Knikou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+H-reflex+as+a+probe:+Pathways+and+pitfalls.">The H-reflex as a probe: Pathways and pitfalls.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 1-12 (2008).</li><li>Wieters, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+spasticity+and+related+mouse+models.">Introduction to spasticity and related mouse models.</a> Experimental Neurology. 335, 113491 (2020).</li><li>Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+electrode+configuration+for+recording+electromyographic+activity+in+behaving+mice.">A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 36-42 (2005).</li><li>Akay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+measurement+of+muscle+denervation+and+locomotor+behavior+in+individual+wild-type+and+ALS+model+mice.">Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice.</a> Journal of Neurophysiology. 111 (3), 694-703 (2014).</li><li>Haghighi, S. S., Green, D. K., Oro, J. J., Drake, R. K., Kracke, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depressive+effect+of+isoflurane+anesthesia+on+motor+evoked+potentials.">Depressive effect of isoflurane anesthesia on motor evoked potentials.</a> Neurosurgery. 26 (6), 993 (1990).</li><li>Chang, H. -. Y., Havton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+urethane+and+isoflurane+on+external+urethral+sphincter+electromyography+and+cystometry+in+rats.">Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 295 (4), 1248-1253 (2008).</li><li>Nolan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+4:+Nervous+system+(Br.+J.+Pharmacol).">Section 4: Nervous system (Br. J. Pharmacol).</a> Clinical pharmacology. , 295-310 (2012).</li><li>Struck, M. B., Andrutis, K. A., Ramirez, H. E., Battles, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+short-term+fast+on+ketamine-xylazine+anesthesia+in+rats.">Effect of a short-term fast on ketamine-xylazine anesthesia in rats.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (3), 344-348 (2011).</li><li>Zandieh, S., Hopf, R., Redl, H., Schlag, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ketamine/xylazine+anesthesia+on+sensory+and+motor+evoked+potentials+in+the+rat.">The effect of ketamine/xylazine anesthesia on sensory and motor evoked potentials in the rat.</a> Spinal Cord. 41 (1), 16-22 (2003).</li></ol>

Em contraste com as medidas transcutâneas do reflexo H previamente descritas emcamundongos6, fornecemos uma medida mais direta e específica do nervo. Essa nova abordagem pode ser aplicada aos nervos dos membros anteriores e posteriores (por exemplo, mediano, ulnar e radial, tibial e ciático, respectivamente), tornando esse método adaptável como ferramenta diagnóstica a muitos modelos de doenças (por exemplo, acidente vascular cerebral, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, tr...

O reflexo de Hoffmann (reflexo H), nomeado em homenagem ao fisiologista Paul Hoffmann, pode ser evocado pela estimulação elétrica de nervos periféricos, que carregam axônios de neurônios sensoriais e motores que surgem e levam aos mesmos músculos. É o análogo eletricamente induzido do reflexo de estiramento monossináptico e compartilha a mesma via1. Diferentemente do alongamento muscular, o reflexo H resulta da estimulação elétrica. Quando os nervos periféricos são estimulados eletricamente em baixa intensidade de corrente, as fibras aferentes de Ia são tipicamente despolarizadas primeiro devido ao seu grande diâmetro axonal2. Seus potenciais de ação excitam neurônios motores alfa (αMNs) na medula espinhal, que por sua vez provocam potenciais de ação que viajam pelos axônios αMN em direção ao músculo (Figura 1). Essa cascata gera uma resposta muscular com pequena amplitude, refletida na chamada onda H. Ao aumentar gradualmente a intensidade do estímulo, a amplitude da onda H aumenta devido ao recrutamento de unidades motoras adicionais. A partir de uma certa intensidade de estímulo, potenciais de ação nos axônios mais finos dos αMNs são eliciados diretamente, o que é registrado como a onda M. Essa onda M aparece com latência menor que a onda H (Figura 2). Se a intensidade da estimulação é aumentada, a amplitude da onda M torna-se maior devido ao recrutamento de mais axônios αMN, enquanto a onda H gradualmente se torna menor. A onda H pode ser suprimida em altas intensidades de estímulo devido à retropropagação antidrômica dos potenciais de ação nos axônios αMN. Esses potenciais de ação desencadeados colidem com os da estimulação Ia e, assim, podem se anular. Em intensidades de estímulo supramáximas, os potenciais de ação ortodrômicos (em direção ao músculo) e antidrômicos (em direção à medula espinhal) ocorrem em todos os axônios do NM; o primeiro dá origem à amplitude máxima da onda M (Mmáx), enquanto o segundo resulta na completa abolição do reflexo H3.
Para a avaliação da espasticidade pós-AVE (ECP) ou lesão medular (LME), o reflexo H tem sido utilizado para avaliar a base neural do movimento e espasticidade emhumanos1. Uma melhor quantificação da mudança no reflexo H entre as medidas e entre os sujeitos é obtida usando a razão da onda H e M (relação H/M). Alternativamente, a depressão dependente da taxa (RDD) é medida, usando um conjunto de frequências ascendentes (por exemplo, 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 e 5,0 Hz). A RDD reflete a integridade de circuitos inibitórios que podem ser perturbados por acidente vascular cerebral ou LME. Quando todos os circuitos neurais estão intactos, há uma supressão uniforme, independente da frequência, do reflexo-H. No entanto, se houver redução da inibição neural como resultado de AVC ou LME, a supressão do reflexo-H diminui com o aumento da frequência de estimulação4.
O correto registro eletrofisiológico utilizando eletrodos de superfície pode ser desafiador e pode ser afetado por tarefas motoras, mecanismos inibitórios e excitabilidade de αMN5. No registro transcutâneo em roedores, um eletrodo de estímulo é colocado próximo ao nervo tibial e um eletrodo de registro é colocado próximo aos músculos relacionados na pata anterior. De acordo com nossa experiência, entretanto, o correto posicionamento dos eletrodos transcutâneos (Figura 1A) é ainda mais complexo e variável em roedores do que o posicionamento de eletrodos de superfície em humanos. Isso pode levar a diferenças no comprimento, frequência e intensidade de estimulação necessários para eliciar o reflexo H. Esses desafios metodológicos poderiam explicar por que há apenas um número muito limitado de estudos de mensuração do reflexo H (por exemplo, em modelos experimentais deAVE3,4 e outros modelos de espasticidade6. Uma estimulação precisa (a longo prazo) e o registro do reflexo-H em nervos individuais poderiam, em princípio, ser obtidos usando eletrodos implantáveis ao redor do nervo alvo 7,8. Devido ao desafio cirúrgico com potenciais efeitos colaterais para o animal e potencial instabilidade da sonda, essa abordagem não se tornou um padrão na área. O método aqui apresentado também requer alguns conhecimentos cirúrgicos. No entanto, permite uma nova e precisa estimulação e registro de nervos isolados in vivo usando baixas intensidades de estimulação, o que evita a estimulação simultânea de nervos vizinhos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent underpad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-0684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD converter</td>
			<td>Cambridge Electronic Design, UK</td>
			<td>CED 1401micro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Workshop Zoological Institute, UoC</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital stimulator</td>
			<td>Workshop Zoological Institute, UoC</td>
			<td>MS 501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMG electrodes</td>
			<td>Workshop Zoological Institute, UoC</td>
			<td></td>
			<td>Two twisted, insulated copper wires (50 &#181;m outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Bepanthen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Workshop Zoological Institute, UoC</td>
			<td>-</td>
			<td>Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating box</td>
			<td>MediHeat</td>
			<td>MediHeat V1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>WPI</td>
			<td>61840 Heating pad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hook electrodes</td>
			<td>Workshop Zoological Institute, UoC</td>
			<td>-</td>
			<td>To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>Ketavet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectal probe</td>
			<td>WPI</td>
			<td>RET-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator isolation unit</td>
			<td>Workshop Zoological Institute, UoC</td>
			<td>MI 401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer</td>
			<td>CellPoint Scientific</td>
			<td>Germinator 500</td>
			<td>Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260&#176;C).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>ATC200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

terminal h-reflex measurements in mice

O reflexo de Hoffmann (reflexo H), como análogo elétrico ao reflexo de estiramento, permite a validação eletrofisiológica da integridade dos circuitos neurais após lesões como lesão medular ou acidente vascular cerebral. Um aumento da resposta reflexa H, juntamente com sintomas como contrações musculares não voluntárias, reflexo de estiramento patologicamente aumentado e hipertonia no músculo correspondente, é um indicador de espasticidade pós-AVC (PSS).
Em contraste com medidas transcutâneas bastante inespecíficas do nervo, apresentamos aqui um protocolo para quantificar o reflexo-H diretamente nos nervos ulnar e mediano da pata anterior, que é aplicável, com pequenas modificações, ao nervo tibial e ciático da pata traseira. Baseado na estimulação direta e na adaptação a diferentes nervos, o método representa uma ferramenta confiável e versátil para validar mudanças eletrofisiológicas em modelos de doenças relacionadas à espasticidade.

A partir do n = 15 tentativas de estimulação por frequência de estimulação e pata, selecione pelo menos n = 10 registros bem-sucedidos para a análise. Tentativas com erros de medição (por exemplo, ausência de onda M) são excluídas da análise. Analise cada ensaio separadamente e gere uma média para comparações de grupo/tempo mais tarde. A latência entre a estimulação e o aparecimento da onda M e da onda H é registrada para cada tentativa. Em nossa experiência, a onda M ocorre aproximadamente 2 ms após...

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Terminal H-reflex Measurements in Mice

A avaliação clínica da espasticidade baseada no reflexo de Hoffmann (reflexo H) e utilizando a estimulação elétrica de nervos periféricos é um método estabelecido. Aqui, nós fornecemos um protocolo para uma estimulação nervosa terminal e direta para quantificação do reflexo H na pata dianteira de camundongos.

Medições do reflexo H terminal em camundongos

The Hoffmann reflex (H-reflex), as an electrical analog to the stretch reflex, allows electrophysiological validation of the integrity of neural circuits ...

O reflexo H permite a validação eletrofisiológica da integridade dos circuitos neurológicos. Apresentamos um protocolo terminal para quantificar o reflexo H diretamente nos nervos da pata anterior em camundongos. Diferentemente dos registros transcutâneos convencionais e inespecíficos do nervo, os resultados são menos variáveis entre camundongos e dias de medição.Semelhante aos registros do reflexo H em pacientes, pois a quantificação precisa permite a caracterização eletrofisiológica em modelos de doenças, por exemplo, lesão medular e acidente vascular cerebral. O protocolo requer sólidas habilidades experimentais no trabalho com equipamentos cirúrgicos em camundongos.Se você não tem certeza de como separar os nervos do tecido conjuntivo e dos vasos sanguíneos, pratique primeiro. A demonstração do procedimento será feita por Frederique Wieters, estudante de doutorado do meu laboratório. Para começar, coloque o rato C57 preto/6J adulto anestesiado com 8 a 16 semanas de idade na almofada de aquecimento coberta e espere até que o rato esteja calmo, a respiração estável e os reflexos estejam ausentes.Vire o mouse de costas. Em seguida, fixe as patas dianteiras com fita adesiva. Posicione a fita de forma que os eletrodos de medição sejam facilmente inseridos nas patas dianteiras.Para medir a temperatura de um rato, insira uma sonda retal e fixe-a com fita adesiva. Aplique pomada ocular para evitar que os olhos sequem. Retire o pelo cuidadosamente com uma tesoura fina e arredondada enquanto levanta a pele com uma pinça.Em seguida, faça uma incisão de um centímetro na pele ao longo do eixo ventroposterior da pata anterior com uma tesoura fina e arredondada. Remova cuidadosamente o tecido conjuntivo e exponha o músculo e o nervo por baixo. Em seguida, remova o músculo peitoral profundo exposto usando pinça para avaliar o nervo mediano.Remova pequenas quantidades de sangue e fluido tecidual com papel de tecido mole. Em seguida, corte cuidadosamente a mama ou o músculo axilar de cima para baixo para expor o feixe nervoso. Liberte o feixe nervoso do tecido conjuntivo e muscular ao longo de um comprimento de aproximadamente 1,5 centímetros.Separe cuidadosamente o nervo ulnar e mediano da pata anterior usando uma pipeta de vidro dobrada. O nervo superior é o nervo ulnar e o inferior é o nervo mediano. Disponha os eletrodos do gancho do estimulador em paralelo a uma distância de 0,5 a um milímetro e use um micromanipulador para posicionar o gancho duplo próximo ao nervo.Use o gancho de vidro para levantar o nervo ulnar sobre os eletrodos do gancho de estimulação. Em seguida, puxe o eletrodo com o nervo e separe-o dos outros nervos. Coloque os eletrodos ao longo do longo eixo da pata para reduzir o crosstalk entre os músculos.Secar superficialmente os ganchos de eletrodos presos ao nervo e aplicar vaselina usando uma seringa para fornecer isolamento elétrico do tecido adjacente. Para medir o reflexo H, posicione os eletrodos eletromiográficos por via intramuscular na pata anterior. Em seguida, posicione o eletrodo de referência no subcutâneo do membro pélvico, segurado por um clipe de jacaré em miniatura.Quando o estimulador estiver ligado, observe uma estimulação bem-sucedida como pequenas contrações da pata dianteira. A corrente de estimulação mínima para provocar a onda M e pequenas contrações visíveis na pata dianteira estão entre 10 a 50 microamperes. Realizar a estimulação nervosa 15 vezes com pulsos de 0,2 milissegundos cada.Com pausas de dois minutos entre as séries de estímulos, a frequência é aumentada de 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 para 5 hertz. Uma ilustração do registro montado em vias para medir o reflexo de Hoffman e a resposta muscular é mostrada aqui. A relação entre a amplitude das ondas H e M foi avaliada.O estímulo e o respectivo artefato de estimulação foram fixados em zero milissegundos, seguidos da onda M direta e do subsequente pico menor representando a onda H. A onda M ocorre aproximadamente dois milissegundos após a estimulação, e a onda H após seis a oito milissegundos devido ao maior tempo de trânsito através da medula espinhal. Ao lado da separação dos nervos, a aplicação de vaselina no eletrodo e também entre os dois ganchos são fundamentais.Este é um experimento terminal. Em nosso laboratório, essa técnica forneceu uma nova referência padrão-ouro para os registros transcutâneos do reflexo H.

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