Name: terminal h-reflex measurements in mice
Uploaded: 2022-06-16T12:30:00
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Los autores agradecen el apoyo de T. Akay, de la Universidad de Dalhousie, durante una visita de MG a su laboratorio. Este trabajo fue apoyado por la financiación de la Fundación Friebe (T0498/28960/16) y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) - Project-ID 431549029 - SFB 1451.

Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las leyes europeas y nacionales sobre el cuidado de los animales y las directrices institucionales, y fueron aprobados por el Landesamt für Natur-, Umwelt-, und Verbraucherschutz Renania del Norte-Westfalia (Az: 81-02.04.2019.A309). El protocolo está optimizado para ratones adultos (ratones C57Bl/6J de aprox. 8-16 semanas de edad) y el registro de las extremidades anteriores. Se puede adaptar fácilmente estimulando los nervios respectivos de la extremidad po...

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	<li>Palmieri, R. M., Ingersoll, C. D., Hoffman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hoffmann+reflex:+methodologic+considerations+and+applications+for+use+in+sports+medicine+and+athletic+training+research.">The Hoffmann reflex: methodologic considerations and applications for use in sports medicine and athletic training research.</a> Journal of Athletic Training. 39 (3), 268-277 (2004).</li><li>Henneman, E., Somjen, G., Carpenter, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitability+and+inhibitibility+of+motoneurons+of+different+sizes.">Excitability and inhibitibility of motoneurons of different sizes.</a> Journal of Neurophysiology. 28 (3), 599-620 (1965).</li><li>Toda, T., Ishida, K., Kiyama, H., Yamashita, T., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+KCC2+expression+and+phosphorylation+in+motoneurons,+and+increases+the+number+of+in+primary+afferent+projections+to+motoneurons+in+mice+with+post-stroke+spasticity.">Down-regulation of KCC2 expression and phosphorylation in motoneurons, and increases the number of in primary afferent projections to motoneurons in mice with post-stroke spasticity.</a> PLoS ONE. 9 (12), 114328 (2014).</li><li>Lee, S., Toda, T., Kiyama, H., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weakened+rate-dependent+depression+of+Hoffmann&#8217;s+reflex+and+increased+motoneuron+hyperactivity+after+motor+cortical+infarction+in+mice.">Weakened rate-dependent depression of Hoffmann&#8217;s reflex and increased motoneuron hyperactivity after motor cortical infarction in mice.</a> Cell Death &amp; Disease. 5 (1), 1007 (2014).</li><li>Knikou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+H-reflex+as+a+probe:+Pathways+and+pitfalls.">The H-reflex as a probe: Pathways and pitfalls.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 1-12 (2008).</li><li>Wieters, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+spasticity+and+related+mouse+models.">Introduction to spasticity and related mouse models.</a> Experimental Neurology. 335, 113491 (2020).</li><li>Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+electrode+configuration+for+recording+electromyographic+activity+in+behaving+mice.">A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 36-42 (2005).</li><li>Akay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+measurement+of+muscle+denervation+and+locomotor+behavior+in+individual+wild-type+and+ALS+model+mice.">Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice.</a> Journal of Neurophysiology. 111 (3), 694-703 (2014).</li><li>Haghighi, S. S., Green, D. K., Oro, J. J., Drake, R. K., Kracke, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depressive+effect+of+isoflurane+anesthesia+on+motor+evoked+potentials.">Depressive effect of isoflurane anesthesia on motor evoked potentials.</a> Neurosurgery. 26 (6), 993 (1990).</li><li>Chang, H. -. Y., Havton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+urethane+and+isoflurane+on+external+urethral+sphincter+electromyography+and+cystometry+in+rats.">Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 295 (4), 1248-1253 (2008).</li><li>Nolan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+4:+Nervous+system+(Br.+J.+Pharmacol).">Section 4: Nervous system (Br. J. Pharmacol).</a> Clinical pharmacology. , 295-310 (2012).</li><li>Struck, M. B., Andrutis, K. A., Ramirez, H. E., Battles, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+short-term+fast+on+ketamine-xylazine+anesthesia+in+rats.">Effect of a short-term fast on ketamine-xylazine anesthesia in rats.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (3), 344-348 (2011).</li><li>Zandieh, S., Hopf, R., Redl, H., Schlag, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ketamine/xylazine+anesthesia+on+sensory+and+motor+evoked+potentials+in+the+rat.">The effect of ketamine/xylazine anesthesia on sensory and motor evoked potentials in the rat.</a> Spinal Cord. 41 (1), 16-22 (2003).</li></ol>

En contraste con las mediciones transcutáneas del reflejo H descritas anteriormente en el ratón6, proporcionamos una medición más directa y específica del nervio. Este nuevo enfoque se puede aplicar a los nervios de la extremidad anterior y posterior (por ejemplo, los nervios mediano, cubital y radial, y los nervios tibial y ciático, respectivamente), lo que hace que este método sea adaptable como herramienta de diagnóstico a muchos modelos de enfermedades (por ejemplo, accidente cerebrova...

El reflejo de Hoffmann (reflejo H), llamado así por el fisiólogo Paul Hoffmann, puede ser evocado por la estimulación eléctrica de los nervios periféricos, que transportan axones de neuronas sensoriales y motoras que surgen y conducen a los mismos músculos. Es el análogo inducido eléctricamente del reflejo de estiramiento monosináptico, y comparte la misma vía1. A diferencia del estiramiento muscular, el reflejo H resulta de la estimulación eléctrica. Cuando los nervios periféricos se estimulan eléctricamente a baja intensidad de corriente, las fibras aferentes de Ia generalmente se despolarizan primero debido a su gran diámetro axónico2. Sus potenciales de acción excitan las motoneuronas alfa (αMNs) en la médula espinal, que a su vez provocan potenciales de acción que viajan por los axones αMN hacia el músculo (Figura 1). Esta cascada genera una respuesta muscular con pequeña amplitud, reflejada en la llamada onda H. Al aumentar gradualmente la intensidad del estímulo, la amplitud de la onda H aumenta debido al reclutamiento de unidades motoras adicionales. A partir de una cierta intensidad de estímulo, se obtienen directamente potenciales de acción en los axones más delgados de los αMN, que se registran como la onda M. Esta onda M aparece con una latencia más corta que la onda H (Figura 2). Si la intensidad de la estimulación aumenta aún más, la amplitud de la onda M aumenta debido al reclutamiento de más axones αMN, mientras que la onda H se vuelve gradualmente más pequeña. La onda H puede suprimirse a altas intensidades de estímulo debido a la retropropagación antidrómica de los potenciales de acción en los axones αMN. Estos potenciales de acción activados chocan con los de la estimulación Ia y, por lo tanto, pueden cancelarse entre sí. A intensidades de estímulo supramáximas, se producen potenciales de acción ortodrómicos (hacia el músculo) y antidrómicos (hacia la médula espinal) en todos los axones MN; el primero da lugar a la amplitud máxima de la onda M (Mmax), mientras que el segundo resulta en la abolición completa del reflejo H3.
Para la evaluación de la espasticidad post-accidente cerebrovascular (PSS) o lesión de la médula espinal (LME), el reflejo H se ha utilizado para evaluar las bases neurales del movimiento y la espasticidad en humanos1. Una cuantificación mejorada del cambio en el reflejo H entre mediciones y entre sujetos se logra utilizando la relación de la onda H y M (relación H / M). Alternativamente, se mide la depresión dependiente de la velocidad (RDD), utilizando un conjunto de frecuencias ascendentes (por ejemplo, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 y 5.0 Hz). La RDD refleja la integridad de los circuitos inhibitorios que pueden ser perturbados por un accidente cerebrovascular o LME. Cuando todos los circuitos neuronales están intactos, hay una supresión uniforme e independiente de la frecuencia del reflejo H. Sin embargo, si hay una inhibición neural reducida como resultado de un accidente cerebrovascular o LME, la supresión del reflejo H disminuye con el aumento de la frecuencia de estimulación4.
El registro electrofisiológico correcto utilizando electrodos de superficie puede ser desafiante y puede verse afectado por tareas motoras, mecanismos inhibitorios y excitabilidad αMN5. En el registro transcutáneo en roedores, se coloca un electrodo de estímulo cerca del nervio tibial y se coloca un electrodo de registro cerca de los músculos relacionados en la pata delantera. Sin embargo, según nuestra experiencia, la colocación correcta de los electrodos transcutáneos (Figura 1A) es aún más compleja y variable en roedores que la colocación de electrodos de superficie en humanos. Esto puede conducir a diferencias en la longitud, frecuencia e intensidad de estimulación necesarias para provocar el reflejo H. Estos desafíos metodológicos podrían explicar por qué solo hay un número muy limitado de estudios de medición del reflejo H (por ejemplo, en modelos experimentales de accidente cerebrovascular 3,4 y otros modelos de espasticidad6. Una estimulación precisa (a largo plazo) y el registro del reflejo H en los nervios individuales podrían, en principio, lograrse utilizando electrodos implantables que rodean el nervio objetivo 7,8. Debido a la cirugía desafiante con posibles efectos secundarios para el animal y la posible inestabilidad de la sonda, este enfoque no se ha convertido en un estándar en el campo. El método presentado aquí también requiere cierta experiencia quirúrgica. Sin embargo, permite una estimulación novedosa y precisa y el registro de nervios aislados in vivo utilizando intensidades de estimulación bajas, lo que evita la estimulación simultánea de los nervios vecinos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent underpad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-0684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD converter</td>
			<td>Cambridge Electronic Design, UK</td>
			<td>CED 1401micro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Workshop Zoological Institute, UoC</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital stimulator</td>
			<td>Workshop Zoological Institute, UoC</td>
			<td>MS 501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMG electrodes</td>
			<td>Workshop Zoological Institute, UoC</td>
			<td></td>
			<td>Two twisted, insulated copper wires (50 &#181;m outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Bepanthen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Workshop Zoological Institute, UoC</td>
			<td>-</td>
			<td>Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating box</td>
			<td>MediHeat</td>
			<td>MediHeat V1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>WPI</td>
			<td>61840 Heating pad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hook electrodes</td>
			<td>Workshop Zoological Institute, UoC</td>
			<td>-</td>
			<td>To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>Ketavet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectal probe</td>
			<td>WPI</td>
			<td>RET-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator isolation unit</td>
			<td>Workshop Zoological Institute, UoC</td>
			<td>MI 401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer</td>
			<td>CellPoint Scientific</td>
			<td>Germinator 500</td>
			<td>Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260&#176;C).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>ATC200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

terminal h-reflex measurements in mice

El reflejo de Hoffmann (reflejo H), como análogo eléctrico del reflejo de estiramiento, permite la validación electrofisiológica de la integridad de los circuitos neuronales después de lesiones como daño de la médula espinal o accidente cerebrovascular. Un aumento de la respuesta del reflejo H, junto con síntomas como contracciones musculares no voluntarias, reflejo de estiramiento patológicamente aumentado e hipertonía en el músculo correspondiente, es un indicador de espasticidad posterior al accidente cerebrovascular (PSS).
En contraste con las mediciones transcutáneas bastante inespecíficas del nervio, aquí presentamos un protocolo para cuantificar el reflejo H directamente en los nervios cubital y mediano de la pata delantera, que es aplicable, con modificaciones menores, al nervio tibial y ciático de la pata posterior. Basado en la estimulación directa y la adaptación a diferentes nervios, el método representa una herramienta fiable y versátil para validar cambios electrofisiológicos en modelos de enfermedades relacionadas con la espasticidad.

De los n = 15 ensayos de estimulación por frecuencia de estimulación y pata, seleccione al menos n = 10 registros exitosos para el análisis. Los ensayos con errores de medición (p.ej., falta de onda M) se excluyen del análisis. Analice cada ensayo por separado y genere un promedio para las comparaciones de grupo/tiempo más adelante. La latencia entre la estimulación y la aparición de la onda M y la onda H se registra para cada ensayo. En nuestra experiencia, la onda M ocurre aproximadamente 2 ms después de la es...

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Terminal H-reflex Measurements in Mice

La evaluación clínica de la espasticidad basada en el reflejo de Hoffmann (reflejo H) y el uso de estimulación eléctrica de los nervios periféricos es un método establecido. Aquí, proporcionamos un protocolo para una estimulación nerviosa terminal y directa para la cuantificación del reflejo H en la pata delantera del ratón.

Mediciones terminales del reflejo H en ratones

The Hoffmann reflex (H-reflex), as an electrical analog to the stretch reflex, allows electrophysiological validation of the integrity of neural circuits ...

El reflejo H permite la validación electrofisiológica de la integridad de los circuitos neurológicos. Presentamos un protocolo terminal para cuantificar el reflejo H directamente en los nervios de la pata delantera en ratones. A diferencia de los registros transcutáneos convencionales bastante inespecíficos de los nervios, los resultados son menos variables entre los ratones y los días de medición.Similar a los registros de reflejo H en pacientes, la cuantificación precisa permite la caracterización electrofisiológica en modelos de enfermedad, por ejemplo, lesión de la médula espinal y accidente cerebrovascular. El protocolo requiere sólidas habilidades experimentales para trabajar con equipos quirúrgicos en ratones.Si no está seguro de cómo separar los nervios del tejido conectivo y los vasos sanguíneos, practique primero. La demostración del procedimiento estará a cargo de Frederique Wieters, una estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, coloque el ratón C57 negro/6J anestesiado para adultos de 8 a 16 semanas de edad en la almohadilla térmica cubierta y espere hasta que el ratón esté tranquilo, la respiración sea estable y los reflejos estén ausentes.Gire el ratón sobre su espalda. Luego, fije las patas delanteras con cinta adhesiva. Coloque la cinta de manera que los electrodos de medición se inserten fácilmente en las patas delanteras.Para medir la temperatura de un ratón, inserte una sonda rectal y fíjela con cinta adhesiva. Aplique ungüento para los ojos para evitar que los ojos se sequen. Retire el pelaje con cuidado con un par de tijeras finas y redondeadas mientras levanta la piel con pinzas.Posteriormente, haga una incisión de un centímetro en la piel a lo largo del eje ventroposterior de la pata delantera con un par de tijeras finas y redondeadas. Retire con cuidado el tejido conectivo y exponga el músculo y el nervio inferiores. Luego retire el músculo pectoral profundus expuesto usando fórceps para evaluar el nervio mediano.Retire pequeñas cantidades de sangre y líquido tisular con papel de seda blando. Luego, corte cuidadosamente el seno o el músculo axilar de arriba a abajo para exponer el haz de nervios. Libere el haz de nervios del tejido conectivo y muscular en una longitud de aproximadamente 1,5 centímetros.Separe cuidadosamente el nervio cubital y el nervio mediano de la pata delantera con una pipeta de vidrio doblada. El nervio superior es el nervio cubital y el inferior es el nervio mediano. Coloque los electrodos del gancho estimulador en paralelo a una distancia de 0,5 a un milímetro y use un micromanipulador para colocar el gancho doble cerca del nervio.Use el gancho de vidrio para levantar el nervio cubital sobre los electrodos del gancho de estimulación. Luego, retire el electrodo con el nervio y sepárelo de los otros nervios. Coloque los electrodos a lo largo del eje largo de la pata para reducir la diafonía entre los músculos.Seque superficialmente los ganchos de electrodos unidos al nervio y aplique vaselina con una jeringa para proporcionar aislamiento eléctrico del tejido adyacente. Para medir el reflejo H, coloque los electrodos de electromiografía por vía intramuscular en la pata delantera. Luego, coloque el electrodo de referencia por vía subcutánea en la extremidad posterior, sostenido por una pinza de cocodrilo en miniatura.Cuando se enciende el estimulador, observe una estimulación exitosa como pequeñas contracciones de la pata delantera. La corriente de estimulación mínima para provocar la onda M y pequeñas contracciones visibles en la pata delantera es de entre 10 y 50 microamperios. Realice la estimulación nerviosa 15 veces con pulsos de 0,2 milisegundos de duración cada una.Con pausas de dos minutos entre los conjuntos de estímulos, la frecuencia aumenta de 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 a 5 hercios. Aquí se muestra una ilustración de la grabación establecida en las vías para medir el reflejo de Hoffman y la respuesta muscular. Se evaluó la relación entre la amplitud de la onda H y M.El estímulo y el artefacto de estimulación respectivo se establecieron en cero milisegundos, seguidos por la onda M directa y el pico más pequeño posterior que representa la onda H. La onda M ocurre aproximadamente dos milisegundos después de la estimulación, y la onda H después de seis a ocho milisegundos debido al mayor tiempo de tránsito a través de la médula espinal. Junto a la separación de los nervios, la aplicación de vaselina al electrodo y también entre los dos ganchos son críticos.Este es un experimento terminal. En nuestro laboratorio, esta técnica proporcionó una nueva referencia estándar de oro para las grabaciones transcutáneas del reflejo H.

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