Name: isolation and profiling of human primary mesenteric arterial endothelial cells at the transcriptome level
Uploaded: 2022-03-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01HL108735 و R01HL145170 و R01HL106089 (إلى Z.B.C.) ؛ DP1DK126138 و DP1HD087990 (إلى S.Z.) ؛ منحة مؤسسة إيلا فيتزجيرالد ومشروع عائلة وانيك (إلى Z.B.C.) ؛ ومنحة شبكة بذور أطلس الخلايا البشرية (إلى Z.B.C. و S.Z.). شملت الأبحاث الواردة في هذا المنشور العمل المنجز في مركز الجينوم التكاملي في مدينة الأمل بدعم من المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة P30CA033572. يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور إسماعيل العبد الله والدكتور ميريجنغ تشي من فريق زراعة الجزر في مدينة الأمل لعزل الأنسجة البشرية ، والدكتور دونغتشيانغ يوان في مدينة الأمل على مساعدته في تحليل scRNA-seq ، والدكتور مارك هالوشكا في قسم أمراض القلب والأوعية الدموية ، كلية الطب بجامعة جونز هوبكنز على رؤاه القيمة في علم الأنسجة الوعائية.

أجريت دراسات الأنسجة البشرية على عينات مجهولة الهوية تم الحصول عليها من مركز موارد خلايا جزيرة جنوب كاليفورنيا في مدينة الأمل. تم الحصول على موافقات البحث لاستخدام الأنسجة البشرية بعد الوفاة من أقرب أقرباء المتبرعين ، وتم منح الموافقة الأخلاقية لهذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسي?...

يفصل سير العمل المقدم مجموعة من التقنيات لتحديد ملامح ECs من قطعة واحدة من الشريان البشري بدقة أحادية الخلية ومكانية. هناك العديد من الخطوات الحاسمة والعوامل المقيدة في البروتوكول. أحد مفاتيح التنميط النصفي هو نضارة الأنسجة وسلامة الحمض النووي الريبي. من المهم الحفاظ على الأنسجة على الجلي...

بطانة تجويف الأوعية الدموية ، الخلايا البطانية (ECs) هي منظمات حاسمة للنغمة الوعائية وتروية الأنسجة. ECs رائعة في قدرتها على التفاعل مع البيئة خارج الخلية والتكيف مع التغيرات في ديناميكيات وتكوين تدفق الدم. يتم التوسط في هذه الاستجابات الديناميكية من خلال شبكة من أحداث الإشارات داخل الخلايا ، بما في ذلك التعديلات النسخية وما بعد النسخ بدقة مكانية زمانية. وينطوي خلل تنظيم هذه الاستجابات على العديد من الأمراض، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر أمراض القلب والأوعية الدموية والسكري والسرطان 1,2.
تستخدم نسبة كبيرة من الدراسات خطوط الخلايا أو النماذج الحيوانية لاستجواب نسخ EC. الأول هو أداة مفيدة ، بالنظر إلى سهولة الاستخدام النسبية وعدم التكلفة. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي الاستزراع التسلسلي إلى إدخال تغييرات مظهرية على ECs ، مثل ميزات الخلايا الليفية ونقص الاستقطاب ، وفصلها عن حالتها في الجسم الحي 3. كانت الخلايا الأولية ، على سبيل المثال ، الوريد السري البشري EC (HUVEC) خيارا شائعا منذ 1980s ولكنها مشتقة من سرير وعائي تنموي غير موجود لدى البالغين ، وبالتالي من غير المرجح أن يمثل ECs الناضجة بالكامل. تمثل الحيوانات ، وخاصة نماذج الفئران ، البيئة الفسيولوجية أو الفسيولوجية المرضية ل ECs بشكل أفضل وتسمح باستجواب النسخ نتيجة للاضطراب الوراثي. يمكن عزل Murine ECs من الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك الشريان الأورطي والرئتين والأنسجة الدهنية باستخدام الإجراءات القائمة على الإنزيم4،5،6،7. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام الخلايا المعزولة لممرات متعددة ما لم يتم تحويلها6 وغالبا ما تكون محدودة في الأعداد ، مما يتطلب تجميعها من متعددة5،8،9.
إن ظهور تقنيات جديدة تستكشف بنية الأوعية على مستوى النسخ ، خاصة مع دقة الخلية الواحدة ، قد مكن من عصر جديد من البيولوجيا البطانية من خلال الكشف عن وظائف وخصائص جديدة ل ECs 5,10,11,12,13,14. جمع مورد غني بناه محققو Tabula Muris ملفات تعريف نسخية أحادية الخلية ل 100000 خلية بما في ذلك ECs عبر 20 عضوا فئوريا مختلفا15 ، والتي كشفت عن كل من جينات علامة EC الشائعة والتوقيعات النسخية الفريدة مع الاختلافات بين الأنسجة وداخلها 5,13. ومع ذلك ، هناك اختلافات واضحة بين الفأر والإنسان في الجينوم ، epigenome ، و transcriptome ، خاصة في المناطق غير المشفرة16،17،18. تؤكد هذه العيوب المذكورة أعلاه على أهمية تحليل ECs باستخدام عينات بشرية من أجل الحصول على ملف تعريف أمين لل ECs في حالتها الأصلية في الصحة والمرض.
تعتمد معظم طرق عزل EC على التفكك الجسدي من خلال التجانس والقطع الدقيق وفرم الأنسجة قبل الحضانة بالإنزيمات المحللة للبروتين لأوقات مختلفة. تختلف الإنزيمات والظروف أيضا اختلافا كبيرا بين أنواع الأنسجة ، من التربسين إلى الكولاجيناز ، المستخدمة بمفردها أو في تركيبة19،20،21. غالبا ما يتم تضمين المزيد من التخصيب أو التنقية القائمة على الأجسام المضادة لزيادة نقاء ECs. عادة ، يتم اقتران الأجسام المضادة ضد علامات غشاء EC ، على سبيل المثال ، CD144 و CD31 بالخرز المغناطيسي وتضاف إلى تعليق الخلية22,23. يمكن تكييف هذه الاستراتيجية بشكل عام لعزل EC عن الأنسجة البشرية والفئران المتعددة ، بما في ذلك التقنيات التي تم إدخالها في هذا البروتوكول.
في حالتها الأصلية ، تتفاعل ECs مع أنواع متعددة من الخلايا وقد توجد في منافذ الأوعية الدموية حيث يكون قرب الخلية أمرا بالغ الأهمية للوظيفة. في حين أن دراسات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية والنووية الواحدة (scRNA و snRNA-seq) كانت ذات أهمية قصوى للاختراقات الأخيرة في وصف عدم تجانس EC ، فإن عملية التفكك تعطل سياق الأنسجة واتصال الخلايا الخلوية ، والتي هي أيضا مهمة لفهم بيولوجيا EC. تم تطوير التنميط المكاني في عام 2012 وأطلق عليه اسم طريقة العام في عام2020 24 ، وقد تم استخدام التنميط المكاني لتحديد ملامح التعبير الجيني العالمي مع الاحتفاظ بالسمات المكانية في الأنسجة المختلفة بما في ذلك الدماغ 25 والورم26 والأنسجة الدهنية27. يمكن استهداف التقنيات ، باستخدام مجسات متخصصة خاصة بتسلسلات الحمض النووي الريبي الخاصة المرتبطة بكواشف التقارب أو علامات الفلورسنت ، وبالتالي اكتشاف جينات مختارة بدقة دون خلوية28،29،30،31. يمكن أيضا أن تكون غير مستهدفة32,33 ، وعادة ما تستخدم oligonucleotides المشفرة مكانيا لالتقاط الحمض النووي الريبي ، والتي يتم تحويلها معا إلى cDNA لإعداد مكتبة seq اللاحقة ، وبالتالي لديها ميزة استنتاج التعبير الجيني للأنسجة بأكملها بطريقة غير متحيزة. ومع ذلك، لا يتم حاليا تحقيق الاستبانة المكانية على مستوى خلوي واحد باستخدام التكنولوجيات المتاحة تجاريا. يمكن التغلب على ذلك إلى حد ما من خلال تكامل البيانات مع بيانات scRNA-seq ، مما يسمح في النهاية برسم خرائط لنسخ الخلية الواحدة في سياق الأنسجة المعقدة مع الاحتفاظ بمعلوماتها المكانية الأصلية34.
هنا ، يتم وصف سير العمل لملف تعريف EC transcriptome باستخدام الشريان المساريقي البشري العلوي ، وهو شريان محيطي تم استخدامه لدراسة توسع الأوعية الدموية ، وإعادة تشكيل الأوعية الدموية ، والإجهاد التأكسدي ، والالتهاب35،36،37. يتم وصف تقنيتين: 1) لعزل وإثراء ECs من داخل الأوعية الدموية التي تجمع بين التفكك الميكانيكي والهضم الأنزيمي المناسب لتسلسل النسخ أحادي الخلية أو في الثقافة المختبرية اللاحقة ؛ 2) إعداد أقسام الشرايين للتنميط المكاني (الشكل 1). يمكن تنفيذ هاتين التقنيتين بشكل مستقل أو متكامل لتحديد ملامح ECs والخلايا المحيطة بها. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف سير العمل هذا للاستخدام على أي شريان متوسط أو كبير.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AC327270010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14100150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14282300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>07-000-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment factor</td>
			<td>Cell Applications</td>
			<td>123-500</td>
			<td>Attachment reagent in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black wax</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any commercial black wax can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin heat shock treated</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat brushes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT25950CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>Bacteria-derived protease in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Safety Scalpels</td>
			<td>Myco Instrumentation</td>
			<td>6008TR-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14080055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High sensitivity D1000 sample buffer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High sensitivity D1000 screen tape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kept at 37 &#176;C 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP26324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2520-10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal cannister</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>To assess cell morphology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvascular endothelial culture medium</td>
			<td>Cell Applications</td>
			<td>111-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature compound</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>4585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cryomolds</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA screen tape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA screen Tape sample buffer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase ZAP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR036B</td>
			<td>RNase-free water (2) in kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12&#34; long forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91100-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile fine scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost PLUS Gold Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1518848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td>Cell-dissociation enzyme in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visium Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>PN-1000215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visium Gateway Package, 2rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>PN-1000316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visium Spatial Gene Expression Slide &#38; Reagent Kit, 4 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>PN-1000184</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and profiling of human primary mesenteric arterial endothelial cells at the transcriptome level

الخلايا البطانية (ECs) ضرورية لوظيفة الأوعية الدموية والجسم كله من خلال استجابتها الديناميكية للإشارات البيئية. يعد توضيح النسخ و epigenome من ECs أمرا بالغ الأهمية لفهم أدوارها في التنمية والصحة والمرض ، ولكنه محدود في توافر الخلايا الأولية المعزولة. وقد مكنت التكنولوجيات الحديثة من التنميط عالي الإنتاجية لنسخ EC و epigenome ، مما أدى إلى تحديد المجموعات الفرعية لخلايا EC غير المعروفة سابقا ومسارات النمو. في حين أن ثقافات EC هي أداة مفيدة في استكشاف وظيفة EC والخلل الوظيفي ، فإن ظروف الثقافة والممرات المتعددة يمكن أن تقدم متغيرات خارجية تغير خصائص EC الأصلية ، بما في ذلك المورفولوجيا والحالة اللاجينية وبرنامج التعبير الجيني. للتغلب على هذا القيد ، توضح هذه الورقة طريقة لعزل ECs الأولية البشرية عن الشرايين المساريقية المانحة التي تهدف إلى التقاط حالتها الأصلية. يتم فصل ECs في الطبقة الداخلية ميكانيكيا وكيميائيا حيويا باستخدام إنزيمات معينة. يمكن استخدام الخلايا الناتجة مباشرة للحمض النووي الريبي السائب أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أو مطلي للزراعة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف سير العمل لإعداد الأنسجة الشريانية البشرية للنسخ المكاني ، وتحديدا لمنصة متاحة تجاريا ، على الرغم من أن هذه الطريقة مناسبة أيضا لتقنيات التنميط المكاني الأخرى. يمكن تطبيق هذه المنهجية على الأوعية المختلفة التي تم جمعها من مجموعة متنوعة من المانحين في الحالات الصحية أو المرضية لاكتساب رؤى ثاقبة حول التنظيم النسخي واللاجيني EC ، وهو جانب محوري في بيولوجيا الخلايا البطانية.

يصور هنا تحليل ECs من الشريان المساريقي باستخدام مزيج من التفكك الميكانيكي والأنزيمي أو الحفظ بالتبريد للاستخدام في مختلف الفحوصات النهائية (الشكل 1). يمكن تحديد ملامح ECs في الشرايين المساريقية باستخدام الخطوات التالية: أ) الانفصال الميكانيكي عن البطانة الداخلية إلى جانب ه?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level at JoVE.com

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

يصف البروتوكول عزل الخلايا البطانية وزراعتها وتوصيفها من الشريان المساريقي البشري. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير طريقة لإعداد الشريان البشري للنسخ المكاني. يمكن إجراء البروتيوميات والنسخ والفحوصات الوظيفية على الخلايا المعزولة. يمكن إعادة استخدام هذا البروتوكول لأي شريان متوسط أو كبير الحجم.

عزل وتوصيف الخلايا البطانية الشريانية المساريقية الأولية البشرية على مستوى النسخ

Endothelial cells (ECs) are crucial for vascular and whole-body function through their dynamic response to environmental cues. Elucidating the ...

يعد توصيف التعبير الجيني على المستوى النسخي أمرا أساسيا لفهم وظيفة الخلية في الصحة والمرض. تركز طريقتنا على التقاط الخلايا البطانية ، وهي الطبقة الحاسمة من جدار الأوعية الدموية ، من الشرايين المينستيرية للمتبرعين البشريين للتنميط النسخي بدقة أحادية الخلية ومكانية. هناك مجموعة غنية من الخلايا البطانية من وعاء دون خطوة فرز ، والتي يمكن أن تسبب فقدان الخلايا.علاوة على ذلك ، توجد أنواع أخرى من الخلايا تسمح بالتحقيق في تفاعلات الخلايا الخلوية في سياق الأنسجة. لقد استخدمنا هذه التقنية للتحقيق في التغيرات الشريانية في مرض السكري والسمنة. اعتمادا على توافر السفينة ، يمكن أيضا إعادة استخدام هذه التقنيات لاستكشاف البيولوجيا في الأوعية الدموية الأخرى والأمراض الأخرى.إذا كانت هذه هي المرة الأولى ، فإن خطوتين رئيسيتين تتطلبان أكبر قدر من الممارسة. أولا، الكشط، على الرغم من أنه ينبغي بذل القوة الكافية لإزالة الخلايا المتكاملة دون فصل الطبقات الأعمق. والثاني ، تقسيم cryostat.تأكد من أن الأقسام باردة ومسطحة وداخل حدود الشريحة المتخصصة. سيوضح الإجراء Yingjun Luo و Xiaofang Tang ، وهما باحثان في مرحلة ما بعد الدكتوراه من مختبري. لبدء غسل الأنسجة مع DPBS.باستخدام ملقط معقم ومقص تشريح ، قم بإزالة الدهون والأنسجة الضامة الخارجية حتى يصبح الوعاء نظيفا. قم بقياس طول الوعاء باستخدام مسطرة موضوعة خارج الطبق والتقط سجلات فوتوغرافية. قطع الشريان المساريقي بالطول باستخدام مقص لفتح تجويف الوعاء عموديا.باستخدام الإبر ، قم بتوصيل الوعاء بالشمع الأسود في جميع الزوايا الأربع ، مما يعرض العلاقة الحميمة. أضف ملليلتر واحد من مخزن الهضم العازل المسخن مسبقا إلى العلاقة الحميمة. باستخدام مشرط معقم ، كشط بلطف تجويف الوعاء مرتين.انقل المخزن المؤقت للهضم إلى أنبوب. أضف ملليلتر واحد من مخزن الهضم المؤقت إلى intima وماصة لأعلى ولأسفل بعناية لجمع الخلايا المتبقية ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق في حاضنة أو على هزاز.أضف وسط M199 إلى تعليق الخلية لإخماد التفاعل الأنزيمي واخلطه بلطف. قم بالطرد المركزي للتعليق لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية و 600 مرة G.At نهاية جهاز الطرد المركزي ، وقم بإزالة وتخزين المادة الفائقة بشكل منفصل كثقافة تحكم لمراقبة ما إذا كانت جميع الخلايا قد تم التقاطها في الكريات. ثم ، أعد تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من وسط M199.تقييم جدوى الخلية عن طريق خلط 10 ميكرولترات من التربان الأزرق مع 10 ميكرولتر من مخزون الخلايا. راقب مورفولوجيا الخلية وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم. قم بتغطية بئرين من صفيحة من ستة آبار عن طريق سحب 500 ميكرولتر من كاشف التعلق في الآبار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد غسل الآبار باستخدام DPBS المعقم ، قم بتوزيع مخزون الخلايا الكامل في بئر واحد ، ويتم الاحتفاظ بالمادة الفائقة كعنصر تحكم في البئر الثاني. جهاز الطرد المركزي أعد مسبقا مخزون الخلايا عند أربع درجات مئوية و 600 مرة G لمدة خمس دقائق. قم بإزالة السوبرناتانت وأعد تعليق الكريات بلطف باستخدام ماصة P-1000 في 0.04٪ BSA في DPBS.اخلطي جيدا لضمان تعليق أحادي الخلية. مرر المحلول من خلال مصفاة 40 ميكرومتر لإزالة حطام الخلايا. ثم ، الطرد المركزي للتعليق وإزالة supernatant كما هو موضح.أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من 0.04٪ BSA في DPBS باستخدام ماصة P-1000 واخلطها جيدا لضمان تعليق خلية واحدة. كما هو موضح سابقا ، قم بتقييم صلاحية الخلية باستخدام أزرق التربان. باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي ، راقب مورفولوجيا تعليق الخلية الواحدة ، وتحقق من وجود حطام الأنسجة ، واحسب عدد الخلايا الحية والميتة.بعد إضافة الأيزوبنتان إلى علبة معدنية، قم بتبريده في النيتروجين السائل أو الثلج الجاف. صب مركب OCT في آبار من قالب التبريد البلاستيكي المسمى ، ومنع تكوين فقاعة. اترك قالب التبريد على الثلج الجاف ليبرد.قطع ما لا يقل عن قسمين إكليليين من سنتيمتر واحد في طول السفينة. باستخدام ملقط 12 بوصة ، غمر الأنسجة في الأيزوبنتان حتى يتم تجميدها. قم بغمر الأنسجة بسرعة في OCT عند التوجيه مع التجويف المرئي في المركز.أمسك قوالب التبريد وضعها على الثلج الجاف وراقب التجميد. سيصبح OCT أبيض تدريجيا من الخارج في غضون دقيقة إلى دقيقتين. قم بتخزين هذه الأقسام في حاوية آمنة عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى ستة أشهر.قم بإعداد درجة حرارة cryostat المطلوبة للغرفة ورأس العينة. قم بموازنة مقاطع الأوعية والسكاكين والفرش والشرائح المضمنة في OCT إلى 20 درجة مئوية تحت الصفر في cryostat لمدة 30 دقيقة تقريبا. أثناء التوازن ، قم بتنظيف الماكينة وجميع المعدات التي قد تلمس الأقسام ، بما في ذلك الشفرة ، باستخدام 70٪ من الإيثانول متبوعا بمحلول إزالة التلوث RNase.قم بإرفاق العينة عن طريق توزيع كمية صغيرة من OCT على كتلة cryostat الدائرية ووضع العينة في الأعلى قبل أن تتجمد. بعد وضع الكتلة في وسط رأس العينة ، قم بتثبيت الكتلة في مكانها باستخدام المقبض الأسود الطويل على اليسار. قطع أي OCT الزائدة المحيطة السفينة.ضبط سمك القطع على 10 ميكرومتر على المبرد ، وقطع ما يقرب من 60 قسما ووضعها في أنبوب 1.5 ملليلتر مبرد مسبقا يحتوي على كاشف استخراج الحمض النووي الريبي. دوامة حتى يتم حل الأقسام تماما. استخراج الحمض النووي الريبي كما هو موضح في مخطوطة النص وإذابة بيليه الحمض النووي الريبي النقي في خمسة ميكرولترات من الماء الخالي من RNase.قطع أقسام سميكة 10 ميكرومتر مع لوحة مضادة للتدحرج في مكانها. اقلب وقم بتسطيحه بعناية عن طريق لمس القسم بلطف من خلال OCT المحيط. امسح الشريحة بالإيثانول وقم بتسخين الجانب الخلفي من منطقة الالتقاط مسبقا بإصبعك.باستخدام فرش cryostat الخالية من RNase أو الشريحة مباشرة ، ضع قسم الأنسجة داخل المربع باستخدام OCT المحيط فقط. بمجرد أن يلتصق القسم، ضع الشريحة على شريط التبريد للسماح للقسم بالتجمد.قطع أقسام الأنسجة التي يبلغ سمكها 10 ميكرومتر كما هو موضح سابقا على شرائح تحسين الأنسجة أو التعبير الجيني. انقل الشريحة إلى بريدية شرائح موضوعة على الثلج الجاف. يصور الشكل ECs المعزولة المستزرعة باستخدام البروتوكول الموصوف الذي يعرض مورفولوجيا مميزة تشبه الحصى مع الحد الأدنى من الخلايا الملوثة.تم تأكيد التعبير عن الكادهيرين البطاني الوعائي لعلامة EC باستخدام التألق المناعي الذي يصور التقاطعات من خلية إلى خلية. كان ما يقرب من 80٪ من الخلايا إيجابية CD31 ، مما يشير إلى أن ECs الشريانية المساريقية البشرية تشكل معظم مجموعة الخلايا المعزولة حديثا. تؤدي عمليات العزل غير الناجحة إلى خلايا ذات مورفولوجيا مضطربة ، يحتمل أن تعبر عن علامات اللحمة المتوسطة أو استطالة تشبه حالة الأرومة الليفية.ويبين الشكل تقريب وإسقاط تمثيلي موحد متعدد معزول للشريان المساريقي باستخدام البروتوكول الحالي لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية على ECS الشرياني المساريقي البشري المعزول، مع تجميع 34٪ من الخلايا على شكل ECs باستخدام PECAM1 و VWF كعلامات. يجب أن يظهر الحمض النووي الريبوسومي ذو الجودة العالية رقم سلامة الحمض النووي الريبوسومي لا يقل عن ستة ، ونسبة نطاقات الحمض النووي الريبوسومي الريبوسومي 28S إلى 18S قريبة من اثنين قدر الإمكان. يمكن ملاحظة ضعف أو غياب إشارات الحمض النووي الريبوسومي هذه عند تحلل الحمض النووي الريبي.تصور تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين مورفولوجيا السفينة ، مما يسمح بتحديد المناطق ذات الأهمية. تم تصور التعبير الجيني مع التثبيت المكاني على الوعاء الملطخ بالهيماتوكسيلين والإيوزين. تعامل مع مخزون الأنسجة والخلايا بعناية للحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي ، خاصة بالنسبة للتنميط المكاني.تأكد من وضع الأنسجة على الثلج الجاف للحد من تدهور الحمض النووي الريبي. أيضا ، تعامل مع الأقسام والأنسجة باستخدام أدوات مبردة مسبقا. لقد تمكنا من استكشاف تغيرات التعبير الجيني EC ، بما في ذلك LncRNAs في سياق مرض السكري وتفاعلها مع أنواع الخلايا الأخرى.يمكننا استنتاج موقع هذه التغييرات النسخية باستخدام تقنيات التنميط المكاني.

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

تحديد وعزل بطيئة تقسيم الخلايا في الإنسان عن طريق ورم أرومي دبقي كربوكسي فلوريسئين Succinimidyl استر (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

عزل الخلايا الجذعية للسرطان من العينات البشرية سرطان البروستاتا

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

العزلة، والحفظ بالتبريد والثقافة من الخلايا الظهارية البشرية السلى للتطبيقات السريرية

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

عزل خلايا الإنسان اللمفاوي البطانية التي كتبها متعدد المعلمة تنشيط الإسفار الفرز خلية

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

العزلة وثقافة توسيع ورم محددة الخلايا البطانية

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

جيل من Microtumors عن طريق نظام الثقافة 3D Biogel الإنسان وخلايا ورم أرومي دبقي المستمدة من المريض لKinomic التنميط والدواء استجابة اختبار

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

العزلة ومن التنميط Exosomes من الصفراء الإنسان التي تحتوي على الرنا الميكروي

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية الأولية من الشرايين والأوردة الكلاب

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

عزل خلايا Decidual البشرية الأولية من الأغشية الجنينية لمصطلح مترافق

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...