Name: isolation and profiling of human primary mesenteric arterial endothelial cells at the transcriptome level
Uploaded: 2022-03-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (til Z.B.C.); DP1DK126138 og DP1HD087990 (til S.Z.); et Ella Fitzgerald Foundation-stipend og et Wanek-familieprosjekt (til Z.B.C.); og et Human Cell Atlas frønettverksstipend (til Z.B.C. og S.Z.). Forskning rapportert i denne publikasjonen inkluderte arbeid utført i Integrative Genomics Core ved City of Hope støttet av National Cancer Institute of the National Institutes of Health under tildelingsnummer P30CA033572. Forfatterne vil takke Dr. Ismail Al-Abdullah og Dr. Meirigeng Qi fra holmetransplantasjonsteamet i City of Hope for isolering av humant vev, Dr. Dongqiang Yuan ved City of Hope for hans hjelp med scRNA-seq analyse, og Dr. Marc Halushka ved Divisjon for kardiovaskulær patologi, Johns Hopkins University School of Medicine for sin uvurderlige innsikt i vaskulær histologi.

Humane vevsstudier ble utført på deidentifiserte prøver hentet fra Southern California Islet Cell Resource Center ved City of Hope. Forskningssamtykket for bruk av postmortem humant vev ble innhentet fra givernes pårørende, og etisk godkjenning for denne studien ble gitt av Institutional Review Board of City of Hope (IRB Nr. 01046).
1. Fysisk dissosiasjon (estimert tid: 1-2 t)
<ol><li>Legg en fersk arterie på en 10 cm tallerken og vask med steril Dulbeccos fosfatbufred...

Den presenterte arbeidsflyten beskriver et sett med teknikker for å profilere ECer fra et enkelt stykke menneskelig arterie med encellet og romlig oppløsning. Det er flere kritiske trinn og begrensende faktorer i protokollen. En nøkkel til transkripsjonsprofilering er friskheten i vevet og RNA-integriteten. Det er viktig å opprettholde vev på is så mye som mulig før behandling for å minimere RNA-nedbrytning. Vanligvis behandles post-mortem vev mellom 8-14 timer etter dødstidspunktet. Men å begynne isolasjonen e...

Fôr lumen i blodårene, endotelceller (ECs) er avgjørende regulatorer for vaskulær tone og vevsperfusjon. ECs er bemerkelsesverdige i deres evne til å reagere på det ekstracellulære miljøet og tilpasse seg endringer i dynamikken og sammensetningen av blodstrømmen. Disse dynamiske svarene formidles gjennom et nettverk av intracellulære signalhendelser, inkludert transkripsjonelle og posttranskripsjonelle moduler med romlig-temporal oppløsning. Dysreguleringen av disse svarene er involvert i mange patologier, inkludert, men ikke begrenset til kardiovaskulær sykdom, diabetes og kreft 1,2.
En stor andel av studiene benytter seg av cellelinjer eller dyremodeller for å forhøre EC-transkripsjon. Førstnevnte er et nyttig verktøy, gitt den relative brukervennligheten og billigheten. Imidlertid kan seriell culturing introdusere fenotypiske endringer på ECs, for eksempel fibroblastiske funksjoner og mangel på polarisering, og koble dem fra in vivo-tilstand 3. Primærcellene, for eksempel, human navlestreng EC (HUVEC) har vært et populært valg siden 1980-tallet, men er avledet fra en utviklingsmessig vaskulær seng som ikke eksisterer hos voksne, og dermed usannsynlig å representere modne ECer fullt ut. Dyr, spesielt musemodeller, representerer bedre det fysiologiske eller patofysiologiske miljøet i ECs og tillater forhør av transkripsjoner som følge av genetisk perturbasjon. Murine ECs kan isoleres fra ulike vev, inkludert aorta, lunger og fettvev ved hjelp av enzymbaserte prosedyrer 4,5,6,7. De isolerte cellene kan imidlertid ikke brukes til flere passasjer med mindre de er forvandlet6 og ofte er begrenset i antall, noe som krever sammenslåing fra flere dyr 5,8,9.
Fremveksten av ny teknologi som utforsker fartøyarkitekturen på et trans transcriptomisk nivå, spesielt med encellet oppløsning, har gjort det mulig for en ny æra av endotelbiologi ved å avsløre nye funksjoner og egenskaper til ECs 5,10,11,12,13,14. En rik ressurs bygget av Tabula Muris-etterforskere samlet inn encellede transkripsjonsprofiler på 100 000 celler, inkludert ECer over 20 forskjellige murinorganer15, som avslørte både vanlige EC-markørgener og unike transkripsjonssignaturer med inter- og intravevsforskjeller 5,13. Likevel er det klare forskjeller mellom mus og menneske i genom, epigenom og transkripsjon, spesielt i ikke-kodingsregionene 16,17,18. Disse nevnte ulempene understreker viktigheten av analyse av ECs ved hjelp av menneskelige prøver for å få en trofast profil av ECs i sin opprinnelige tilstand i helse og sykdom.
De fleste EC-isolasjonsmetoder er avhengige av fysisk dissosiasjon gjennom homogenisering, finskjæring og gruvedrift av vevet før inkubasjon med proteolytiske enzymer i forskjellige tider. Enzymene og forholdene varierer også betydelig mellom vevstyper, fra trypsin til kollagenase, brukt alene eller i kombinasjon 19,20,21. Ytterligere antistoffbasert berikelse eller rensing er ofte inkludert for å øke renheten til ECs. Vanligvis er antistoffer mot EC-membranmarkører, for eksempel CD144 og CD31, konjugert til magnetiske perler og lagt til celleopphenget22,23. En slik strategi kan generelt tilpasses for EC-isolasjon fra flere menneske- og musevev, inkludert teknikkene som er introdusert i denne protokollen.
I sin opprinnelige tilstand samhandler ECs med flere celletyper og kan eksistere i vaskulære nisjer der celle nærhet er avgjørende for funksjon. Mens single-cell og single-nuclear RNA-sekvensering (scRNA og snRNA-seq) studier har vært avgjørende for de siste gjennombruddene i å beskrive EC heterogeneity, forstyrrer dissosiasjonsprosessen vevskontekst og cellecellekontakt, som også er viktig for å forstå EC-biologi. Utviklet i 2012 og kalt Årets metode i 202024, har romlig transkripsjonsprofilering blitt brukt til å profilere globalt genuttrykk samtidig som de beholder de romlige egenskapene i ulike vev, inkludert hjerne25,tumor 26 og fettvev27. Teknologiene kan målrettes ved hjelp av spesialiserte sonder som er spesifikke for bestemte RNA-sekvenser festet til affinitetsreagenser eller fluorescerende koder, og dermed oppdage utvalgte gener ved subcellulær oppløsning 28,29,30,31. De kan også være umålte32,33, vanligvis ved hjelp av romlig strekkodede oligonukleotider for å fange RNA, som sammen blir konvertert til cDNA for etterfølgende seq bibliotek forberedelse og dermed har fordelen av å utlede hele vev genuttrykk på en objektiv måte. Romlig oppløsning oppnås imidlertid for øyeblikket ikke på et enkelt mobilnivå med kommersielt tilgjengelige teknologier. Dette kan til en viss grad overvinnes med dataintegrasjon med scRNA-seq-data, slik at kartleggingen av encellet transkripsjon i en kompleks vevskontekst samtidig som den beholder sin opprinnelige romlige informasjon34.
Her er en arbeidsflyt beskrevet for å profilere EC-transkripsjon ved hjelp av human overlegen mesenterisk arterie, en perifer arterie som har blitt brukt til å studere vasodilatasjon, vaskulær ombygging, oksidativt stress og betennelse 35,36,37. To teknikker er beskrevet: 1) å isolere og berike ECs fra intima av blodkar som kombinerer mekanisk dissosiasjon og enzymatisk fordøyelse egnet for encellet transkripsjon sekvensering eller påfølgende in vitro kultur; 2) å forberede arterielle seksjoner for romlig transkripsjonsprofilering (figur 1). Disse to teknikkene kan utføres uavhengig eller komplementært for å profilere ECs og deres omkringliggende celler. Videre kan denne arbeidsflyten tilpasses for bruk på et hvilket som helst medium eller stor arterie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AC327270010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14100150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14282300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>07-000-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment factor</td>
			<td>Cell Applications</td>
			<td>123-500</td>
			<td>Attachment reagent in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black wax</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any commercial black wax can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin heat shock treated</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat brushes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT25950CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>Bacteria-derived protease in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Safety Scalpels</td>
			<td>Myco Instrumentation</td>
			<td>6008TR-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14080055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High sensitivity D1000 sample buffer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High sensitivity D1000 screen tape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kept at 37 &#176;C 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP26324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2520-10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal cannister</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>To assess cell morphology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvascular endothelial culture medium</td>
			<td>Cell Applications</td>
			<td>111-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature compound</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>4585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cryomolds</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA screen tape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA screen Tape sample buffer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase ZAP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR036B</td>
			<td>RNase-free water (2) in kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12&#34; long forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91100-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile fine scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost PLUS Gold Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1518848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td>Cell-dissociation enzyme in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visium Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>PN-1000215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visium Gateway Package, 2rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>PN-1000316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visium Spatial Gene Expression Slide &#38; Reagent Kit, 4 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>PN-1000184</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and profiling of human primary mesenteric arterial endothelial cells at the transcriptome level

Endotelceller (ECer) er avgjørende for vaskulær og helkroppsfunksjon gjennom deres dynamiske respons på miljøsignaler. Å belyse transkripsjonen og epigenomet til ECs er avgjørende for å forstå deres roller i utvikling, helse og sykdom, men er begrenset i tilgjengeligheten av isolerte primærceller. Nyere teknologier har gjort det mulig med høy gjennomstrømningsprofilering av EC-transkripsjon og epigenom, noe som har ført til identifisering av tidligere ukjente EC-celleunderbefolkninger og utviklingsbaner. Mens EF-kulturer er et nyttig verktøy i utforskningen av EC-funksjon og dysfunksjon, kan kulturforholdene og flere passasjer introdusere eksterne variabler som endrer egenskapene til innfødt EC, inkludert morfologi, epigenetisk tilstand og genuttrykksprogram. For å overvinne denne begrensningen demonstrerer det nåværende papiret en metode for å isolere menneskelige primære ECer fra donormesenteriske arterier som tar sikte på å fange sin opprinnelige tilstand. ECs i det organisatoriske laget er dissosiert mekanisk og biokjemisk ved bruk av bestemte enzymer. De resulterende cellene kan brukes direkte til bulk RNA eller encellet RNA-sekvensering eller belagt for kultur. I tillegg er en arbeidsflyt beskrevet for fremstilling av humant arterielt vev for romlig transkripsjon, spesielt for en kommersielt tilgjengelig plattform, selv om denne metoden også er egnet for andre romlige transkripsjonsprofileringsteknikker. Denne metodikken kan anvendes på ulike fartøy samlet inn fra en rekke givere i helse- eller sykdomstilstander for å få innsikt i EF-transkripsjonell og epigenetisk regulering, et sentralt aspekt ved endotelcellebiologi.

Analysen av ECs fra mesenterisk arterie ved hjelp av en kombinasjon av mekanisk og enzymatisk dissosiasjon eller kryopreservering for bruk i ulike nedstrømsanalyser er avbildet her (figur 1). ECs kan profileres i mesenteriske arterier ved hjelp av følgende trinn: A) mekanisk dissosiasjon fra intima kombinert med kollagenalisse fordøyelse til kulturceller; B) generering av encellet suspensjon for scRNA-seq; eller C) tverrsnitt av arterien kan bygges inn i OCT for å bli kryoseksjonert for ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level at JoVE.com

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

Protokollen beskriver isolasjon, kultur og profilering av endotelceller fra human mesenterisk arterie. I tillegg er det gitt en metode for å forberede menneskelig arterie for romlig transkripsjon. Proteomikk, transkripsjon og funksjonelle analyser kan utføres på isolerte celler. Denne protokollen kan gjenbrukes for alle middels eller store arteri.

Isolering og profilering av humane primære mesenteriske arterielle endotelceller på transkripsjonsnivå

Endothelial cells (ECs) are crucial for vascular and whole-body function through their dynamic response to environmental cues. Elucidating the ...

Karakterisering av genuttrykk på transkripsjonsnivå er nøkkelen til å forstå cellefunksjon i helse og sykdom. Vår metode fokuserer på å fange endotelceller, det avgjørende laget av den vaskulære veggen, fra menneskelige donorers menesteriske arterier for transkripsjonsprofilering med en enkeltcellet og romlig oppløsning. Det er en beriket populasjon av endotelceller fra et fartøy uten et sorteringstrinn, noe som kan forårsake celletap.Videre finnes det andre celletyper som tillater undersøkelse av cellecelleinteraksjoner i vevskonteksten. Vi har brukt denne teknikken til å undersøke arterielle endringer i diabetes og fedme. Avhengig av fartøyets tilgjengelighet, kan disse teknikkene også gjenbrukes til å utforske biologi i andre vaskulatur og andre sykdommer.Hvis det er første gang, krever to viktige trinn mest øvelse. En, skraping, selv om tilstrekkelig kraft bør utøves for å fjerne integrerte celler uten å løsne dypere lag. Og to, kryostat-seksjonering.Forsikre deg om at seksjonene er kalde, flate og er innenfor rammene til det spesialiserte lysbildet. Demonstrerer prosedyren vil være Yingjun Luo og Xiaofang Tang, to postdoktorer fra laboratoriet mitt. For å begynne å vaske vevet med DPBS.Med sterile tang og disseksjonssaks fjerner du fettet og det ytre bindevevet til karet er rent. Mål fartøyets lengde med en linjal plassert utenfor fatet og ta fotografiske poster. Klipp den mesenteriske arterien på langs med saks for å åpne fartøyet lumen vertikalt.Bruk nåler, fest fartøyet på svart voks på alle fire hjørner, og eksponer intimaen. Tilsett en milliliter forvarmet fordøyelsesbuffer til intima. Bruk en steril skalpell til å skrape fartøyets lumen forsiktig to ganger.Overfør fordøyelsesbufferen til et rør. Tilsett en milliliter fordøyelsesbuffer til intima og pipette opp og ned forsiktig for å samle de resterende cellene og overføre cellefjæringen til et rør. Inkuber celler ved 37 grader Celsius i fem minutter i en inkubator eller på en rocker.Tilsett M199 medium i cellefjæringen for å slukke den enzymatiske reaksjonen og bland forsiktig. Sentrifuger suspensjonen i fem minutter ved fire grader Celsius og 600 ganger G.At slutten av sentrifugeringen, fjern og lagre supernatanten separat som en kontrollkultur for å observere om alle cellene er fanget i pelletsen. Deretter suspenderer du cellepelleten i en milliliter M199 medium.Vurder cellens levedyktighet ved å blande 10 mikroliter trypanblå med 10 mikroliter cellelager. Vær oppmerksom på cellemorfologien og tell cellene ved hjelp av et hemocytometer. Belegge to brønner av en seksbrønnsplate ved å pipettere 500 mikroliter festereagens i brønner i 30 minutter ved romtemperatur.Etter å ha vasket brønnene med steril DPBS, dispenser hele cellelageret i en brønn, og supernatanten holdes som en kontroll inn i den andre brønnen. Sentrifuge tidligere forberedt celle lager på fire grader Celsius og 600 ganger G i fem minutter. Fjern supernatanten og suspender pellet forsiktig med en P-1000 pipette i 0,04% BSA i DPBS.Bland godt for å sikre en encellet suspensjon. Før løsningen gjennom en 40-mikrometer sil for å fjerne celleavfall. Sentrifuger deretter suspensjonen og fjern supernatanten som vist.Re-suspendere pellet i 500 mikroliter av 0,04% BSA i DPBS ved hjelp av en P-1000 pipette og bland godt for å sikre en encellet suspensjon. Som vist tidligere, vurder cellens levedyktighet ved hjelp av trypan blå. Bruk et hemocytometer eller automatisert celleteller, observere encellet suspensjonsmorfologi, se etter vevsrester og beregn antall levende og døde celler.Etter å ha tilsendet isopentan til en metallbeholder, kjøl i flytende nitrogen eller tørris. Hell OCT-forbindelsen i brønner av merket plastkryoform, og forhindre bobledannelse. La kryoform på tørris avkjøles.Klipp minst to koronaldeler på en centimeter i fartøyets lengde. Bruk 12-tommers tang, senk vevet i isopentan til det er frosset. Senk raskt vevet i OCT ved orientering med lumen synlig i midten.Ta tak i og legg kryoformene på tørris og følg frysepunktet. Okt vil bli hvit gradvis fra utsiden om ett til to minutter. Oppbevar disse seksjonene i en sikret beholder ved minus 80 grader Celsius i opptil seks måneder.Sett opp ønsket kryostattemperatur for kammeret og prøvehodet. Likevekt OCT-innebygde karseksjoner, kniver, børster og sklier til minus 20 grader Celsius i kryostaten i ca. 30 minutter. Rengjør maskinen og alt utstyr som kan berøre seksjonene, inkludert bladet, med 70 % etanol etterfulgt av RNase-dekontamineringsløsning mens du likevekter.Fest prøven ved å dispensere en liten mengde OKT på den sirkulære kryostatblokken og plasser prøven på toppen før den fryser. Etter å ha plassert blokken i midten av prøvehodet, skru blokken på plass ved hjelp av det høye svarte håndtaket til venstre. Skjær bort overflødig OCT rundt fartøyet.Sett skjæretykkelsen til 10 mikrometer på kryostaten, kutt ca. 60 seksjoner og legg dem i et forhåndskjølt 1,5 milliliterrør som inneholder RNA ekstraksjonsreagens. Virvel til seksjonene er fullstendig oppløst. Trekk ut RNA som beskrevet i tekstmanuskriptet og oppløs den rensede RNA-pelletsen i fem mikroliter RNase-fritt vann.Klipp 10 mikrometer tykke seksjoner med anti-roll plate på plass. Vend og flat forsiktig ved å berøre delen forsiktig gjennom den omkringliggende OKT. Tørk av lysbildet med etanol og forvarm baksiden av fangstområdet med fingeren.Bruk RNase-frie kryostatbørster eller sklien direkte, plasser vevsdelen innenfor torget med bare den omkringliggende OKT. Plasser straks en finger på baksiden av fangstområdet for å smelte delen til lysbildet. Når delen fester seg, plasserer du lysbildet på kryolinjen slik at delen kan fryse.Klipp 10 mikrometer tykke vevsseksjoner som vist tidligere på vevsoptimalisering eller genuttrykkssklier. Overfør skredet til en lysbildepost som er plassert på tørris. Figuren skildrer isolerte ECer dyrket ved hjelp av den beskrevne protokollen som viser en distinkt brosteinlignende morfologi med minimale forurensende celler.Uttrykk for EC-markør vaskulær endotel kaderin ble bekreftet ved hjelp av immunfluorescens visualisere celle-til-celle-kryss. Omtrent 80% av cellene var CD31-positive, noe som indikerer at humane mesenteriske arterielle ECer utgjorde det meste av den nyisolerte cellepopulasjonen. Mislykkede isolasjoner resulterer i celler med forstyrret morfologi, som potensielt uttrykker mesenchymale markører eller forlengelse som ligner en fibroblastisk tilstand.Figuren viser en representativ ensartet manifold-tilnærming og projeksjon isolert for mesenterisk arterie ved hjelp av den nåværende protokollen for encellet RNA-sekvensering på isolert humant mesenterisk arteriell ECS, med 34% celler gruppert som ECer som bruker PECAM1 og VWF som markører. RNA av høy kvalitet bør vise et RNA-integritetsnummer ikke mindre enn seks, og forholdet mellom 28S og 18S ribosomale RNA-bånd er så nær to som mulig. En svak eller fravær av disse ribosomale RNA-signalene kan observeres når RNAer forringes.Hematoksylin og eosinfarging visualiserte fartøyets morfologi, slik at interesseområder kunne identifiseres. Genuttrykk ble visualisert med romlig forankring på hematoksylin- og eosinfarget kar. Håndter vev og cellelager nøye for å opprettholde RNA-kvalitet, spesielt for romlig transkripsjonsprofilering.Sørg for at vevet er plassert på tørris for å redusere RNA-nedbrytning. Håndter også seksjonene og vevet med forkjølte instrumenter. Vi har vært i stand til å utforske ENDRINGER i EC-genuttrykk, inkludert LncRNAer i sammenheng med diabetes og deres interaksjon med andre celletyper.Vi kan utlede plasseringen av disse transkripsjonsendringene ved hjelp av romlige transkripsjonsprofileringsteknikker.

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolasjon, karakterisering og Comparative Differensiering av Human tannpulpa stamceller hentet fra permanente tenner ved hjelp av to ulike metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering av kreft stamceller fra menneskelige prostata kreft Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolasjon, Kryopreservering og kultur menneskerettighets amnion Epitelceller for kliniske anvendelser

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolering av human lymfatisk endotelceller ved Multi-parameter fluorescens-aktivert cellesortering

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolation and Culture Utvidelse av tumor-spesifikke endotelceller

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Generering av Microtumors Bruke 3D Menneskelig Biogel Kultur System og pasient-avledet glioblastom celler for Kinomic Profilering and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Isolasjon og profilering av mikroRNA holdig Exosomes fra Menneskelig Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolasjon og Culture of Primary endotelceller fra Canine arterier og vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Isolering av primære Decidual menneskeceller fra fosterets membraner av begrepet Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...