Name: registration of calcium transients in mouse neuromuscular junction with high temporal resolution using confocal microscopy
Uploaded: 2021-12-01T14:00:00
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这项工作的荧光研究在俄罗斯科学基金会赠款（项目编号19-15-00329）的资助下进行。该方法是在政府为RAS АААААА-А18-118022790083-9的喀山科学中心分配的资助下开发的。该研究是使用联邦研究中心“RAS喀山科学中心”的设备开发的。作者要感谢Victor I. Ilyin博士对这份手稿的批判性阅读。

对来自小鼠BALB / C（20-23g，2-3个月大）的分离神经肌肉制剂进行实验41。 实验程序按照喀山联邦大学和喀山医科大学的实验动物使用指南进行，符合NIH实验动物护理和使用指南。实验方案符合欧洲共同体理事会指令86/609/EEC的要求，并得到喀山医科大学伦理委员会的批准。
1. 林格氏和归档解决方案的准备
<ol><li>通过混合以下成分来制备哺?...

本文介绍了通过神经残端将Ca2+敏感染料加载到小鼠神经末梢以及使用共聚焦显微镜记录快速钙瞬变的方法。由于实施了这种加载方法，位于神经残端附近的大多数突触具有足够的荧光水平，以记录钙进入神经末梢以响应运动神经的低频刺激。
与之前提出的通过残肢加载钙染料的方案不同，该协议设计用于哺乳动物突触。以前用于冷血动物制剂的方案需要过夜孵育<sup ...

在可兴奋细胞中测量快速钙波的问题是研究中枢和周围神经系统信号传输的最重要和最具挑战性的方面之一。钙离子在触发神经递质释放、突触可塑性和调节各种细胞内蛋白的活性方面起着重要作用1，2，3，4，5。研究钙信号传导对于寻找治疗神经退行性疾病的方法也很重要6。为了测量钙水平的变化，通常使用荧光钙敏感染料，并分析其荧光水平的变化7，8，9。
钙染料加载到细胞中可以通过不同的方式实现。主要使用细胞渗透性染料10，11。然而，在这种情况下，不仅难以控制细胞内染料的浓度，而且也很难选择目标细胞进行上样。该方法不适用于研究周围神经末梢，因为染料进入突触后细胞。相反，细胞不透透的染料更适合这种制剂。在这种情况下，染料通过显微注射或通过贴片移液管12，13，14递送到细胞。还有一种通过神经残端加载的方法。后一种方法最适合于神经肌肉接头制剂15，16，17，18，19，20。它允许仅对感兴趣的细胞进行染色。尽管该方法不能准确评估靶细胞中染料的浓度，但可以通过比较溶液中静止细胞的荧光水平与已知浓度的钙21来近似估计浓度。在这项研究中，提出了应用于哺乳动物突触的该方法的修改。
在动作电位的去极化阶段钙进入是一个快速的过程，特别是在神经肌肉接头;因此，对于其注册，需要适当的设备1.最近使用电压敏感荧光染料的一项研究表明，小鼠外周突触中动作电位的持续时间约为300μs22。在青蛙的外围突触中使用钙敏感染料评估钙瞬变的持续时间更长：上升时间约为2-6毫秒，衰减时间约为30-90毫秒，具体取决于使用的钙染料23，24。为了在荧光染料的帮助下测量快速过程，通常使用CCD或CMOS相机，以及快速灵敏的CCD矩阵。然而，这些相机具有低分辨率的缺点，受限于矩阵25、26、27、28的敏感元件的大小。最快的相机具有足够的灵敏度来记录响应细胞低频刺激的动作电位和钙瞬变，扫描频率为2，000 Hz，矩阵尺寸为80 x 8029。为了获得具有更高空间分辨率的信号，使用共聚焦显微镜，特别是当需要评估信号中的一些体积变化时30，31，32。但应该记住，共聚焦显微镜在线扫描模式下具有很高的扫描速度，但在构建空间图像时，记录快速过程的速度仍然存在显着限制33。有基于旋转Nipkow盘（狭缝扫描显微镜）的共聚焦显微镜和具有更高扫描速度的多点阵列扫描仪。同时，它们在共聚焦图像滤波（带有Nipkow盘的显微镜的针孔串扰）方面不如经典共聚焦显微镜32，34，35。具有共振扫描的共聚焦成像还可以提供高时间测量所需的高时空分辨率36。然而，考虑到当使用共振扫描仪时，以高扫描速度配准弱荧光响应需要高灵敏度的检测器，例如混合检测器36。
本文提出了一种提高激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）记录的信号的时间分辨率，同时保持空间分辨率37的方法。目前的方法是前面描述的方法的进一步发展，并转移到LSCM平台38，39，40。这种方法不需要改变显微镜硬件，并且基于一种算法的应用，用于记录周期性诱发的荧光信号，具有相对于刺激时刻的时间偏移。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Clark Electromedical instruments, UK</td>
			<td>GC150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP</td>
			<td>Leica Microsystems , Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller P 97</td>
			<td>Sutter Instrument, USA</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow regulator</td>
			<td>KD Medical GmbH Hospital Products, Germany</td>
			<td>KD REG</td>
			<td>Disposable infusion set with Flow regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H0887</td>
			<td>100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system Leica CLS 150X</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Las AF software</td>
			<td>Leica Microsystems, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Las X software</td>
			<td>Leica Microsystems, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Holder with Suction Tubing</td>
			<td>BIOSCIENCE TOOLS, USA</td>
			<td>MTH-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspin FV 2400</td>
			<td>Biosan, Latvia</td>
			<td>BS-010201-AAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine science tools, Canada</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-spin MSC 3000</td>
			<td>Biosan, Latvia</td>
			<td>BS-010205-AAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>O6806</td>
			<td>500 &#956;g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Biohit, Russia</td>
			<td>720210</td>
			<td>0.5-10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip</td>
			<td>Biohit, Russia</td>
			<td>781349</td>
			<td>10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine</td>
			<td>local producer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use hypodermic needles</td>
			<td>Bbraun</td>
			<td>100 Sterican</td>
			<td>0.4&#215;40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft, USA</td>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems , Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction electrode</td>
			<td>Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal.&#160;- 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16.</td>
			<td></td>
			<td>http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer</td>
			<td>Dow Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>local producer</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>local producer</td>
			<td></td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

registration of calcium transients in mouse neuromuscular junction with high temporal resolution using confocal microscopy

突触前钙水平的估计是研究突触传递的关键任务，因为钙进入突触前细胞会触发导致神经递质释放的级联事件。此外，突触前钙水平的变化介导了许多细胞内蛋白的活性，并在突触可塑性中起重要作用。研究钙信号传导对于寻找治疗神经退行性疾病的方法也很重要。神经肌肉接头是研究突触可塑性的合适模型，因为它只有一种类型的神经递质。本文描述了通过切割的神经束将钙敏感染料加载到小鼠运动神经末梢的方法。该方法允许估计与细胞内钙变化相关的所有参数，例如基础钙水平和钙瞬变。由于钙从细胞外部流入神经末梢及其与钙敏感染料的结合/解除结合发生在几毫秒的范围内，因此需要一个快速的成像系统来记录这些事件。事实上，高速相机通常用于记录快速钙变化，但它们的图像分辨率参数较低。这里介绍的用于记录钙瞬态的方案允许共聚焦显微镜提供极好的时空分辨率。

根据所提出的技术用染料加载制剂后，位于神经残端附近的大多数突触具有足够的荧光水平（见 图2）。用染料加载制剂并应用所述配准和图像处理方法后，获得具有所需空间和时间分辨率的钙瞬变（见 图4）。钙瞬时已通过所提出的方法回收（见 图3）。
还分析了恢复信号的幅度和时间参数。平均数据如 <str...

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Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

该方案描述了通过切割神经将荧光钙染料加载到小鼠运动神经末梢的方法。此外，还提出了一种使用共聚焦显微镜记录周围神经末梢快速钙瞬变的独特方法。

使用共聚焦显微镜以高时间分辨率记录小鼠神经肌肉接头中的钙瞬变

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

突触前钙水平的估计是研究突触传递的关键任务。研究钙信号传导对于寻找治疗神经退行性疾病的方法也很重要。所提出的上样技术的主要优点是仅对感兴趣的细胞进行染色。我们记录钙不传递的方法提供了非常好的时空分辨率。所提出的配准方法对需要使用共聚焦显微镜记录快速周期性过程的神经生理学家有所帮助。加载技术中最困难的步骤是将神经固定在移液器内。移液器的直径必须完全适合，因此请制作几个。了解协议中的所有步骤都很复杂，演示每个步骤都会有很大帮助。首先用细不锈钢销以略微拉伸的方式将长提肌组织固定在弹性体涂层的培养皿中，并将林格氏溶液添加到培养皿中，直到肌肉完全覆盖。接下来，使用微量移液器拉拔器制备具有细尖尖端的微量移液器，用于细胞内记录。使用没有内部细丝的毛细管。用研磨剂划破锥度后，折断微量移液器吸头，使吸头的直径打开约100微米。然后，用火抛光尖端，直到内径从 80 微米缩小到 12 微米。完成后，将硅胶管连接到一侧，将没有针头的注射器连接到进样移液器的另一侧。在体视显微镜下，找到神经干变成独立神经分支的位置。使用蜡将填充移液器放在培养皿上，然后移动移液器尖端直到它站在神经上方。用细剪刀剪开靠近肌肉纤维的神经，留下一小块神经残端，长约一毫米。然后，用一些林格氏溶液将神经残端吸入填充移液器的尖端，不要挤压神经。完成后，从进样移液器上取下硅胶管。之后，使用带有长丝的注射器抽取染料加载溶液。然后，将装有上样溶液的灯丝尖端插入灌装移液管中，并将混合物释放到神经残端上，然后在室温下在黑暗中孵育神经制剂30分钟。孵育后，用新鲜的林格氏溶液冲洗神经制剂，然后在25摄氏度的玻璃烧杯中用50毫升林格氏溶液处理两小时。对于共聚焦显微镜，将神经制剂安装到硅弹性体涂层的实验室中，并用一组钢微针将其固定，稍微拉伸。然后，用林格氏溶液充分冲洗制剂。在腔室上安装吸电极。将制备室安装到显微镜载物台上后，将入口和出口配件放入室中。打开重力流驱动系统，从制备中去除多余的溶液。完成后，将刺激吸力电极插入电刺激器，并确保刺激后发生肌肉收缩。然后，用含有 10 微摩尔 d-tubocurine 的林格氏溶液填充灌注系统，并打开灌注抽吸泵开始灌注。在激光扫描共聚焦显微镜或LSCM软件中，选择电生理学和采集模式以设置成像参数。在作业菜单设置中，选择触发设置以使用显微镜同步脉冲触发刺激器，并将帧场上的触发设置为OUT 1通道。将扫描模式以 1， 400 赫兹的扫描频率转为 XYT。变焦系数应为 6.1，针孔完全打开。确保顺序、跨通道、双向 X 模式处于打开状态，然后将形成帧的最短时间设置为 52 毫秒，并在 20 帧处收集原始视频中的帧。将氩激光的激发波长设置为488纳米，输出功率为8%。设置参数后，按实时模式按钮可实时预览装有染料的神经末梢。在实时模式下，搜索感兴趣区域或ROI以获得最佳焦点。然后，将刺激器上的延迟相对于前一个值少移动两毫秒，并运行数据采集软件，通过将每个序列从前一个序列偏移两毫秒来获取 26 个序列。要处理捕获的视频，请运行 Leica 应用程序套件 X 或 LAS X 软件，然后打开创建的项目。然后，单击导出并另存为以将帧以TIF格式保存在目标文件夹中。接下来，运行 ImageJ 软件并单击文件、导入和图像序列。在打开的图像序列窗口中，选择目标文件夹并打开第一帧。从序列选项中，转到起始图像字段并将第一帧的帧编号设置为 1。然后，在增量字段中，将值设置为等于初始信号记录中的帧数，然后单击确定。要将拼接的第一帧的生成文件保存在单独的文件夹中，请依次单击文件、保存和文件夹选项卡。通过在起始图像字段中设置相应的帧编号，对 19 帧重复这些步骤。获取所有图像后，单击文件、导入和图像序列以在起始图像和增量字段中选择一个。可以看到最终的视频，所有帧以更高的时间分辨率拼接在一起。然后，将视频文件保存为 TIF 格式。要分析拼接的视频，请单击图像、堆栈、工具和堆栈排序器。然后，转到分析、工具和投资回报率管理器。将之前保存的 TIF 文件拖放到 ImageJ 窗口中，然后展开图像以获得更好的视图。要改善图像可视化，请单击图像，进行调整，将亮度对比度转换为自动。通过绘制ROI并为ROI管理器增加价值，将背景设置在靠近神经末梢的位置。然后，通过单击更多和多度量来计算背景。复制平均值以粘贴到电子表格程序中。然后，计算平均值。接下来，通过单击过程、主和减法从堆栈中减去计算的平均值。输入获得的值，并通过多边形线在神经末梢周围绘制ROI，然后将其添加到ROI管理器。通过单击更多和多测量选项卡来测量神经末梢的瞬态强度。然后，复制平均强度值并将其粘贴到电子表格程序中以计算信号的平均偏移量。将信号值除以平均偏移值。从获得的值中，减去 1，然后乘以 100%，然后绘制钙瞬态图以确定振幅。用染料加载神经制剂后，大部分突触位于神经残端附近，表明有足够的荧光水平。经过图像处理后，获得了具有所需空间和时间分辨率的钙瞬变。该方案中最重要的步骤之一是，必须在切割神经后的最初几分钟内将神经残端置于含有染料的溶液中。该方法可用于将各种染料和药物加载到运动神经元中。注册方案可用于评估中枢神经系统制剂中树突和棘中的钙。我们的技术允许以良好的空间和时间分辨率记录钙信号。研究钙瞬变是研究神经递质释放和突触可塑性调节的有力工具。

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