Name: registration of calcium transients in mouse neuromuscular junction with high temporal resolution using confocal microscopy
Uploaded: 2021-12-01T14:00:00
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Les études de fluorescence de ces travaux ont été réalisées avec le soutien financier de la subvention de la Fondation scientifique russe (projet n ° 19-15-00329). La méthode a été développée grâce au financement de la mission gouvernementale pour le FRC Kazan Scientific Center de RAS АААА-А18-118022790083-9. La recherche a été développée avec l’utilisation de l’équipement du Centre fédéral de recherche « Kazan Scientific Center of RAS ». Les auteurs tiennent à remercier le Dr Victor I. Ilyin pour la lecture critique de ce manuscrit.

Des expériences ont été réalisées sur des préparations isolées de muscles nerveux de releveur auris longus (m. LAL) provenant de souris BALB/C (20-23 g, 2-3 mois)41. Les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux directives pour l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université fédérale de Kazan et de l’Université médicale de Kazan, conformément au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le protocole exp?...

La méthode de chargement d’un colorant sensible au Ca2+ dans les terminaisons nerveuses de souris à travers le moignon nerveux et d’enregistrement d’un transitoire calcique rapide à l’aide d’un microscope confocal est présentée dans cet article. À la suite de la mise en œuvre de cette méthode de charge, la plupart des synapses situées près du moignon nerveux avaient un niveau de fluorescence suffisant pour permettre l’enregistrement de l’entrée du calcium dans les terminaisons nerveuse...

Le problème de la mesure des ondes de calcium rapides dans les cellules excitables est l’un des aspects les plus importants et les plus difficiles de l’étude de la transmission du signal dans les systèmes nerveux central et périphérique. Les ions calcium jouent un rôle important dans le déclenchement de la libération de neurotransmetteurs, la plasticité synaptique et la modulation de l’activité de diverses protéines intracellulaires 1,2,3,4,5. L’étude de la signalisation du calcium est également importante pour trouver des moyens de traiter les maladies neurodégénératives6. Pour mesurer les changements dans les niveaux de calcium, des colorants fluorescents sensibles au calcium sont couramment utilisés, et les changements dans leur niveau de fluorescence sont analysés 7,8,9.
Le chargement des colorants calciques dans les cellules peut être réalisé de différentes manières. Principalement, les colorants perméables aux cellules sont utilisés10,11. Cependant, dans un tel cas, il est non seulement difficile de contrôler la concentration d’un colorant à l’intérieur de la cellule, mais il est également difficile de sélectionner les cellules cibles pour le chargement. Cette méthode n’est pas applicable à l’étude des terminaisons nerveuses périphériques puisque le colorant pénètre dans les cellules postsynaptiques. Au lieu de cela, les colorants imperméables cellulaires conviennent mieux à de telles préparations. Dans ce cas, les colorants sont délivrés aux cellules par micro-injection ou par une pipette patch12,13,14. Il existe également une méthode de chargement à travers un moignon nerveux. Cette dernière méthode est la plus appropriée pour les préparations de jonction neuromusculaire 15,16,17,18,19,20. Il permet d’effectuer des colorations uniquement pour les cellules d’intérêt. Bien que cette méthode ne fournisse pas une évaluation précise de la concentration du colorant dans la cellule cible, la concentration peut être estimée approximativement en comparant le niveau de fluorescence des cellules au repos dans des solutions avec une concentration connue de calcium21. Dans cette étude, une modification de cette méthode appliquée aux synapses des mammifères est présentée.
L’entrée du calcium pendant la phase dépolarisante du potentiel d’action est un processus rapide, en particulier dans la jonction neuromusculaire; Par conséquent, pour son enregistrement, un équipement approprié est nécessaire1. Une étude récente utilisant un colorant fluorescent sensible à la tension a démontré que la durée du potentiel d’action dans la synapse périphérique d’une souris est d’environ 300 μs22. Le calcium transitoire, évalué à l’aide de colorants sensibles au calcium dans les synapses périphériques de la grenouille, a une durée plus longue: le temps de montée est d’environ 2-6 ms et le temps de désintégration est d’environ 30-90 ms, selon le colorant calcique utilisé23,24. Pour mesurer des processus rapides à l’aide de colorants fluorescents, des caméras CCD ou CMOS sont généralement utilisées, avec des matrices CCD rapides et sensibles. Cependant, ces caméras présentent l’inconvénient d’une faible résolution, limitée par la taille des éléments sensibles de la matrice25,26,27,28. Les caméras les plus rapides avec une sensibilité suffisante pour enregistrer à la fois les potentiels d’action et les transitoires de calcium en réponse à la stimulation à basse fréquence des cellules ont une fréquence de balayage de 2 000 Hz et une matrice d’une dimension de 80 x 8029. Pour obtenir des signaux avec une résolution spatiale plus élevée, la microscopie confocale est utilisée, surtout s’il est nécessaire d’évaluer certains changements volumétriques dans le signal30,31,32. Mais il faut garder à l’esprit que la microscopie confocale a une vitesse de balayage élevée en mode balayage linéaire, mais il existe encore des limitations importantes à la vitesse d’enregistrement des processus rapides lors de la construction d’une image spatiale33. Il existe des microscopes confocaux basés sur des disques de Nipkow rotatifs (microscopie à balayage à fente) et des scanners multipoints, qui ont une vitesse de balayage plus élevée. En même temps, ils sont inférieurs aux microscopes confocaux classiques dans le filtrage d’images confocales (diaphonie de trous d’épingle pour les microscopes avec un disque de Nipkow)32,34,35. L’imagerie confocale avec balayage par résonance peut également fournir une résolution spatio-temporelle élevée requise pour des mesures temporelles élevées36. Toutefois, il faut tenir compte du fait que l’enregistrement de faibles réponses fluorescentes à une vitesse de balayage élevée lors de l’utilisation de scanners à résonance nécessite des détecteurs très sensibles tels que les détecteurs hybrides36.
Cet article présente une méthode permettant d’augmenter la résolution temporelle des signaux enregistrés avec la microscopie confocale à balayage laser (LSCM) tout en maintenant la résolution spatiale37. La méthode actuelle est un développement ultérieur des méthodes décrites précédemment et transférées à la plate-forme LSCM38,39,40. Cette approche ne nécessite pas de modifications du matériel du microscope et est basée sur l’application d’un algorithme pour enregistrer des signaux fluorescents évoqués périodiquement avec un décalage temporel par rapport au moment de la stimulation.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Clark Electromedical instruments, UK</td>
			<td>GC150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP</td>
			<td>Leica Microsystems , Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller P 97</td>
			<td>Sutter Instrument, USA</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow regulator</td>
			<td>KD Medical GmbH Hospital Products, Germany</td>
			<td>KD REG</td>
			<td>Disposable infusion set with Flow regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H0887</td>
			<td>100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system Leica CLS 150X</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Las AF software</td>
			<td>Leica Microsystems, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Las X software</td>
			<td>Leica Microsystems, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Holder with Suction Tubing</td>
			<td>BIOSCIENCE TOOLS, USA</td>
			<td>MTH-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspin FV 2400</td>
			<td>Biosan, Latvia</td>
			<td>BS-010201-AAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine science tools, Canada</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-spin MSC 3000</td>
			<td>Biosan, Latvia</td>
			<td>BS-010205-AAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>O6806</td>
			<td>500 &#956;g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Biohit, Russia</td>
			<td>720210</td>
			<td>0.5-10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip</td>
			<td>Biohit, Russia</td>
			<td>781349</td>
			<td>10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine</td>
			<td>local producer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use hypodermic needles</td>
			<td>Bbraun</td>
			<td>100 Sterican</td>
			<td>0.4&#215;40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft, USA</td>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems , Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction electrode</td>
			<td>Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal.&#160;- 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16.</td>
			<td></td>
			<td>http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer</td>
			<td>Dow Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>local producer</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>local producer</td>
			<td></td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

registration of calcium transients in mouse neuromuscular junction with high temporal resolution using confocal microscopy

L’estimation du taux de calcium présynaptique est une tâche clé dans l’étude de la transmission synaptique, car l’entrée de calcium dans la cellule présynaptique déclenche une cascade d’événements conduisant à la libération de neurotransmetteurs. De plus, les changements dans les niveaux de calcium présynaptique médient l’activité de nombreuses protéines intracellulaires et jouent un rôle important dans la plasticité synaptique. L’étude de la signalisation du calcium est également importante pour trouver des moyens de traiter les maladies neurodégénératives. La jonction neuromusculaire est un modèle approprié pour étudier la plasticité synaptique, car elle n’a qu’un seul type de neurotransmetteur. Cet article décrit la méthode de chargement d’un colorant sensible au calcium à travers le faisceau nerveux coupé dans les terminaisons nerveuses motrices des souris. Cette méthode permet l’estimation de tous les paramètres liés aux changements intracellulaires du calcium, tels que le taux de calcium basal et le calcium transitoire. Étant donné que l’afflux de calcium de l’extérieur de la cellule dans les terminaisons nerveuses et sa liaison / déliaison au colorant sensible au calcium se produisent dans un délai de quelques millisecondes, un système d’imagerie rapide est nécessaire pour enregistrer ces événements. En effet, les caméras à haute vitesse sont couramment utilisées pour l’enregistrement des changements rapides du calcium, mais elles ont des paramètres de faible résolution d’image. Le protocole présenté ici pour l’enregistrement transitoire du calcium permet une très bonne résolution spatio-temporelle fournie par la microscopie confocale.

Après chargement de la préparation avec un colorant selon la technique présentée, la plupart des synapses situées à proximité du moignon nerveux présentaient un niveau de fluorescence suffisant (voir Figure 2). Après chargement de la préparation avec le colorant et application de la méthode décrite d’enregistrement et de traitement de l’image, on a obtenu des transitoires calciques avec la résolution spatiale et temporelle souhaitée (voir figure 4</stro...

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Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Le protocole décrit la méthode de chargement d’un colorant calcique fluorescent à travers le nerf coupé dans les terminaisons nerveuses motrices de souris. En outre, une méthode unique d’enregistrement rapide des transitoires de calcium dans les terminaisons nerveuses périphériques à l’aide de la microscopie confocale est présentée.

Enregistrement des transitoires calciques dans la jonction neuromusculaire de souris à haute résolution temporelle par microscopie confocale

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

L’estimation d’un taux de calcium présynaptique est une tâche clé dans l’étude de la transmission synaptique. L’étude de la signalisation du calcium est également importante pour trouver des moyens de traiter les maladies neurodégénératives. Le principal avantage de la technique de chargement présentée est que la coloration n’a été effectuée que pour les cellules d’intérêt.Notre méthode d’enregistrement de l’intransigeance calcique offre une très bonne résolution spatio-temporelle. La méthode d’enregistrement présentée peut être utile aux neurophysiologistes qui ont besoin d’enregistrer des processus périodiques rapides à l’aide d’un microscope confocal. L’étape la plus difficile de la technique de chargement consiste à maintenir le nerf à l’intérieur de la pipette.Le diamètre de la pipette doit être parfaitement ajusté, alors faites-en plusieurs. Savoir que toutes les étapes du protocole sont compliquées et démontrer chacune d’entre elles aidera beaucoup. Commencez par fixer le tissu musculaire releveur auris longus de manière légèrement étirée dans la boîte de Petri recouverte d’élastomère avec les fines broches en acier inoxydable et ajoutez la solution de Ringer à la boîte jusqu’à ce que le muscle soit complètement couvert.Ensuite, utilisez un extracteur de micropipette pour préparer une micropipette avec une pointe fine et tranchante pour les enregistrements intracellulaires. Utilisez des capillaires sans filaments internes. Après avoir entaillé la conicité avec un abrasif, cassez l’embout de la micropipette en laissant une pointe ouverte à environ 100 micromètres de diamètre.Ensuite, polissez la pointe jusqu’à ce que le diamètre intérieur passe de 80 micromètres à 12 micromètres. Lorsque vous avez terminé, fixez un tube en silicone d’un côté et une seringue sans aiguille de l’autre côté de la pipette de remplissage. Sous un stéréomicroscope, trouvez où le tronc nerveux se transforme en branches nerveuses séparées.Placez la pipette de remplissage sur la boîte de Petri à l’aide de cire, puis déplacez l’embout de la pipette jusqu’à ce qu’elle se trouve au-dessus du nerf. Coupez le nerf près de la fibre musculaire avec de fins ciseaux, en laissant un petit morceau du moignon nerveux, d’environ un millimètre de long. Ensuite, aspirez le moignon nerveux avec une solution de Ringer dans l’extrémité de la pipette de remplissage, sans pincer le nerf.Une fois cela fait, retirez le tube en silicone de la pipette de remplissage. Plus tard, utilisez une seringue avec un long filament pour aspirer la solution de chargement du colorant. Ensuite, insérez l’embout du filament avec la solution de chargement dans la pipette de remplissage et relâchez le mélange sur le moignon nerveux, puis incuber la préparation nerveuse à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes.Après l’incubation, rincer la préparation nerveuse avec la solution fraîche de Ringer avant de la traiter avec 50 millilitres de solution de Ringer dans un bécher en verre à 25 degrés Celsius pendant deux heures. Pour la microscopie confocale, montez la préparation nerveuse dans une chambre expérimentale recouverte d’élastomère de silicium et fixez-la, légèrement étirée, avec un ensemble de microaiguilles en acier. Ensuite, rincez abondamment la préparation avec la solution de Ringer.Installez une électrode d’aspiration sur la chambre. Après avoir monté la chambre de préparation sur l’étage du microscope, placez les raccords d’entrée et de sortie dans la chambre. Activez un système entraîné par flux gravitaire pour éliminer l’excès de solution de la préparation.Une fois cela fait, branchez l’électrode d’aspiration stimulante dans un stimulateur électrique et assurez-vous que les contractions musculaires se produisent après les stimuli. Ensuite, remplissez le système de perfusion avec la solution de Ringer contenant 10 micromolaires de d-tubocurarine et allumez la pompe d’aspiration de perfusion pour commencer la perfusion. Dans le microscope confocal à balayage laser, ou le logiciel LSCM, choisissez l’électrophysiologie et le mode d’acquisition pour définir les paramètres d’imagerie.Dans les paramètres du menu de travail, sélectionnez les paramètres de déclenchement pour déclencher le stimulateur avec l’impulsion de synchronisation du microscope et réglez le déclencheur sur le champ d’image sur le canal OUT 1. Réglez le mode de balayage sur XYT à une fréquence de balayage de 1 400 hertz. Le facteur de zoom doit être de 6,1 avec le trou d’épingle complètement ouvert.Assurez-vous que le mode X séquentiel, transcroisé et bidirectionnel est activé, puis définissez la durée minimale pour former une image à 52 millisecondes et collectez des images dans une vidéo brute à 20 images. Réglez la longueur d’onde d’excitation du laser argon à 488 nanomètres avec 8% de puissance de sortie. Lorsque les paramètres sont définis, appuyez sur le bouton du mode live pour obtenir un aperçu en direct des bornes nerveuses chargées avec le colorant.En mode live, recherchez la région d’intérêt, ou ROI, pour obtenir la meilleure mise au point. Ensuite, décalez le retard sur le stimulateur de deux millisecondes de moins par rapport à la valeur précédente et exécutez le logiciel d’acquisition de données pour acquérir 26 séquences en décalant chaque séquence de deux millisecondes par rapport à la précédente. Pour traiter les vidéos capturées, exécutez le logiciel Leica Application Suite X ou LAS X et ouvrez le projet créé.Ensuite, cliquez sur exporter et enregistrer sous pour enregistrer les images au format TIF dans le dossier de destination. Ensuite, exécutez le logiciel ImageJ et cliquez sur fichier, importer et séquence d’images. Dans la fenêtre d’ouverture de la séquence d’images, choisissez le dossier de destination et ouvrez la première image.Dans les options de séquence, accédez au champ de l’image de départ et définissez le numéro d’image sur un pour la première image. Ensuite, dans le champ d’incrémentation, définissez la valeur égale au nombre d’images dans l’enregistrement initial du signal avant de cliquer sur OK. Pour enregistrer le fichier généré des premières images assemblées dans un dossier séparé, cliquez sur les onglets fichier, enregistrer et dossier dans l’ordre.Répétez les procédures pour 19 images en définissant le numéro d’image correspondant dans le champ de l’image de départ. Lorsque toutes les images sont obtenues, cliquez sur fichier, importer et séquence d’images pour en sélectionner une dans les champs image de départ et incrément. La vidéo finale avec toutes les images assemblées à une résolution temporelle accrue peut être vue.Ensuite, enregistrez le fichier vidéo au format TIF. Pour analyser la vidéo assemblée, cliquez sur l’image, les piles, les outils et le trieur de piles. Ensuite, accédez à l’analyse, aux outils et au gestionnaire de retour sur investissement.Faites glisser et déposez le fichier TIF enregistré précédemment dans la fenêtre ImageJ, puis développez l’image pour une meilleure vue. Pour améliorer la visualisation de l’image, cliquez sur l’image, ajustez, pour transformer le contraste de luminosité en automatique. Définissez l’arrière-plan près de la terminaison nerveuse en dessinant un retour sur investissement et en ajoutant de la valeur au gestionnaire de retour sur investissement.Ensuite, calculez l’arrière-plan en cliquant sur plus et multi mesurer. Copiez les valeurs moyennes à coller dans le tableur. Ensuite, calculez la valeur moyenne.Ensuite, soustrayez la valeur moyenne calculée des piles en cliquant sur processus, principal et soustraire. Entrez la valeur obtenue et dessinez le ROI autour d’une borne nerveuse via une ligne polygonale avant de l’ajouter au gestionnaire de ROI. Mesurez l’intensité transitoire de la terminaison nerveuse en cliquant sur les onglets plus et multi-mesures.Ensuite, copiez les valeurs d’intensité moyenne et collez-les dans le tableur pour calculer le décalage moyen des signaux. Divisez les valeurs du signal par la valeur de décalage moyenne. De la valeur obtenue, soustrayez-en un, puis multipliez par 100%, puis tracez un graphique transitoire de calcium pour déterminer l’amplitude.Après avoir chargé la préparation nerveuse avec un colorant, la majeure partie de la synapse est située près du moignon nerveux, indiquant un niveau suffisant de fluorescence. Après le traitement de l’image, le calcium transitoire avec la résolution spatiale et temporelle souhaitée a été obtenu. L’une des étapes les plus importantes de ce protocole est que le moignon nerveux doit être placé dans la solution contenant le colorant dans les premières minutes après la coupe du nerf.Cette méthode peut être utilisée pour charger divers colorants et médicaments dans les motoneurones. Le protocole d’enregistrement peut être utile pour évaluer le calcium dans les dendrites et les épines dans les préparations du SNC. Notre technique permet d’enregistrer un signal de calcium avec une bonne résolution spatiale et temporelle.L’étude de la céphatrience calcique est un outil puissant dans la recherche sur la régulation de la libération d’un neurotransmetteur et de la plasticité synaptique.

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