Name: registration of calcium transients in mouse neuromuscular junction with high temporal resolution using confocal microscopy
Uploaded: 2021-12-01T14:00:00
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Gli studi sulla fluorescenza di questo lavoro sono stati condotti con il sostegno finanziario della Russian Science Foundation Grant (progetto n. 19-15-00329). Il metodo è stato sviluppato sotto finanziamento dell'incarico governativo per FRC Kazan Scientific Center di RAS АААА-А18-118022790083-9. La ricerca è stata sviluppata con l'uso delle attrezzature del Centro di ricerca federale "Kazan Scientific Center of RAS". Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Victor I. Ilyin per la lettura critica di questo manoscritto.

Sono stati condotti esperimenti su preparati nervo-muscolari isolati di levator auris longus (m. LAL) dai topi BALB/C (20-23 g, 2-3 mesi di età)41. Le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con le linee guida per l'uso di animali da laboratorio dell'Università Federale di Kazan e dell'Università di Medicina di Kazan, in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il protocollo sperimentale ha soddisfatto i requisiti della direttiva ...

Il metodo per caricare il colorante sensibile al Ca2+ nelle terminazioni nervose del topo attraverso il moncone nervoso e per registrare un transitorio di calcio veloce utilizzando un microscopio confocale è presentato in questo articolo. Come risultato dell'implementazione di questo metodo di carico, la maggior parte delle sinapsi situate vicino al moncone nervoso aveva un livello sufficiente di fluorescenza per consentire la registrazione dell'ingresso di calcio nelle terminazioni nervose in risposta alla s...

Il problema di misurare le onde veloci di calcio nelle cellule eccitabili è uno degli aspetti più importanti e impegnativi dello studio della trasmissione del segnale nel sistema nervoso centrale e periferico. Gli ioni calcio svolgono un ruolo importante nell'innescare il rilascio di neurotrasmettitori, la plasticità sinaptica e la modulazione dell'attività di varie proteine intracellulari 1,2,3,4,5. Studiare la segnalazione del calcio è anche importante per trovare modi per trattare le malattie neurodegenerative6. Per misurare i cambiamenti nei livelli di calcio, i coloranti fluorescenti sensibili al calcio sono comunemente usati e i cambiamenti nel loro livello di fluorescenza sono analizzati 7,8,9.
Il caricamento di coloranti di calcio nelle cellule può essere ottenuto in diversi modi. Principalmente, i coloranti cellula-permeant sono usati10,11. Tuttavia, in tal caso, non è solo difficile controllare la concentrazione di un colorante all'interno della cellula, ma è anche difficile selezionare le cellule bersaglio per il caricamento. Questo metodo non è applicabile per lo studio delle terminazioni nervose periferiche poiché il colorante entra nelle cellule postsinaptiche. Invece, i coloranti impermeant cellulari sono più adatti per tali preparazioni. In questo caso, i coloranti vengono consegnati alle cellule mediante microiniezione o attraverso una pipetta patch12,13,14. C'è anche un metodo di caricamento attraverso un moncone nervoso. Quest'ultimo metodo è più adatto per le preparazioni della giunzione neuromuscolare 15,16,17,18,19,20. Permette di eseguire la colorazione solo per le cellule di interesse. Sebbene questo metodo non fornisca una valutazione accurata della concentrazione del colorante nella cellula bersaglio, la concentrazione può essere stimata approssimativamente confrontando il livello di fluorescenza delle cellule a riposo in soluzioni con una concentrazione nota di calcio21. In questo studio, viene presentata una modifica di questo metodo applicato alle sinapsi dei mammiferi.
L'ingresso di calcio durante la fase depolarizzante del potenziale d'azione è un processo veloce, specialmente nella giunzione neuromuscolare; Pertanto, per la sua registrazione, è necessaria un'attrezzatura appropriata1. Un recente studio che utilizza un colorante fluorescente sensibile alla tensione ha dimostrato che la durata del potenziale d'azione nella sinapsi periferica di un topo è di circa 300 μs22. Il calcio transitorio, valutato utilizzando coloranti calcio-sensibili nelle sinapsi periferiche della rana, ha una durata maggiore: il tempo di salita è di circa 2-6 ms e il tempo di decadimento è di circa 30-90 ms, a seconda del colorante di calcio utilizzato23,24. Per misurare processi veloci con l'aiuto di coloranti fluorescenti, vengono generalmente utilizzate telecamere CCD o CMOS, con matrici CCD veloci e sensibili. Tuttavia, queste telecamere hanno lo svantaggio della bassa risoluzione, limitata dalla dimensione degli elementi sensibili della matrice25,26,27,28. Le telecamere più veloci con sensibilità sufficiente per registrare sia i potenziali d'azione che i transitori di calcio in risposta alla stimolazione a bassa frequenza delle cellule hanno una frequenza di scansione di 2.000 Hz e una matrice con una dimensione di 80 x 8029. Per ottenere segnali con una risoluzione spaziale più elevata, viene utilizzata la microscopia confocale, soprattutto se è necessario valutare alcune variazioni volumetriche nel segnale30,31,32. Ma va tenuto presente che la microscopia confocale ha un'alta velocità di scansione in modalità di scansione lineare, ma ci sono ancora limitazioni significative sulla velocità delle registrazioni di processi veloci quando si costruisce un'immagine spaziale33. Esistono microscopi confocali basati su dischi Nipkow rotanti (microscopia a scansione a fessura) e scanner multipoint-array, che hanno una maggiore velocità di scansione. Allo stesso tempo, sono inferiori ai microscopi confocali classici nel filtraggio delle immagini confocali (diafonia forica per microscopi con un disco di Nipkow)32,34,35. L'imaging confocale con scansione a risonanza può anche fornire un'elevata risoluzione spazio-temporale richiesta per misurazioni temporali elevate36. Tuttavia, tenere conto del fatto che la registrazione di risposte fluorescenti deboli ad alta velocità di scansione quando si utilizzano scanner a risonanza richiede rivelatori altamente sensibili come i rilevatori ibridi36.
Questo articolo presenta un metodo per aumentare la risoluzione temporale dei segnali registrati con la microscopia confocale a scansione laser (LSCM) mantenendo la risoluzione spaziale37. Il metodo attuale è un ulteriore sviluppo dei metodi descritti in precedenza e trasferiti alla piattaforma LSCM38,39,40. Questo approccio non richiede modifiche nell'hardware del microscopio e si basa sull'applicazione di un algoritmo per la registrazione di segnali fluorescenti periodicamente evocati con uno spostamento temporale rispetto al momento della stimolazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Clark Electromedical instruments, UK</td>
			<td>GC150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP</td>
			<td>Leica Microsystems , Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller P 97</td>
			<td>Sutter Instrument, USA</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow regulator</td>
			<td>KD Medical GmbH Hospital Products, Germany</td>
			<td>KD REG</td>
			<td>Disposable infusion set with Flow regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H0887</td>
			<td>100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system Leica CLS 150X</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Las AF software</td>
			<td>Leica Microsystems, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Las X software</td>
			<td>Leica Microsystems, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Holder with Suction Tubing</td>
			<td>BIOSCIENCE TOOLS, USA</td>
			<td>MTH-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspin FV 2400</td>
			<td>Biosan, Latvia</td>
			<td>BS-010201-AAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine science tools, Canada</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-spin MSC 3000</td>
			<td>Biosan, Latvia</td>
			<td>BS-010205-AAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>O6806</td>
			<td>500 &#956;g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Biohit, Russia</td>
			<td>720210</td>
			<td>0.5-10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip</td>
			<td>Biohit, Russia</td>
			<td>781349</td>
			<td>10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine</td>
			<td>local producer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use hypodermic needles</td>
			<td>Bbraun</td>
			<td>100 Sterican</td>
			<td>0.4&#215;40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft, USA</td>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems , Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction electrode</td>
			<td>Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal.&#160;- 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16.</td>
			<td></td>
			<td>http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer</td>
			<td>Dow Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>local producer</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>local producer</td>
			<td></td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

registration of calcium transients in mouse neuromuscular junction with high temporal resolution using confocal microscopy

La stima del livello di calcio presinaptico è un compito chiave nello studio della trasmissione sinaptica poiché l'ingresso del calcio nella cellula presinaptica innesca una cascata di eventi che portano al rilascio di neurotrasmettitori. Inoltre, i cambiamenti nei livelli di calcio presinaptico mediano l'attività di molte proteine intracellulari e svolgono un ruolo importante nella plasticità sinaptica. Studiare la segnalazione del calcio è anche importante per trovare modi per trattare le malattie neurodegenerative. La giunzione neuromuscolare è un modello adatto per studiare la plasticità sinaptica, in quanto ha un solo tipo di neurotrasmettitore. Questo articolo descrive il metodo per caricare un colorante sensibile al calcio attraverso il fascio nervoso tagliato nelle terminazioni nervose motorie dei topi. Questo metodo consente la stima di tutti i parametri relativi alle variazioni intracellulari del calcio, come il livello basale di calcio e il calcio transitorio. Poiché l'afflusso di calcio dall'esterno cellulare nelle terminazioni nervose e il suo legame / slegamento al colorante sensibile al calcio avvengono nell'intervallo di pochi millisecondi, è necessario un sistema di imaging veloce per registrare questi eventi. In effetti, le telecamere ad alta velocità sono comunemente utilizzate per la registrazione di cambiamenti rapidi del calcio, ma hanno bassi parametri di risoluzione dell'immagine. Il protocollo qui presentato per la registrazione dei transitori di calcio consente una risoluzione spazio-temporale estremamente buona fornita dalla microscopia confocale.

Dopo aver caricato la preparazione con colorante secondo la tecnica presentata, la maggior parte delle sinapsi situate vicino al moncone nervoso aveva un livello sufficiente di fluorescenza (vedi Figura 2). Dopo aver caricato la preparazione con il colorante eapplicando il metodo descritto di registrazione e di elaborazione delle immagini, sono stati ottenuti transitori di calcio con la risoluzione spaziale e temporale desiderata (vedi Figura 4). Il calcio trans...

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Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Il protocollo descrive il metodo di caricamento di un colorante di calcio fluorescente attraverso il nervo tagliato nei terminali nervosi motori del topo. Inoltre, viene presentato un metodo unico per registrare i transitori di calcio veloci nelle terminazioni nervose periferiche utilizzando la microscopia confocale.

Registrazione di transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare di topo ad alta risoluzione temporale mediante microscopia confocale

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

La stima di un livello di calcio presinaptico è un compito chiave nello studio della trasmissione sinaptica. Studiare la segnalazione del calcio è anche importante per trovare modi per trattare le malattie neurodegenerative. Il principale vantaggio della tecnica di caricamento presentata è che la colorazione è stata eseguita solo per le celle di interesse.Il nostro metodo per registrare l'intransienza del calcio fornisce un'ottima risoluzione spazio-temporale. Il metodo di registrazione presentato può essere utile ai neurofisiologi che hanno bisogno di registrare processi periodici veloci utilizzando un microscopio confocale. Il passo più difficile nella tecnica di caricamento è tenere il nervo all'interno della pipetta.Il diametro della pipetta deve essere perfettamente adatto, quindi fatene diversi. Conoscere tutti i passaggi del protocollo sono complicati e dimostrare ciascuno di essi aiuterà molto. Iniziare fissando il tessuto muscolare dell'elevatore auris longus in modo leggermente allungato nella piastra di Petri rivestita di elastomero con i perni in acciaio inossidabile fine e aggiungere la soluzione di Ringer al piatto fino a quando il muscolo è completamente coperto.Quindi, utilizzare un estrattore di micropipette per preparare una micropipetta con una punta affilata fine per le registrazioni intracellulari. Utilizzare capillari senza filamenti interni. Dopo aver inciso la conicità con un abrasivo, rompere la punta della micropipetta, lasciando una punta aperta a circa 100 micrometri di diametro.Quindi, lucidare a fuoco la punta fino a quando il diametro interno si restringe da 80 micrometri a 12 micrometri. Al termine, collegare un tubo di silicone su un lato e una siringa senza ago sull'altro lato della pipetta di riempimento. Sotto un microscopio stereo, trova dove il tronco nervoso si trasforma in rami nervosi separati.Posizionare la pipetta di riempimento sulla piastra di Petri con la cera, quindi spostare la punta della pipetta fino a quando non si trova sopra il nervo. Tagliare il nervo vicino alla fibra muscolare con forbici sottili, lasciando un piccolo pezzo del moncone nervoso, lungo circa un millimetro. Quindi, aspirare il moncone nervoso con una soluzione di Ringer nella punta della pipetta di riempimento, senza pizzicare il nervo.Una volta fatto, rimuovere il tubo di silicone dalla pipetta di riempimento. Successivamente, utilizzare una siringa con un lungo filamento per disegnare la soluzione di caricamento del colorante. Quindi, inserire la punta del filamento con la soluzione di carico nella pipetta di riempimento e rilasciare la miscela sul moncone nervoso, quindi incubare la preparazione del nervo a temperatura ambiente al buio per 30 minuti.Dopo l'incubazione, sciacquare la preparazione nervosa con la soluzione fresca di Ringer prima di trattarla con 50 millilitri di soluzione di Ringer in un becher di vetro a 25 gradi Celsius per due ore. Per la microscopia confocale, montare la preparazione del nervo in una camera sperimentale rivestita di elastomero di silicio e fissarla, leggermente allungata, con una serie di microaghi in acciaio. Quindi, sciacquare abbondantemente la preparazione con la soluzione di Ringer.Installare un elettrodo di aspirazione sulla camera. Dopo aver montato la camera di preparazione sul palco del microscopio, posizionare i raccordi di ingresso e uscita nella camera. Accendere un sistema azionato dal flusso a gravità per rimuovere la soluzione in eccesso dalla preparazione.Una volta fatto, collegare l'elettrodo di aspirazione stimolante in uno stimolatore elettrico e assicurarsi che le contrazioni muscolari si verifichino dopo gli stimoli. Quindi, riempire il sistema di perfusione con la soluzione di Ringer contenente 10 micromolari d-tubocurarina e accendere la pompa di aspirazione della perfusione per avviare la perfusione. Nel microscopio confocale a scansione laser o nel software LSCM, scegliere l'elettrofisiologia e la modalità di acquisizione per impostare i parametri di imaging.Nelle impostazioni del menu di lavoro, selezionare le impostazioni di trigger per attivare lo stimolatore con l'impulso di sincronizzazione del microscopio e impostare il trigger sul campo frame sul canale OUT 1. Ruotare la modalità di scansione su XYT con una frequenza di scansione di 1.400 hertz. Il fattore di zoom dovrebbe essere 6,1 con il foro stenopeico completamente aperto.Assicurati che la modalità X sequenziale, traspassante e bidirezionale sia attivata, quindi imposta il tempo minimo per formare un fotogramma a 52 millisecondi e raccogli i fotogrammi in un video raw a 20 fotogrammi. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione del laser argon a 488 nanometri con l'8% della potenza di uscita. Quando i parametri sono impostati, premere il pulsante della modalità live per ottenere un'anteprima dal vivo delle terminazioni nervose caricate con il colorante.In modalità live, cerca la regione di interesse, o ROI, per ottenere lo stato attivo migliore. Quindi, spostare il ritardo sullo stimolatore di due millisecondi in meno rispetto al valore precedente ed eseguire il software di acquisizione dati per acquisire 26 sequenze spostando ogni sequenza di due millisecondi dalla precedente. Per elaborare i video acquisiti, eseguite il software Leica Application Suite X o LAS X e aprite il progetto creato.Quindi, fai clic su esporta e salva con nome per salvare i fotogrammi in formato TIF nella cartella di destinazione. Quindi, eseguire il software ImageJ e fare clic su file, importazione e sequenza di immagini. Nella finestra Apri sequenza di immagini, scegliete la cartella di destinazione e aprite il primo fotogramma.Dalle opzioni della sequenza, vai al campo dell'immagine iniziale e imposta il numero di fotogramma su uno per il primo fotogramma. Quindi, nel campo incremento, impostare il valore uguale al numero di fotogrammi nella registrazione iniziale del segnale prima di fare clic su OK. Per salvare il file generato dei primi fotogrammi cuciti in una cartella separata, fare clic sulle schede file, salva e cartella nell'ordine indicato.Ripetete le procedure per 19 fotogrammi impostando il numero di fotogramma corrispondente nel campo dell'immagine iniziale. Quando tutte le immagini sono ottenute, fare clic su file, importa e sequenza di immagini per selezionarne una nei campi immagine iniziale e incremento. Il video finale con tutti i fotogrammi uniti insieme a una maggiore risoluzione temporale può essere visto.Quindi, salvare il file video in formato TIF. Per analizzare il video cucito, fai clic su immagine, pile, strumenti e ordinatore di pile. Quindi, vai a Analisi, strumenti e ROI Manager.Trascinare e rilasciare il file TIF salvato in precedenza nella finestra ImageJ e quindi espandere l'immagine per una visualizzazione migliore. Per migliorare la visualizzazione dell'immagine, fare clic sull'immagine, regolare, per trasformare il contrasto di luminosità in automatico. Imposta lo sfondo vicino al terminale nervoso disegnando il ROI e aggiungendo valore al gestore del ROI.Quindi, calcola lo sfondo facendo clic su più e multi misura. Copiare i valori medi da incollare nel programma del foglio di calcolo. Quindi, calcola il valore medio.Quindi, sottrarre il valore medio calcolato dagli stack facendo clic su processo, principale e sottrai. Inserisci il valore ottenuto e disegna il ROI attorno a un terminale nervoso tramite una linea poligonale prima di aggiungerlo al gestore del ROI. Misurare l'intensità transitoria del terminale nervoso facendo clic su più schede e multi misura.Quindi, copiare i valori di intensità media e incollarli nel programma del foglio di calcolo per calcolare l'offset medio dei segnali. Dividere i valori del segnale per il valore di offset medio. Dal valore ottenuto, sottrarne uno e quindi moltiplicare per 100% seguito dal grafico transiente del calcio per determinare l'ampiezza.Dopo aver caricato la preparazione del nervo con un colorante, la maggior parte della sinapsi si trova vicino al moncone nervoso, indicato un livello sufficiente di fluorescenza. Dopo l'elaborazione delle immagini, è stata ottenuta la transitorietà del calcio con la risoluzione spaziale e temporale desiderata. Uno dei passaggi più importanti in questo protocollo è che il moncone nervoso deve essere inserito nella soluzione contenente colorante nei primi minuti dopo aver tagliato il nervo.Questo metodo può essere utilizzato per caricare vari coloranti e farmaci nei motoneuroni. Il protocollo di registrazione può essere utile per valutare il calcio nei dendriti e nelle spine nei preparati del SNC. La nostra tecnica permette di registrare un segnale calcico con una buona risoluzione spaziale e temporale.Lo studio della transitorietà del calcio è un potente strumento nella ricerca sulla regolazione del rilascio di un neurotrasmettitore e della plasticità sinaptica.

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