Name: registration of calcium transients in mouse neuromuscular junction with high temporal resolution using confocal microscopy
Uploaded: 2021-12-01T14:00:00
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Os estudos de fluorescência deste trabalho foram realizados com o apoio financeiro do Subsídio da Fundação De ciência russa (projeto nº 19-15-00329). O método foi desenvolvido sob financiamento da atribuição governamental para o FRC Kazan Scientific Center of RAS ААААА-А18-118022790083-9. A pesquisa foi desenvolvida com o uso dos equipamentos do Centro Federal de Pesquisa "Centro Científico Kazan do RAS". Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Victor I. Ilyin pela leitura crítica deste manuscrito.

Os experimentos foram realizados em preparações nervosas-musculares isoladas do levator auris longus (m. LAL) dos Ratos BALB/C (20-23 g, 2-3 meses)41. Os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes para o uso de animais de laboratório da Universidade Federal de Kazan e da Universidade Médica de Kazan, em conformidade com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O protocolo experimental atendeu aos requisitos da Diretiva 86/609/CEE do ...

O método de carregamento de corante ca2+sensível em terminações nervosas do rato através do toco nervoso e para registro de um transitório rápido de cálcio usando um microscópio confocal é apresentado neste artigo. Como resultado da implementação deste método de carregamento, a maioria das sinapses localizadas perto do toco nervoso tinha um nível suficiente de fluorescência para permitir o registro da entrada de cálcio nas terminações nervosas em resposta à estimulação de baixa frequência...

O problema da medição de ondas rápidas de cálcio em células excitáveis é um dos aspectos mais importantes e desafiadores do estudo da transmissão de sinais nos sistemas nervosos central e periférico. Os íons de cálcio desempenham um papel importante no desencadeamento da liberação de neurotransmissores, plasticidade sináptica e modulação da atividade de várias proteínas intracelulares 1,2,3,4,5. Estudar a sinalização de cálcio também é importante para encontrar maneiras de tratar doenças neurodegenerativas6. Para medir as alterações nos níveis de cálcio, corantes fluorescentes sensíveis ao cálcio são comumente usados, e alterações no nível de fluorescência são analisadas 7,8,9.
O carregamento de corantes de cálcio nas células pode ser alcançado de diferentes maneiras. Predominantemente, são utilizados corantes permeantes de células10,11. No entanto, nesse caso, não é apenas difícil controlar a concentração de um corante dentro da célula, mas também é difícil selecionar células-alvo para carregamento. Este método não é aplicável para estudar terminações nervosas periféricas, uma vez que o corante entra em células postinásticas. Em vez disso, corantes impermecedulares celulares são mais adequados para tais preparações. Neste caso, os corantes são entregues às células por microinjeção ou através de uma pipeta de remendo 12,13,14. Há também um método de carregar através de um toco nervoso. Este último método é mais adequado para preparações de junção neuromuscular 15,16,17,18,19,20. Permite realizar a coloração apenas para células de interesse. Embora este método não forneça uma avaliação precisa da concentração do corante na célula-alvo, a concentração pode ser estimada aproximadamente comparando o nível de fluorescência das células em repouso em soluções com uma concentração conhecida de cálcio21. Neste estudo, é apresentada uma modificação desse método aplicado às sinapses dos mamíferos.
A entrada de cálcio durante a fase de despolarização do potencial de ação é um processo rápido, especialmente na junção neuromuscular; portanto, para seu registro, é necessário equipamento adequado1. Um estudo recente usando um corante fluorescente sensível à tensão demonstrou que a duração do potencial de ação na sinapse periférica de um rato é de aproximadamente 300 μs22. O cálcio transitório, avaliado com corantes sensíveis ao cálcio nas sinapses periféricas do sapo, tem uma duração maior: o tempo de elevação é de cerca de 2-6 ms e o tempo de decomposição é de cerca de 30-90 ms, dependendo do corante de cálcio usado23,24. Para medir processos rápidos com a ajuda de corantes fluorescentes, as câmeras CCD ou CMOS são geralmente utilizadas, com matrizes CCD rápidas e sensíveis. No entanto, essas câmeras têm a desvantagem da baixa resolução, limitada pelo tamanho dos elementos sensíveis da matriz 25,26,27,28. As câmeras mais rápidas com sensibilidade suficiente para registrar tanto potenciais de ação quanto transitórios de cálcio em resposta à estimulação de baixa frequência das células têm uma frequência de varredura de 2.000 Hz, e uma matriz com uma dimensão de 80 x 8029. Para obter sinais com maior resolução espacial, é utilizada microscopia confocal, especialmente se for necessário avaliar algumas alterações volumosas no sinal 30,31,32. Mas deve-se ter em mente que a microscopia confocal tem uma alta velocidade de digitalização no modo de varredura de linha, mas ainda há limitações significativas na velocidade de gravações de processos rápidos ao construir uma imagem espacial33. Existem microscópios confocal baseados em discos Nipkow rotativos (microscopia de varredura de fenda) e scanners multipoint-array, que têm uma velocidade de varredura mais alta. Ao mesmo tempo, eles são inferiores aos microscópios confocal clássicos na filtragem de imagem confocal (pinholes crosstalk para microscópios com um disco Nipkow)32,34,35. A imagem confocal com ressonância também pode fornecer uma alta resolução espátula-temporal necessária para altas medições temporais36. No entanto, leve-se em conta que o registro de respostas fluorescentes fracas a uma alta velocidade de varredura ao usar scanners de ressonância requer detectores altamente sensíveis, como detectores híbridos36.
Este artigo apresenta um método para aumentar a resolução temporal dos sinais registrados com a Microscopia Confocal de Varredura a Laser (LSCM) mantendo a resolução espacial37. O método atual é um desenvolvimento adicional dos métodos descritos anteriormente e transferidos para a plataforma LSCM 38,39,40. Esta abordagem não requer alterações no hardware do microscópio e é baseada na aplicação de um algoritmo para gravação periodicamente de sinais fluorescentes evocados com uma mudança de tempo em relação ao momento de estimulação.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Clark Electromedical instruments, UK</td>
			<td>GC150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP</td>
			<td>Leica Microsystems , Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller P 97</td>
			<td>Sutter Instrument, USA</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow regulator</td>
			<td>KD Medical GmbH Hospital Products, Germany</td>
			<td>KD REG</td>
			<td>Disposable infusion set with Flow regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H0887</td>
			<td>100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system Leica CLS 150X</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Las AF software</td>
			<td>Leica Microsystems, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Las X software</td>
			<td>Leica Microsystems, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Holder with Suction Tubing</td>
			<td>BIOSCIENCE TOOLS, USA</td>
			<td>MTH-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspin FV 2400</td>
			<td>Biosan, Latvia</td>
			<td>BS-010201-AAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine science tools, Canada</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-spin MSC 3000</td>
			<td>Biosan, Latvia</td>
			<td>BS-010205-AAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>O6806</td>
			<td>500 &#956;g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Biohit, Russia</td>
			<td>720210</td>
			<td>0.5-10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip</td>
			<td>Biohit, Russia</td>
			<td>781349</td>
			<td>10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine</td>
			<td>local producer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use hypodermic needles</td>
			<td>Bbraun</td>
			<td>100 Sterican</td>
			<td>0.4&#215;40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft, USA</td>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems , Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction electrode</td>
			<td>Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal.&#160;- 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16.</td>
			<td></td>
			<td>http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer</td>
			<td>Dow Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>local producer</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>local producer</td>
			<td></td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

registration of calcium transients in mouse neuromuscular junction with high temporal resolution using confocal microscopy

A estimativa do nível de cálcio pré-sináptico é uma tarefa fundamental no estudo da transmissão sináptica, uma vez que a entrada de cálcio na célula presináptica desencadeia uma cascata de eventos que levam à liberação de neurotransmissores. Além disso, mudanças nos níveis de cálcio pré-sináptico mediam a atividade de muitas proteínas intracelulares e desempenham um papel importante na plasticidade sináptica. Estudar a sinalização de cálcio também é importante para encontrar maneiras de tratar doenças neurodegenerativas. A junção neuromuscular é um modelo adequado para estudar a plasticidade sináptica, pois possui apenas um tipo de neurotransmissor. Este artigo descreve o método para carregar um corante sensível ao cálcio através do feixe de nervo cortado nas terminações nervosas motoras dos camundongos. Este método permite a estimativa de todos os parâmetros relacionados a alterações intracelulares de cálcio, como nível de cálcio basal e transitório de cálcio. Uma vez que o fluxo de cálcio do exterior celular para os terminais nervosos e sua ligação/desvinculação ao corante sensível ao cálcio ocorrem dentro da faixa de alguns milissegundos, um sistema de imagem rápido é necessário para registrar esses eventos. De fato, câmeras de alta velocidade são comumente usadas para o registro de mudanças rápidas de cálcio, mas têm parâmetros de baixa resolução de imagem. O protocolo aqui apresentado para o registro transitório de cálcio permite uma resolução espacial-temporal extremamente boa fornecida pela microscopia confocal.

Após o carregamento da preparação com corante de acordo com a técnica apresentada, a maioria das sinapses localizadas perto do toco nervoso apresentava um nível suficiente de fluorescência (ver Figura 2). Após o carregamento da preparação com o corante e aplicação do método descrito de registro e processamento de imagem, foram obtidos transitórios de cálcio com a resolução espacial e temporal desejada (ver Figura 4). O transitório de cálcio foi...

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Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

O protocolo descreve o método de carregar um corante de cálcio fluorescente através do nervo cortado em terminais nervosos motores do rato. Além disso, é apresentado um método único para o registro de transintes rápidos de cálcio nas terminações nervosas periféricas usando microscopia confocal.

Registro de Transintes de Cálcio na Junção Neuromuscular do Rato com Alta Resolução Temporal utilizando Microscopia Confocal

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

A estimativa de um nível de cálcio pré-sináptico é uma tarefa fundamental no estudo da transmissão sináptica. Estudar a sinalização de cálcio também é importante para encontrar maneiras de tratar doenças neurodegenerativas. A principal vantagem da técnica de carregamento apresentada é que a coloração tem sido realizada apenas para as células de interesse.Nosso método de registro de intransiência de cálcio fornece uma resolução espacial-temporal extremamente boa. O método de registro apresentado pode ser útil para neurofisiologistas que precisam registrar processos periódicos rápidos usando um microscópio confocal. O passo mais difícil na técnica de carregamento é segurar o nervo dentro da pipeta.O diâmetro da pipeta deve estar perfeitamente apto, por isso faça alguns vários. Conhecer todos os passos do protocolo são complicados e demonstrar que cada um deles vai ajudar muito. Comece fixando o tecido muscular levator auris longus de uma forma ligeiramente esticada na placa de Petri revestida de elastômero com os pinos finos de aço inoxidável e adicione a solução de Ringer ao prato até que o músculo esteja totalmente coberto.Em seguida, use um puxador de micropipette para preparar uma micropipette com uma ponta afiada fina para as gravações intracelulares. Use capilares sem filamentos internos. Depois de marcar o afunilador com um abrasivo, quebre a ponta da micropipette, deixando uma ponta aberta para cerca de 100 micrômetros de diâmetro.Em seguida, o fogo polir a ponta até que o diâmetro interno diminua de 80 micrômetros para 12 micrômetros. Quando feito, conecte um tubo de silicone a um lado e uma seringa sem agulha ao outro lado da pipeta de enchimento. Sob um microscópio estéreo, descubra onde o tronco nervoso se transforma em galhos nervosos separados.Coloque a pipeta de enchimento na placa de Petri usando cera e, em seguida, mova a ponta da pipeta até que ela fique acima do nervo. Corte o nervo perto da fibra muscular com uma tesoura fina, deixando um pequeno pedaço do toco nervoso, cerca de um milímetro de comprimento. Em seguida, aspire o toco nervoso com alguma solução ringer na ponta da pipeta de enchimento, sem beliscar o nervo.Uma vez feito, remova o tubo de silicone da pipeta de enchimento. Mais tarde, use uma seringa com um filamento longo para desenhar a solução de carregamento de corante. Em seguida, insira a ponta de filamento com a solução de carregamento na pipeta de enchimento e solte a mistura no toco nervoso, seguido de incubação da preparação do nervo à temperatura ambiente no escuro por 30 minutos.Após a incubação, enxágue a preparação do nervo com a solução fresca de Ringer antes de tratá-lo com 50 mililitros da solução de Ringer em um copo de vidro a 25 graus Celsius por duas horas. Para a microscopia confocal, monte a preparação do nervo em uma câmara experimental revestida de elastômero de silício e fixe-a, ligeiramente esticada, com um conjunto de microaídas de aço. Em seguida, enxágue a preparação extensivamente com a solução do Ringer.Instale um eletrodo de sucção na câmara. Depois de montar a câmara de preparação no estágio do microscópio, coloque as encaixes de entrada e saída na câmara. Ligue um sistema acionado pelo fluxo de gravidade para remover a solução em excesso da preparação.Uma vez feito, conecte o eletrodo de sucção estimulante em um estimulador elétrico e garanta que as contrações musculares ocorram após estímulos. Em seguida, encha o sistema de perfusão com a solução do Ringer contendo 10 micromolar d-tubocurarine e ligue a bomba de sucção de perfusão para iniciar a perfusão. No microscópio confocal de varredura a laser, ou software LSCM, escolha o modo de eletrofisiologia e aquisição para definir parâmetros de imagem.Nas configurações do menu de trabalho, selecione as configurações do gatilho para acionar o estimulador com o pulso de sincronização do microscópio e defina o gatilho no campo de quadros para o canal OUT 1. Gire o modo de digitalização para XYT em uma frequência de varredura de 1.400 hertz. O fator de zoom deve ser 6.1 com o pinhole totalmente aberto.Certifique-se de que o modo X sequencial, transpassante e bidirecional esteja ligado, então, defina o tempo mínimo para formar um quadro a 52 milissegundos e colete quadros em um vídeo bruto a 20 quadros. Defina o comprimento de onda de excitação do laser de argônio a 488 nanômetros com 8% de potência de saída. Quando os parâmetros estiverem definidos, pressione o botão de modo ao vivo para obter uma visualização ao vivo dos terminais nervosos carregados com o corante.No modo ao vivo, procure a região de interesse, ou ROI, para obter o melhor foco. Em seguida, mude o atraso no estimulador em dois milissegundos a menos em relação ao valor anterior e execute o software de aquisição de dados para adquirir 26 sequências, mudando cada sequência dois milissegundos do anterior. Para processar os vídeos capturados, execute o software Leica Application Suite X ou LAS X e abra o projeto criado.Em seguida, clique em exportar e salvar como salvar quadros no formato TIF na pasta de destino. Em seguida, execute o software ImageJ e clique em arquivo, importação e sequência de imagem. Na janela de sequência de imagens abertas, escolha a pasta de destino e abra o primeiro quadro.A partir das opções de sequência, vá para o campo de imagem inicial e defina o número do quadro para um para o primeiro quadro. Em seguida, no campo de incremento, defina o valor igual ao número de quadros na gravação inicial do sinal antes de clicar bem. Para salvar o arquivo gerado dos primeiros quadros costurados em uma pasta separada, clique nas guias arquivo, salvar e pastas em ordem.Repita os procedimentos para 19 quadros definindo o número de quadro correspondente no campo de imagem inicial. Quando todas as imagens forem obtidas, clique em arquivo, importação e sequência de imagens para selecionar uma nos campos de imagem inicial e incremento. O vídeo final com todos os quadros costurados em resolução temporal aumentada pode ser visto.Em seguida, salve o arquivo de vídeo no formato TIF. Para analisar o vídeo costurado, clique em imagem, pilhas, ferramentas e empilhador. Em seguida, vá para análise, ferramentas e gerente de ROI.Arraste e solte o arquivo TIF salvo anteriormente na janela ImageJ e, em seguida, expanda a imagem para uma visualização melhor. Para melhorar a visualização da imagem, clique na imagem, ajuste, para ativar o contraste de brilho ao automático. Defina o fundo perto do terminal nervoso, desenhando ROI e agregando valor ao gerenciador de ROI.Em seguida, calcule o plano de fundo clicando em mais e várias medidas. Copiar valores médios para colar no programa de planilha. Então, calcule o valor médio.Em seguida, subtraia o valor médio calculado das pilhas clicando no processo, principal e subtraído. Digite o valor obtido e desenhe ROI em torno de um terminal nervoso através de uma linha de polígono antes de adicioná-lo ao gerenciador de ROI. Meça a intensidade transitória do terminal nervoso clicando em abas cada vez mais e multi medidas.Em seguida, copie os valores médios de intensidade e cole-os ao programa de planilha para calcular a compensação média dos sinais. Divida os valores do sinal pelo valor médio de deslocamento. A partir do valor obtido, subtraia um e, em seguida, multiplicar-se por 100%, seguido de traçar um gráfico transitório de cálcio para determinar a amplitude.Depois de carregar a preparação nervosa com um corante, a maior parte da sinapse está localizada perto do toco nervoso, indicando um nível suficiente de fluorescência. Após o processamento da imagem, foram obtidas transitoriedade de cálcio com a resolução espacial e temporal desejada. Um dos passos mais importantes deste protocolo é que o toco nervoso deve ser colocado na solução de corante contendo nos primeiros minutos após o corte do nervo.Este método pode ser usado para carregar vários corantes e drogas em neurônios motores. O protocolo de registro pode ser útil para avaliar o cálcio em dendritos e colunas nas preparações do CNS. Nossa técnica permite registrar um sinal de cálcio com boa resolução espacial e temporal.Estudar a transitoriedade do cálcio é uma ferramenta poderosa na regulação da pesquisa de uma liberação neurotransmissor e plasticidade sináptica.

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