Name: registration of calcium transients in mouse neuromuscular junction with high temporal resolution using confocal microscopy
Uploaded: 2021-12-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy at JoVE.com

Флуоресцентные исследования данной работы проводились при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (проект No 19-15-00329). Методика разработана при финансировании из государственного задания для ФРЦ Казанского научного центра РАН АААА-А18-118022790083-9. Исследование разработано с использованием оборудования Федерального исследовательского центра «Казанский научный центр РАН». Авторы хотели бы поблагодарить доктора Виктора Ивановича Ильина за критическое прочтение этой рукописи.

Проводились эксперименты на изолированных нервно-мышечных препаратах levator auris longus (m. LAL) у мышей BALB/C (20-23 г, 2-3 месяца)41. Экспериментальные процедуры проводились в соответствии с руководством по использованию лабораторных животных Казанского федерального университета ?...

В данной статье представлен способ загрузки Ca2+-чувствительного красителя в нервные окончания мыши через культю нерва и регистрации быстрого кальциевого транзитора с помощью конфокального микроскопа. В результате реализации данного нагрузочного метода большинство синапсов, ра...

Проблема измерения быстрых кальциевых волн в возбудимых клетках является одним из важнейших и сложных аспектов изучения передачи сигнала в центральной и периферической нервной системе. Ионы кальция играют важную роль в запуске высвобождения нейромедиаторов, синаптической пластичности и модуляции активности различных внутриклеточных белков 1,2,3,4,5. Изучение передачи сигналов кальция также важно для поиска способов лечения нейродегенеративных заболеваний6. Для измерения изменений уровня кальция обычно используют флуоресцентные кальциечувствительные красители, а изменения уровня их флуоресценции анализируются 7,8,9.
Загрузка кальциевых красителей в клетки может достигаться по-разному. Преимущественно используются клеточно-проницаемые красители10,11. Однако в таком случае не только трудно контролировать концентрацию красителя внутри клетки, но и трудно выбрать клетки-мишени для загрузки. Этот метод не применим для изучения периферических нервных окончаний, так как краситель попадает в постсинаптические клетки. Вместо этого для таких препаратов больше подходят клеточные непроницаемые красители. В этом случае красители доставляются в клетки путем микроинъекции или через пластырную пипетку 12,13,14. Существует также метод загрузки через культю нерва. Последний способ наиболее подходит для препаратов нервно-мышечных соединений 15,16,17,18,19,20. Это позволяет выполнять окрашивание только для интересующих клеток. Хотя этот способ не обеспечивает точную оценку концентрации красителя в клетке-мишени, концентрацию можно оценить приблизительно путем сравнения уровня флуоресценции клеток в состоянии покоя в растворах с известной концентрацией кальция21. В данном исследовании представлена модификация данного метода, применяемая к синапсам млекопитающих.
Поступление кальция во время деполяризующей фазы потенциала действия происходит быстрым процессом, особенно в нервно-мышечном соединении; поэтому для его регистрации требуется соответствующее оборудование1. Недавнее исследование с использованием чувствительного к напряжению флуоресцентного красителя показало, что продолжительность потенциала действия в периферическом синапсе мыши составляет примерно 300 мкс22. Кальций переходный, оцениваемый с помощью кальций-чувствительных красителей в периферических синапсах лягушки, имеет большую продолжительность: время нарастания составляет около 2-6 мс, а время распада составляет около 30-90 мс, в зависимости от используемого кальциевого красителя23,24. Для измерения быстрых процессов с помощью флуоресцентных красителей обычно используются ПЗС- или КМОП-камеры с быстрыми и чувствительными ПЗС-матрицами. Однако эти камеры имеют недостаток низкого разрешения, ограниченного размерами чувствительных элементов матрицы 25,26,27,28. Самые быстрые камеры с достаточной чувствительностью для записи как потенциалов действия, так и переходных процессов кальция в ответ на низкочастотную стимуляцию клеток имеют частоту сканирования 2000 Гц, а матрицу с размерностью 80 х 8029. Для получения сигналов с более высоким пространственным разрешением используется конфокальная микроскопия, особенно если необходимо оценить некоторые объемные изменения сигнала 30,31,32. Но следует иметь в виду, что конфокальная микроскопия имеет высокую скорость сканирования в режиме линейного сканирования, но все же существуют существенные ограничения на скорость записи быстрых процессов при построении пространственного изображения33. Существуют конфокальные микроскопы на основе вращающихся дисков Нипкова (щелевая сканирующая микроскопия) и сканеры Multipoint-Array, которые имеют более высокую скорость сканирования. При этом они уступают классическим конфокальным микроскопам в конфокальной фильтрации изображений (точечные перекрестные помехи для микроскопов с диском Нипкова)32,34,35. Конфокальная визуализация с резонансным сканированием также может обеспечить высокое пространственно-временное разрешение, необходимое для высоких временных измерений36. Однако учтите, что для регистрации слабых флуоресцентных откликов при высокой скорости сканирования при использовании резонансных сканеров требуются высокочувствительные детекторы, такие как гибридные детекторы36.
В данной статье представлен метод увеличения временного разрешения сигналов, записанных с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (LSCM) при сохранении пространственного разрешения37. Текущий метод является дальнейшим развитием методов, описанных ранее и перенесенных на платформу LSCM 38,39,40. Такой подход не требует изменений в аппаратном обеспечении микроскопа и основан на применении алгоритма записи периодически вызываемых флуоресцентных сигналов со сдвигом времени относительно момента стимуляции.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Clark Electromedical instruments, UK</td>
			<td>GC150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP</td>
			<td>Leica Microsystems , Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller P 97</td>
			<td>Sutter Instrument, USA</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow regulator</td>
			<td>KD Medical GmbH Hospital Products, Germany</td>
			<td>KD REG</td>
			<td>Disposable infusion set with Flow regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H0887</td>
			<td>100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system Leica CLS 150X</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Las AF software</td>
			<td>Leica Microsystems, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Las X software</td>
			<td>Leica Microsystems, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Holder with Suction Tubing</td>
			<td>BIOSCIENCE TOOLS, USA</td>
			<td>MTH-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspin FV 2400</td>
			<td>Biosan, Latvia</td>
			<td>BS-010201-AAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine science tools, Canada</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-spin MSC 3000</td>
			<td>Biosan, Latvia</td>
			<td>BS-010205-AAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>O6806</td>
			<td>500 &#956;g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Biohit, Russia</td>
			<td>720210</td>
			<td>0.5-10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip</td>
			<td>Biohit, Russia</td>
			<td>781349</td>
			<td>10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine</td>
			<td>local producer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use hypodermic needles</td>
			<td>Bbraun</td>
			<td>100 Sterican</td>
			<td>0.4&#215;40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft, USA</td>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems , Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction electrode</td>
			<td>Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal.&#160;- 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16.</td>
			<td></td>
			<td>http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer</td>
			<td>Dow Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>local producer</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>local producer</td>
			<td></td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

registration of calcium transients in mouse neuromuscular junction with high temporal resolution using confocal microscopy

Оценка уровня пресинаптического кальция является ключевой задачей в изучении синаптической передачи, поскольку поступление кальция в пресинаптическую клетку вызывает каскад событий, приводящих к высвобождению нейротрансмиттера. Кроме того, изменения уровня пресинаптического кальция опосредуют активность многих внутриклеточных белков и играют важную роль в синаптической пластичности. Изучение передачи сигналов кальция также важно для поиска способов лечения нейродегенеративных заболеваний. Нервно-мышечное соединение является подходящей моделью для изучения синаптической пластичности, так как имеет только один тип нейротрансмиттера. В этой статье описывается метод загрузки кальциечувствительного красителя через разрезанный нервный пучок в двигательные нервные окончания мышей. Этот метод позволяет оценить все параметры, связанные с внутриклеточными изменениями кальция, такие как базальный уровень кальция и переходный кальций. Поскольку приток кальция из клетки снаружи в нервные окончания и его связывание /развязывание с кальциечувствительным красителем происходят в диапазоне нескольких миллисекунд, для записи этих событий требуется быстрая система визуализации. Действительно, высокоскоростные камеры обычно используются для регистрации быстрых изменений кальция, но они имеют низкие параметры разрешения изображения. Протокол, представленный здесь для регистрации переходного кальция, обеспечивает чрезвычайно хорошее пространственно-временное разрешение, обеспечиваемое конфокальной микроскопией.

После загрузки препарата красителем по представленной методике большинство синапсов, расположенных близко к культе нерва, имели достаточный уровень флуоресценции (см. Фиг.2). После загрузки препарата красителем и применения описанного способа регистрации и обработки ?...

Watch this Scientific Journal Video about Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy at JoVE.com

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Протокол описывает способ загрузки флуоресцентного кальциевого красителя через разрезанный нерв в мышиные двигательные нервные окончания. Кроме того, представлен уникальный метод регистрации быстрых переходных процессов кальция в периферических нервных окончаниях с помощью конфокальной микроскопии.

Регистрация переходных процессов кальция в нервно-мышечном соединении мыши с высоким временным разрешением с помощью конфокальной микроскопии

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Оценка пресинаптического уровня кальция является ключевой задачей в изучении синаптической передачи. Изучение передачи сигналов кальция также важно для поиска способов лечения нейродегенеративных заболеваний. Основным преимуществом представленной методики загрузки является то, что окрашивание выполнено только для интересующих клеток.Наш метод регистрации непримиримости кальция обеспечивает чрезвычайно хорошее пространственно-временное разрешение. Представленный метод регистрации может быть полезен нейрофизиологам, которым необходимо регистрировать быстрые периодические процессы с помощью конфокального микроскопа. Самым сложным этапом в технике загрузки является удержание нерва внутри пипетки.Диаметр пипетки должен идеально подходить, поэтому сделайте несколько. Знание всех шагов в протоколе сложны и демонстрация каждого из них очень поможет. Начните с фиксации мышечной ткани levator auris longus слегка растянутым образом в чашке Петри, покрытой эластомером, тонкими штифтами из нержавеющей стали и добавьте раствор Рингера в блюдо до тех пор, пока мышца не будет полностью покрыта.Затем используйте съемник микропипетки, чтобы подготовить микропипетку с тонким острым наконечником для внутриклеточных записей. Используйте капилляры без внутренних нитей. Забив конус абразивом, отломите наконечник микропипетки, оставив наконечник открытым примерно до 100 микрометров в диаметре.Затем отполируйте наконечник огнем до тех пор, пока внутренний диаметр не уменьшится с 80 микрометров до 12 микрометров. Когда все будет готово, прикрепите силиконовую трубку к одной стороне и шприц без иглы к другой стороне пломбировочной пипетки. Под стереомикроскопом найдите, где нервный ствол превращается в отдельные нервные ветви.Поместите начиночную пипетку на чашку Петри с помощью воска, а затем переместите кончик пипетки, пока он не встанет над нервом. Разрежьте нерв близко к мышечному волокну тонкими ножницами, оставив небольшой кусочек культи нерва, длиной около одного миллиметра. Затем аспирируйте культю нерва каким-нибудь раствором Рингера в кончик пломбировочной пипетки, не защемляя нерв.После этого снимите силиконовую трубку с пломбировочной пипетки. Позже используйте шприц с длинной нитью, чтобы нарисовать раствор для загрузки красителя. Затем вводят наконечник нити с загрузочным раствором в пломбировочную пипетку и выпускают смесь на культю нерва с последующим инкубированием нервного препарата при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.После инкубации промыть нервный препарат свежим раствором Рингера, прежде чем обрабатывать его 50 миллилитрами раствора Рингера в стеклянном стакане при 25 градусах Цельсия в течение двух часов. Для конфокальной микроскопии установите нервный препарат в экспериментальную камеру, покрытую кремниевым эластомером, и зафиксируйте ее, слегка растянутую, с помощью набора стальных микроигл. Затем тщательно промойте препарат раствором Рингера.Установите всасывающий электрод на камеру. После установки подготовительной камеры на ступень микроскопа поместите впускные и выпускные фитинги в камеру. Включите систему с гравитационным потоком, чтобы удалить лишний раствор из препарата.После этого подключите стимулирующий всасывающий электрод к электрическому стимулятору и убедитесь, что мышечные сокращения происходят после стимулов. Затем заполните перфузионную систему раствором Рингера, содержащим 10 микромолярного d-тубокурарина, и включите перфузионный всасывающий насос, чтобы начать перфузию. В лазерном сканирующем конфокальном микроскопе или программном обеспечении LSCM выберите электрофизиологию и режим сбора для установки параметров визуализации.В настройках меню заданий выберите настройки триггера для запуска стимулятора с синхронизирующим импульсом микроскопа и установите триггер на поле кадра на канал OUT 1. Включите режим сканирования в XYT на частоте сканирования 1,400 герц. Коэффициент масштабирования должен быть 6,1 при полностью открытом отверстии.Убедитесь, что включен последовательный, транспассионный, двунаправленный режим X, затем установите минимальное время для формирования кадра в 52 миллисекунды и сбора кадров в необработанное видео через 20 кадров. Установите длину волны возбуждения аргонового лазера на уровне 488 нанометров при 8% выходной мощности. Когда параметры установлены, нажмите кнопку режима реального времени, чтобы получить предварительный просмотр нервных окончаний, загруженных красителем.В режиме реального времени найдите интересующий регион или рентабельность инвестиций, чтобы получить наилучший фокус. Затем сдвиньте задержку на стимуляторе на две миллисекунды меньше относительно предыдущего значения и запустите программное обеспечение для сбора данных, чтобы получить 26 последовательностей, сместив каждую последовательность на две миллисекунды от предыдущей. Чтобы обработать захваченные видео, запустите программное обеспечение Leica Application Suite X или LAS X и откройте созданный проект.Затем нажмите «Экспорт» и сохраните как сохранить кадры в формате TIF в папке назначения. Затем запустите программное обеспечение ImageJ и нажмите на файл, импорт и последовательность изображений. В окне открытия последовательности изображений выберите папку назначения и откройте первый кадр.В параметрах последовательности перейдите к начальному полю изображения и установите номер кадра равным единице для первого кадра. Затем в поле приращения установите значение, равное количеству кадров в начальной записи сигнала, прежде чем нажать кнопку «ОК». Чтобы сохранить сгенерированный файл сшитых первых кадров в отдельную папку, нажмите на вкладки файл, сохранить и папку по порядку.Повторите процедуры для 19 кадров, установив соответствующий номер кадра в поле начального изображения. Когда все изображения будут получены, нажмите на файл, импорт и последовательность изображений, чтобы выбрать один в начальных полях изображения и инкремента. Можно увидеть финальное видео со всеми кадрами, сшитыми вместе с увеличенным временным разрешением.Затем сохраните видеофайл в формате TIF. Чтобы проанализировать сшитое видео, нажмите на изображение, стеки, инструменты и сортировщик стеков. Затем перейдите к анализу, инструментам и менеджеру ROI.Перетащите TIF-файл, сохраненный ранее, в окно ImageJ, а затем разверните изображение для лучшего просмотра. Чтобы улучшить визуализацию изображения, нажмите на изображение, отрегулируйте, чтобы включить контраст яркости в авто. Установите фон близко к нервному терминалу, нарисовав ROI и добавив ценность менеджеру ROI.Затем рассчитайте фон, нажав на more и multi measure. Скопируйте средние значения для вставки в программу для работы с электронными таблицами. Затем рассчитайте среднее значение.Затем вычтите вычисляемое среднее значение из стеков, щелкнув процесс, основной и вычтите. Введите полученное значение и нарисуйте ROI вокруг нервного терминала через полигональную линию, прежде чем добавлять его в менеджер ROI. Измерьте переходную интенсивность нервного терминала, щелкнув больше и несколько измеряя вкладки.Затем скопируйте средние значения интенсивности и вставьте их в программу для работы с электронными таблицами, чтобы рассчитать среднее смещение сигналов. Разделите значения сигнала на среднее значение смещения. Из полученного значения вычтите единицу, а затем умножьте на 100%, а затем постройте график переходных процессов кальция для определения амплитуды.После загрузки нервного препарата красителем большая часть синапса располагается близко к культе нерва, указывается достаточный уровень флуоресценции. После обработки изображения была получена теплотечная передача кальция с требуемым пространственным и временным разрешением. Одним из наиболее важных шагов в этом протоколе является то, что культя нерва должна быть помещена в краситель, содержащий раствор, в первые несколько минут после разрезания нерва.Этот метод может быть использован для загрузки различных красителей и лекарств в двигательные нейроны. Протокол регистрации может быть полезен для оценки кальция в дендритах и шипах в препаратах ЦНС. Наша методика позволяет регистрировать кальциевый сигнал с хорошим пространственным и временным разрешением.Изучение быстротечности кальция является мощным инструментом в исследованиях регуляции высвобождения нейротрансмиттера и синаптической пластичности.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Skeletal Muscle Relaxants

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Препарирование и обработка изображений активных зон в Drosophila Нервно-мышечном соединении

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Последовательное фото-отбеливание разграничить отдельные клетки шванновских в нервно-мышечном соединении

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Микронного масштаба Разрешение оптической томографии целых мозг мышей с конфокальной Light Sheet микроскопии

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Обнаружение<em&gt; На месте</em&gt; белок-белковых комплексов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинок нервно-мышечного соединения, используя Пробирной Расстояние Лигирование

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Нервно-мышечном соединении: Synapse размер измерение, фрагментации и изменения в синаптической белка плотности с использованием конфокальной флуоресцентной микроскопии

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

Загрузка кальциевой красителя в нервные окончания лягушек через нервный культи: регистрация переходного процесса кальция в нервно-мышечном соединении лягушки

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Измерение функции нервно-Джанкшен

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Два Алгоритмы высокой пропускной способности и мульти-параметрической Количественное<em&gt; Drosophila</em&gt; Нейромышечная Junction Морфология

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Высоким разрешением конфокальная томография Blood - brain барьер: Визуализация, 3D-реконструкции и количественной оценки Трансцитоз

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Фокуса Macropatch записи синаптических токов от дрозофилы личиночной нервно-Джанкшен

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...