Name: registration of calcium transients in mouse neuromuscular junction with high temporal resolution using confocal microscopy
Uploaded: 2021-12-01T14:00:00
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Los estudios de fluorescencia de este trabajo se llevaron a cabo con el apoyo financiero de la Subvención de la Fundación Rusa de Ciencias (proyecto No. 19-15-00329). El método fue desarrollado bajo la financiación de la asignación del gobierno para FRC Kazan Scientific Center de RAS АААА-А18-118022790083-9. La investigación se desarrolló con el uso del equipo del Centro Federal de Investigación "Kazan Scientific Center of RAS". Los autores desean agradecer al Dr. Victor I. Ilyin por la lectura crítica de este manuscrito.

Los experimentos se realizaron en preparaciones nerviosas-musculares aisladas de elevador del auris largo (m. LAL) de los ratones BALB/C (20-23 g, 2-3 meses de edad)41. Los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las directrices para el uso de animales de laboratorio de la Universidad Federal de Kazán y la Universidad Médica de Kazán, de conformidad con la Guía de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. El protocolo experimental cumplió con los re...

En este artículo se presenta el método para cargar colorante sensible al Ca2+ en terminaciones nerviosas de ratón a través del muñón nervioso y para registrar un transitorio rápido de calcio utilizando un microscopio confocal. Como resultado de la implementación de este método de carga, la mayoría de las sinapsis ubicadas cerca del muñón nervioso tenían un nivel suficiente de fluorescencia para permitir el registro de la entrada de calcio en las terminaciones nerviosas en respuesta a la estimulaci...

El problema de medir las ondas rápidas de calcio en las células excitables es uno de los aspectos más importantes y desafiantes del estudio de la transmisión de señales en los sistemas nerviosos central y periférico. Los iones de calcio juegan un papel importante en el desencadenamiento de la liberación de neurotransmisores, la plasticidad sináptica y la modulación de la actividad de varias proteínas intracelulares 1,2,3,4,5. El estudio de la señalización del calcio también es importante para encontrar formas de tratar las enfermedades neurodegenerativas6. Para medir los cambios en los niveles de calcio, se utilizan comúnmente colorantes fluorescentes sensibles al calcio, y se analizan los cambios en su nivel de fluorescencia 7,8,9.
La carga de colorantes de calcio en las células se puede lograr de diferentes maneras. Predominantemente, se utilizan colorantes perfeccionados por células10,11. Sin embargo, en tal caso, no solo es difícil controlar la concentración de un tinte dentro de la célula, sino que también es difícil seleccionar las células objetivo para la carga. Este método no es aplicable para estudiar las terminaciones nerviosas periféricas ya que el tinte entra en las células postsinápticas. En cambio, los tintes impermean celulares son más adecuados para tales preparaciones. En este caso, los colorantes se administran a las células mediante microinyección o a través de una pipeta de parche12,13,14. También hay un método de carga a través de un muñón nervioso. Este último método es el más adecuado para preparaciones de unión neuromuscular 15,16,17,18,19,20. Permite realizar tinción solo para células de interés. Aunque este método no proporciona una evaluación precisa de la concentración del colorante en la célula diana, la concentración puede estimarse aproximadamente comparando el nivel de fluorescencia de las células en reposo en soluciones con una concentración conocida de calcio21. En este estudio, se presenta una modificación de este método aplicado a las sinapsis de mamíferos.
La entrada de calcio durante la fase de despolarización del potencial de acción es un proceso rápido, especialmente en la unión neuromuscular; Por lo tanto, para su registro, se requiere el equipo adecuado1. Un estudio reciente que utilizó un tinte fluorescente sensible al voltaje demostró que la duración del potencial de acción en la sinapsis periférica de un ratón es de aproximadamente 300 μs22. El calcio transitorio, evaluado utilizando colorantes sensibles al calcio en las sinapsis periféricas de la rana, tiene una duración más larga: el tiempo de subida es de aproximadamente 2-6 ms y el tiempo de descomposición es de aproximadamente 30-90 ms, dependiendo del colorante de calcio utilizado23,24. Para medir procesos rápidos con la ayuda de tintes fluorescentes, generalmente se utilizan cámaras CCD o CMOS, con matrices CCD rápidas y sensibles. Sin embargo, estas cámaras tienen la desventaja de baja resolución, limitada por el tamaño de los elementos sensibles de la matriz25,26,27,28. Las cámaras más rápidas con sensibilidad suficiente para registrar tanto potenciales de acción como transitorios de calcio en respuesta a la estimulación de baja frecuencia de las células tienen una frecuencia de barrido de 2.000 Hz, y una matriz con una dimensión de 80 x 8029. Para obtener señales con una mayor resolución espacial, se utiliza microscopía confocal, especialmente si es necesario evaluar algunos cambios volumétricos en la señal30,31,32. Pero debe tenerse en cuenta que la microscopía confocal tiene una alta velocidad de escaneo en modo de escaneo en línea, pero todavía existen limitaciones significativas en la velocidad de grabación de procesos rápidos al construir una imagen espacial33. Existen microscopios confocales basados en discos giratorios de Nipkow (microscopía de barrido de hendidura) y escáneres multipunto-array, que tienen una mayor velocidad de barrido. Al mismo tiempo, son inferiores a los microscopios confocales clásicos en el filtrado de imágenes confocales (diafonía estenopeica para microscopios con un disco de Nipkow)32,34,35. La imagen confocal con escaneo de resonancia también puede proporcionar una alta resolución espacio-temporal requerida para mediciones temporales altas36. Sin embargo, tenga en cuenta que el registro de respuestas fluorescentes débiles a una alta velocidad de escaneo cuando se utilizan escáneres de resonancia requiere detectores altamente sensibles como los detectores híbridos36.
Este artículo presenta un método para aumentar la resolución temporal de las señales registradas con la Microscopía Confocal de Barrido Láser (LSCM) manteniendo la resolución espacial37. El método actual es un desarrollo adicional de los métodos descritos anteriormente y transferidos a la plataforma LSCM38,39,40. Este enfoque no requiere cambios en el hardware del microscopio y se basa en la aplicación de un algoritmo para registrar periódicamente señales fluorescentes evocadas con un cambio de tiempo relativo al momento de la estimulación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Clark Electromedical instruments, UK</td>
			<td>GC150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP</td>
			<td>Leica Microsystems , Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller P 97</td>
			<td>Sutter Instrument, USA</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow regulator</td>
			<td>KD Medical GmbH Hospital Products, Germany</td>
			<td>KD REG</td>
			<td>Disposable infusion set with Flow regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H0887</td>
			<td>100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system Leica CLS 150X</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Las AF software</td>
			<td>Leica Microsystems, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Las X software</td>
			<td>Leica Microsystems, Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Holder with Suction Tubing</td>
			<td>BIOSCIENCE TOOLS, USA</td>
			<td>MTH-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspin FV 2400</td>
			<td>Biosan, Latvia</td>
			<td>BS-010201-AAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine science tools, Canada</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-spin MSC 3000</td>
			<td>Biosan, Latvia</td>
			<td>BS-010205-AAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>O6806</td>
			<td>500 &#956;g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Biohit, Russia</td>
			<td>720210</td>
			<td>0.5-10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip</td>
			<td>Biohit, Russia</td>
			<td>781349</td>
			<td>10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine</td>
			<td>local producer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use hypodermic needles</td>
			<td>Bbraun</td>
			<td>100 Sterican</td>
			<td>0.4&#215;40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft, USA</td>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope, Leica M80</td>
			<td>Leica Microsystems , Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction electrode</td>
			<td>Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal.&#160;- 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16.</td>
			<td></td>
			<td>http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer</td>
			<td>Dow Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>local producer</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>local producer</td>
			<td></td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

registration of calcium transients in mouse neuromuscular junction with high temporal resolution using confocal microscopy

La estimación del nivel de calcio presináptico es una tarea clave en el estudio de la transmisión sináptica, ya que la entrada de calcio en la célula presináptica desencadena una cascada de eventos que conducen a la liberación de neurotransmisores. Además, los cambios en los niveles de calcio presináptico median la actividad de muchas proteínas intracelulares y juegan un papel importante en la plasticidad sináptica. El estudio de la señalización del calcio también es importante para encontrar formas de tratar las enfermedades neurodegenerativas. La unión neuromuscular es un modelo adecuado para estudiar la plasticidad sináptica, ya que tiene un solo tipo de neurotransmisor. Este artículo describe el método para cargar un tinte sensible al calcio a través del haz de nervios cortado en las terminaciones nerviosas motoras de los ratones. Este método permite la estimación de todos los parámetros relacionados con los cambios intracelulares de calcio, como el nivel de calcio basal y el calcio transitorio. Dado que la afluencia de calcio desde el exterior de la célula hacia las terminales nerviosas y su unión / desunión al tinte sensible al calcio ocurre dentro del rango de unos pocos milisegundos, se requiere un sistema de imágenes rápido para registrar estos eventos. De hecho, las cámaras de alta velocidad se utilizan comúnmente para el registro de cambios rápidos de calcio, pero tienen parámetros de baja resolución de imagen. El protocolo presentado aquí para el registro transitorio de calcio permite una resolución espacio-temporal extremadamente buena proporcionada por microscopía confocal.

Después de cargar la preparación con colorante de acuerdo con la técnica presentada, la mayoría de las sinapsis ubicadas cerca del muñón nervioso tenían un nivel suficiente de fluorescencia (ver Figura 2). Después de cargar la preparación con el tinte y aplicar el método descrito de registro y procesamiento de imágenes, se obtuvieron transitorios de calcio con la resolución espacial y temporal deseada (ver Figura 4). El transitorio de calcio se ha re...

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Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

El protocolo describe el método de carga de un tinte de calcio fluorescente a través del nervio cortado en las terminales nerviosas motoras del ratón. Además, se presenta un método único para registrar transitorios rápidos de calcio en las terminaciones nerviosas periféricas mediante microscopía confocal.

Registro de transitorios de calcio en unión neuromuscular de ratón con alta resolución temporal mediante microscopía confocal

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

La estimación de un nivel de calcio presináptico es una tarea clave en el estudio de la transmisión sináptica. El estudio de la señalización del calcio también es importante para encontrar formas de tratar las enfermedades neurodegenerativas. La principal ventaja de la técnica de carga presentada es que la tinción se ha realizado solo para las células de interés.Nuestro método para registrar la intransiencia del calcio proporciona una resolución espacio-temporal extremadamente buena. El método de registro presentado puede ser útil para los neurofisiólogos que necesitan registrar procesos periódicos rápidos utilizando un microscopio confocal. El paso más difícil en la técnica de carga es mantener el nervio dentro de la pipeta.El diámetro de la pipeta debe ajustarse perfectamente, así que haga algunas varias. Conocer todos los pasos del protocolo es complicado y demostrar cada uno de ellos ayudará mucho. Comience fijando el tejido muscular elevador del auris largo de una manera ligeramente estirada en la placa de Petri recubierta de elastómero con los finos pasadores de acero inoxidable y agregue la solución de Ringer al plato hasta que el músculo esté completamente cubierto.A continuación, utilice un extractor de micropipetas para preparar una micropipeta con una punta fina y afilada para las grabaciones intracelulares. Utiliza capilares sin filamentos internos. Después de marcar el cono con un abrasivo, rompa la punta de la micropipeta, dejando una punta abierta a unos 100 micrómetros de diámetro.Luego, pulir la punta a fuego hasta que el diámetro interno se reduzca de 80 micrómetros a 12 micrómetros. Cuando haya terminado, conecte un tubo de silicona a un lado y una jeringa sin aguja al otro lado de la pipeta de llenado. Bajo un microscopio estereoscópico, encuentre dónde el tronco nervioso se convierte en ramas nerviosas separadas.Coloque la pipeta de relleno en la placa de Petri con cera y, a continuación, mueva la punta de la pipeta hasta que quede por encima del nervio. Corte el nervio cerca de la fibra muscular con tijeras finas, dejando un pequeño trozo del muñón nervioso, de aproximadamente un milímetro de largo. Luego, aspire el muñón del nervio con un poco de solución de Ringer en la punta de la pipeta de relleno, sin pellizcar el nervio.Una vez hecho esto, retire el tubo de silicona de la pipeta de relleno. Más tarde, use una jeringa con un filamento largo para extraer la solución de carga de tinte. Luego, inserte la punta del filamento con la solución de carga en la pipeta de relleno y suelte la mezcla en el muñón nervioso, seguido de incubar la preparación nerviosa a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos.Después de la incubación, enjuague la preparación nerviosa con una solución de Ringer fresca antes de tratarla con 50 mililitros de solución de Ringer en un vaso de precipitados de vidrio a 25 grados centígrados durante dos horas. Para la microscopía confocal, monte la preparación nerviosa en una cámara experimental recubierta de elastómero de silicio y fíjela, ligeramente estirada, con un conjunto de microagujas de acero. Luego, enjuague la preparación extensamente con la solución de Ringer.Instale un electrodo de succión en la cámara. Después de montar la cámara de preparación en la etapa del microscopio, coloque los accesorios de entrada y salida en la cámara. Encienda un sistema impulsado por flujo por gravedad para eliminar el exceso de solución de la preparación.Una vez hecho esto, conecte el electrodo de succión estimulante en un estimulador eléctrico y asegúrese de que las contracciones musculares ocurran después de los estímulos. Luego, llene el sistema de perfusión con la solución de Ringer que contiene 10 d-tubocurarina micromolar y encienda la bomba de succión de perfusión para comenzar la perfusión. En el microscopio confocal de barrido láser, o software LSCM, elija electrofisiología y modo de adquisición para establecer los parámetros de imagen.En la configuración del menú de trabajo, seleccione la configuración del disparador para activar el estimulador con el pulso de sincronización del microscopio y establezca el disparador en el campo de fotograma en el canal OUT 1. Cambie el modo de escaneo a XYT a una frecuencia de escaneo de 1, 400 hertzios. El factor de zoom debe ser 6.1 con el agujero de alfiler completamente abierto.Asegúrese de que el modo X secuencial, transdireccional y bidireccional esté activado, a continuación, establezca el tiempo mínimo para formar un fotograma en 52 milisegundos y recopile fotogramas en un vídeo sin procesar a 20 fotogramas. Ajuste la longitud de onda de excitación del láser de argón a 488 nanómetros con el 8% de la potencia de salida. Cuando se establezcan los parámetros, presione el botón de modo en vivo para obtener una vista previa en vivo de los terminales nerviosos cargados con el tinte.En el modo en vivo, busque la región de interés, o ROI, para obtener el mejor enfoque. Luego, cambie el retraso en el estimulador en dos milisegundos menos en relación con el valor anterior y ejecute el software de adquisición de datos para adquirir 26 secuencias cambiando cada secuencia dos milisegundos de la anterior. Para procesar los vídeos capturados, ejecute el software Leica Application Suite X o LAS X y abra el proyecto creado.Luego, haga clic en exportar y guardar como para guardar fotogramas en formato TIF en la carpeta de destino. A continuación, ejecute el software ImageJ y haga clic en archivo, importación y secuencia de imágenes. En la ventana Abrir secuencia de imágenes, elija la carpeta de destino y abra el primer fotograma.En las opciones de secuencia, vaya al campo de imagen inicial y establezca el número de fotograma en uno para el primer fotograma. A continuación, en el campo de incremento, establezca el valor igual al número de fotogramas en la grabación de señal inicial antes de hacer clic en Aceptar. Para guardar el archivo generado de los primeros fotogramas cosidos en una carpeta separada, haga clic en las pestañas archivo, guardar y carpeta en orden.Repita los procedimientos para 19 fotogramas estableciendo el número de fotograma correspondiente en el campo de imagen inicial. Cuando se obtengan todas las imágenes, haga clic en archivo, importación y secuencia de imágenes para seleccionar una en los campos de imagen inicial e incremento. Se puede ver el video final con todos los fotogramas unidos a mayor resolución temporal.Luego, guarde el archivo de video en formato TIF. Para analizar el video cosido, haga clic en imagen, pilas, herramientas y clasificador de pilas. Luego, vaya a análisis, herramientas y administrador de ROI.Arrastre y suelte el archivo TIF guardado anteriormente en la ventana ImageJ y luego expanda la imagen para una mejor vista. Para mejorar la visualización de la imagen, haga clic en imagen, ajustar, para convertir el contraste de brillo en automático. Establezca el fondo cerca de la terminal nerviosa dibujando ROI y agregando valor al administrador de ROI.Luego, calcule el fondo haciendo clic en más y multi medida. Copie los valores medios para pegarlos en el programa de hoja de cálculo. Luego, calcule el valor promedio.A continuación, reste el valor promedio calculado de las pilas haciendo clic en proceso, principal y restar. Ingrese el valor obtenido y dibuje el ROI alrededor de un terminal nervioso a través de una línea poligonal antes de agregarlo al administrador de ROI. Mida la intensidad transitoria del terminal nervioso haciendo clic en más pestañas y multimedida.A continuación, copie los valores de intensidad media y péguelos en el programa de hoja de cálculo para calcular el desplazamiento medio de las señales. Divida los valores de señal por el valor de desplazamiento promedio. Del valor obtenido, reste uno y luego multiplique por 100% seguido de trazar un gráfico transitorio de calcio para determinar la amplitud.Después de cargar la preparación nerviosa con un tinte, la mayor parte de la sinapsis se encuentra cerca del muñón del nervio, lo que indica un nivel suficiente de fluorescencia. Después del procesamiento de la imagen, se obtuvo la transitoriedad del calcio con la resolución espacial y temporal deseada. Uno de los pasos más importantes en este protocolo es que el muñón del nervio debe colocarse en la solución que contiene el tinte en los primeros minutos después de cortar el nervio.Este método se puede utilizar para cargar varios tintes y medicamentos en las neuronas motoras. El protocolo de registro puede ser útil para evaluar el calcio en dendritas y espinas en preparaciones del SNC. Nuestra técnica permite registrar una señal de calcio con buena resolución espacial y temporal.El estudio de la transitoriedad del calcio es una herramienta poderosa en la regulación de la investigación de la liberación de un neurotransmisor y la plasticidad sináptica.

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