Name: a microphysiological system to study leukocyte-endothelial cell interaction during inflammation
Uploaded: 2021-12-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health, Grant Number: GM114359 e GM134701 (M.F.K. e L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), e Defense Threat Reduction Agency, Grant Number: HDTRA11910012 (M.F.K. e L.E.K.).

Il sangue umano eparinizzato è ottenuto per l'isolamento dei neutrofili da donatori adulti sani (maschi e femmine, di età compresa tra 21 e 60 anni), previo consenso informato approvato dall'Institutional Review Board della Temple University (Philadelphia, PA, USA).
1. Adescamento e rivestimento del dispositivo con fibronectina umana
NOTA: il bMFA ha due porte di ingresso e due porte di uscita collegate al compartimento vascolare. Ha anche una porta...

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F., Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+interactions+in+inflammation.">Leukocyte-endothelial interactions in inflammation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).</li><li>Sadik, C. D., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-cytokine-chemokine+cascades+orchestrate+leukocyte+recruitment+in+inflammation.">Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).</li><li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neutrophil+in+vascular+inflammation.">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).</li><li>Maniatis, N. A., Orfanos, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+endothelial+protein+kinase+C-delta+(PKCd)+regulates+neutrophil+migration+in+acute+lung+inflammation.">Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation.</a> The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).</li><li>Kilpatrick, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+sepsis-induced+lung+injury+by+selective+inhibition+of+protein+kinase+C-d+(d-PKC).">Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC).</a> Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).</li><li>Mondrinos, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+and+efficacy+of+targeted+pulmonary+delivery+of+a+protein+kinase+C-d+inhibitory+peptide:+Impact+on+Indirect+lung+Injury.">Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).</li><li>Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. 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Il bMFA riproduce la topografia e le condizioni di flusso delle reti microvascolari in vivo e può essere utilizzato per studiare l'interazione leucocita-cellula endoteliale e la funzione endoteliale in vitro in condizioni fisiologicamente realistiche. Nella microvascolarizzazione di topo o uomo, la geometria delle reti microvascolari è auto-simile e frattale, e il numero di Reynolds << 1, indicando che la geometria vascolare non influisce in modo significativo sui modelli di flusso. Pertanto, il bFMA ...

L'infiammazione è la risposta dell'ospite a infezioni e lesioni e l'endotelio svolge un ruolo importante nella risposta infiammatoria 1,2,3. La disregolazione infiammatoria è la causa alla base di una serie di patologie come sepsi, malattie cardiovascolari, asma, malattie infiammatorie intestinali, cancro e COVID-19. Le interazioni leucocita-cellula endoteliale svolgono un ruolo centrale in queste malattie infiammatorie. Durante l'infiammazione, il rilascio di PAMPS (pathogen-associated molecular patterns) da patogeni o DAMPS (pattern molecolari associati al danno) da tessuti danneggiati attiva le cellule immunitarie per rilasciare citochine/chemochine e altri mediatori proinfiammatori che portano all'attivazione dell'endotelio, con conseguenti alterazioni della funzione di barriera dell'endotelio vascolare e aumento della permeabilità 3,4 . L'aumento dell'attivazione delle cellule endoteliali durante l'infiammazione si traduce in una maggiore interazione leucocita-cellula endoteliale che porta a un'eccessiva migrazione dei leucociti attivati attraverso l'endotelio vascolare negli organi chiave 1,5,6,7.
Il reclutamento dei leucociti è iniziato da chemioattrattivi chimicamente diversi composti da lipidi bioattivi, citochine, chemochine e componenti del complemento 8,9. Il reclutamento dei leucociti è un processo in più fasi che comprende cinque fasi discrete: 1) marginazione e cattura/attaccamento dei leucociti, 2) rotolamento, 3) arresto fermo, 4) diffusione e strisciamento e 5) stravaso/migrazione (Figura 1). Ogni fase di questo processo richiede una diafonia tra leucociti e cellule endoteliali per orchestrare questo fenomeno dinamico 1,9. In definitiva, i leucociti arrestati si estfusionano ai tessuti infiammati attraverso l'endotelio attraverso un processo a più fasi controllato da segnali chemioattratturanti-dipendenti concorrenti, eventi adesivi e forze di taglio emodinamiche 1,9,10,11,12.
Dato il ruolo centrale dello stress da taglio nella regolazione della funzione delle cellule endoteliali e il significato delle interazioni leucocita-cellule endotelio13, negli ultimi decenni sono stati sviluppati diversi modelli in vitro per studiare vari aspetti della cascata di migrazione dei leucociti in un ambiente più controllato14. I dispositivi fluidici tradizionali per studiare le interazioni leucocita-cellula endoteliale possono essere classificati in due grandi categorie14: a) dispositivi per lo studio del rotolamento dei leucociti, dell'adesione e dell'espressione delle molecole di adesione come le camere di flusso a piastre parallele e b) dispositivi per lo studio della migrazione dei leucociti in condizioni statiche come le camere transwell. Sistemi come le camere di flusso a piastre parallele sono stati utilizzati per studiare i ruoli delle molecole di adesione e dei loro ligandi nella cascata di adesione sotto le forze di taglio15. Tuttavia, uno svantaggio significativo è che questi dispositivi semplicistici e idealizzati (ad esempio, canale dritto) non sono in grado di riprodurre la scala e la geometria della microvascolarizzazione in vivo (ad esempio, biforcazioni vascolari successive, morfologia vascolare) e le condizioni di flusso risultanti (ad esempio, flussi convergenti o divergenti a biforcazioni). Di conseguenza, questi dispositivi possono solo modellare l'adesione ma non la trasmigrazione. Le camere Transwell possono studiare la trasmigrazione solo in condizioni statiche senza considerare le caratteristiche geometriche in vivo e le condizioni di flusso. Pertanto, questi modelli tradizionali non imitano il microambiente dei tessuti viventi o risolvono l'adesione e la migrazione a cascata in un singolo saggio6.
Per affrontare questa limitazione, abbiamo sviluppato e ampiamente convalidato un nuovo saggio microfluidico biomimetico 3D (bMFA) (Figura 2), che riproduce realisticamente reti microvascolari in vivo su un chip 16,17,18. Il protocollo per la microfabbricazione di questo dispositivo è stato pubblicato in precedenza17 ed è solo brevemente descritto qui. La microvascolarizzazione del muscolo cremaster del topo è stata digitalizzata utilizzando un approccio GIS (Geographic Information System) modificato19. Quindi, la rete microvascolare sintetica è stata generata sul polidimetilsilossano (PDMS) utilizzando processi di litografia morbida basati sulla rete microvascolare digitalizzata 14,17,20,21,22. In breve, le immagini di rete digitalizzate sono state stampate su pellicola Mylar, che è stata poi utilizzata come maschera per modellare un fotoresist positivo SU-8 sopra un wafer di silicio per creare i master per la fabbricazione. I pilastri microfabbricati (diametro 10 μm, 3 μm di altezza) sono stati utilizzati per creare i pori alti 3 μm e larghi 100 μm, una dimensione ottimale per la migrazione dei leucociti 23,24,25, collegando i canali vascolari e i compartimenti tissutali. PDMS è stato preparato secondo le istruzioni del produttore e versato sui master sviluppati. Inoltre, il PDMS è stato degassato e lasciato polimerizzare durante la notte in un forno (65 ° C) per creare microcanali complementari in PDMS. Successivamente, il PDMS polimerizzato è stato staccato dal master SU-8, seguito da porte di punzonatura per ingressi / uscite. Quindi, il PMDS è stato plasmato legato a un vetrino. La superficie del dispositivo microfluidico comprende vetro nativo e PDMS. Al fine di promuovere l'attaccamento, la diffusione e la proliferazione cellulare, è necessario il rivestimento a matrice extracellulare (ECM). Il bMFA comprende una rete microvascolare e un compartimento tissutale collegato tramite pori alti 3 μm e larghi 100 μm (Figura 2). Questo sistema microfluidico riproduce l'intera cascata di adesione/migrazione leucocitaria in un ambiente 3D fisiologicamente rilevante di una rete microvascolare completa con vasi interconnessi e biforcazioni, tra cui circolazione, marginazione, rotolamento, adesione e migrazione dei leucociti nel compartimento tissutale extra-vascolare in un unico sistema 14,16,17,21,26.
Va notato che anche quando la portata all'ingresso di bMFA è fissa, le condizioni di flusso nella rete variano in posizioni diverse e non possono essere calcolate con una semplice formula matematica. È stato sviluppato un modello basato sulla fluidodinamica computazionale (CFD) per calcolare diversi parametri di flusso (ad esempio, sforzo di taglio, velocità di taglio, velocità) in diverse posizioni della rete. Questo modello CFD è stato utilizzato per simulare i modelli di perfusione del colorante e i parametri di flusso nel bMFA. La convalida incrociata con i risultati sperimentali ha suggerito che le resistenze di flusso attraverso la rete sono ben previste dal modello computazionale (Figura 3)17. Questo modello CFD è stato quindi utilizzato per stimare la velocità e il profilo della velocità di taglio in ogni vaso di bMFA (Figura 4), consentendo l'analisi degli effetti del flusso di taglio e della geometria sul rotolamento, l'adesione e la migrazione dei leucociti16. I leucociti aderiscono preferenzialmente in prossimità di biforcazioni e in regioni a basso taglio in vivo, e questi modelli spaziali di adesione leucocitaria sono stati dimostrati con successo in bMFA usando neutrofili (Figura 5)16. Questo documento descrive il protocollo per la preparazione di bMFA per studiare l'interazione leucocita-cellula endoteliale in condizioni infiammatorie utilizzando cellule endoteliali microvascolari polmonari umane (HLMVEC) e neutrofili umani. I sistemi microfisiologici, come il bMFA, possono essere utilizzati per studiare le interazioni delle cellule endoteliali con diversi tipi di cellule come neutrofili, monociti, linfociti e cellule tumorali 18,27,28,29,30. Il bMFA può essere seminato con cellule endoteliali primarie di diversi organi (ad esempio, polmone vs cervello) e diverse specie (ad esempio, cellule endoteliali umane vs murine), nonché linee cellulari endoteliali 21,27,31,32. Il bMFA può essere utilizzato per studiare risposte cellulari multiple, interazioni cellula-cellula, funzione barriera, somministrazione di farmaci e tossicità del farmaco.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomimetic microfluidic assay (bMFA)</td>
			<td>SynVivo</td>
			<td>SMN1-C001</td>
			<td>Exclusive at SynVivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG24-0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C70-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFDA, SE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, 250,000, Powder</td>
			<td>Spectrum Chemical Mfg. Corp</td>
			<td>DE-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Premium</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>17-5442-02</td>
			<td>Leukocyte isolation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fMLP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1692630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>33-016-015</td>
			<td>use vendor recommended ECM for different cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3202</td>
			<td>Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lung microvascular endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-2527</td>
			<td>use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-elements, 5.20.01</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhD Ultra Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3007</td>
			<td>Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-003-763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide clamp</td>
			<td>SynVivo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S640-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synvivo Pneumatic Primer</td>
			<td>SynVivo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-5034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-206-8921</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microphysiological system to study leukocyte-endothelial cell interaction during inflammation

Le interazioni leucocita-cellula endoteliale svolgono un ruolo importante nelle malattie infiammatorie come la sepsi. Durante l'infiammazione, l'eccessiva migrazione dei leucociti attivati attraverso l'endotelio vascolare negli organi chiave può portare a insufficienza d'organo. Un saggio microfluidico biomimetico fisiologicamente rilevante (bMFA) è stato sviluppato e validato utilizzando diverse tecniche sperimentali e computazionali, in grado di riprodurre l'intera cascata di rotolamento/adesione/migrazione leucocitaria per studiare le interazioni leucocitaria-cellula endoteliale. Le reti microvascolari ottenute da immagini in vivo nei roditori sono state digitalizzate utilizzando un approccio Geographic Information System (GIS) e microfabbricate con polidimetilsilossano (PDMS) su un vetrino per microscopio. Per studiare l'effetto della velocità di taglio e della topologia vascolare sulle interazioni leucocita-cellula endoteliale, è stato sviluppato un modello di fluidodinamica computazionale (CFD) per generare una mappa corrispondente delle velocità e delle velocità di taglio in tutta la rete. Il bMFA consente la quantificazione delle interazioni leucociti-cellule endoteliali, tra cui la velocità di rotolamento, il numero di leucociti aderenti in risposta a diverse velocità di taglio, il numero di leucociti migrati, la permeabilità delle cellule endoteliali, l'espressione della molecola di adesione e altre variabili importanti. Inoltre, utilizzando campioni correlati all'uomo, come cellule endoteliali umane e leucociti, bMFA fornisce uno strumento per lo screening rapido di potenziali terapie per aumentare la loro traducibilità clinica.

Dopo 48 ore di coltura sotto flusso di taglio in bMFA, le cellule endoteliali coprivano la superficie dei canali vascolari in bMFA e si allineavano nella direzione del flusso (Figura 6). La microscopia confocale ha indicato che tutte le superfici dei canali vascolari erano coperte da cellule endoteliali, formando un lume 3D completo in bMFA18.
Utilizzando questo protocollo, è possibile acquisire una mappa di adesione dei neutrofili, che mo...

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A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

In questo protocollo, un test microfluido biomimetico, in grado di riprodurre un ambiente microvascolare fisiologicamente rilevante e riprodurre l'intera cascata di adesione/migrazione leucocitaria, viene impiegato per studiare le interazioni leucocitaria-cellula endoteliale nella malattia infiammatoria.

Un sistema microfisiologico per studiare l'interazione leucocitaria-cellula endoteliale durante l'infiammazione

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

Le interazioni leucocita-cellula endoteliale svolgono un ruolo importante nelle malattie infiammatorie come la sepsi. La disregolazione dell'infiammazione spesso causa un'alterata funzione di barriera dell'endotelio vascolare e un eccessivo traffico di leucociti, che può causare danni agli organi. Il saggio microfluidico biomimetico, quello che chiamiamo bMFA, riproduce la topografia e le condizioni di flusso delle reti microvascolari in vivo e consente la valutazione in tempo reale del rotolamento, dell'adesione ferma, della diffusione e della migrazione dei neutrofili nel compartimento tissutale.Un punto di forza del test microfluidico biomimetico è la capacità di utilizzare cellule umane primarie e campioni di pazienti clinicamente rilevanti per aumentare la traduzione clinica e vagliare rapidamente potenziali terapie. A dimostrare le procedure sarà il signor Qingliang Yang, un assistente di ricerca laureato del mio laboratorio. Iniziare a inserire il tubo di circa un pollice di lunghezza all'interno delle porte utilizzando una pinza fine, ad eccezione di una porta di ingresso.Utilizzando morsetti a mascella, bloccare le due porte di uscita e il compartimento del tessuto insieme. Diluire la soluzione madre di fibronectina a 100 microgrammi per millilitro con PBS. Caricare una siringa da un millilitro collegata a un ago smussato calibro 24 con la soluzione di fibronectina diluita e collegare la siringa a un tubo lungo quattro pollici.Inserire il tubo nella porta di ingresso aperta, quindi spingere lo stantuffo fino a quando la fibronectina umana non viene rilasciata da un'altra porta di ingresso e bloccarla. Ripetere il processo per le porte rimanenti fino a quando tutti i canali, il compartimento tissutale e il tubo sono riempiti con la soluzione di fibronectina umana. Rimuovere l'ago ma mantenere il tubo lungo quattro pollici inserito e sbloccato.Per eseguire il degasaggio, collegare il tubo non clamorato al primer pneumatico collegato a un serbatoio di azoto compresso con una pressione di cinque libbre per pollice quadrato per 15 minuti. Al microscopio, verificare che non vi siano bolle d'aria intrappolate all'interno del canale o del compartimento tissutale e ricollegare il dispositivo se sono presenti bolle d'aria. Rimuovere il dispositivo dal primer pneumatico e incubarlo a 37 gradi Celsius per un'ora.Utilizzando terreni di coltura cellulare endoteliale microvascolare polmonare umano preriscaldati, lavare tutti i canali e il compartimento tissutale. Dopo aver raccolto le cellule endoteliali come descritto nel manoscritto di testo, pellettare le cellule mediante centrifugazione per cinque minuti a 150 volte G.In pompa a siringa programmabile, montare una siringa da un millilitro e attaccare il tubo all'ago smussato. Aspirare circa 20 microlitri della sospensione cellulare nel tubo senza lasciarlo entrare nella canna della siringa.Rimuovere il morsetto dalla porta di uscita del dispositivo. Collegare il tubo alla porta di ingresso senza introdurre alcuna bolla d'aria nel canale. Arrestare la pompa con una portata da quattro a otto microlitri al minuto e osservare al microscopio.Arrestare la pompa quando i canali sono pieni di celle. Bloccare l'uscita e tagliare il tubo di ingresso. Posizionare il dispositivo nell'incubatore per quattro ore al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius.Dopo quattro ore di incubazione, preparare un'altra siringa e riempirla con terreni di coltura cellulare freschi. Montare la siringa in una pompa a siringa e collegarla alla porta di ingresso. Rimuovere il morsetto dalla porta di uscita.Passare il supporto fresco attraverso il dispositivo per circa cinque minuti a quattro-otto microlitri al minuto per rimuovere le cellule galleggianti o non attaccate. Preparare una siringa riempiendola con terreni di coltura cellulare freschi. Montare la siringa in una pompa a siringa e collegarla a una porta di ingresso mantenendo aperta la porta di uscita.Posizionare il dispositivo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Programmare la pompa a siringa per la coltivazione di cellule endoteliali sotto flusso come descritto nel manoscritto di testo. Utilizzando un microscopio, controllare bMFA dopo 48 ore di coltura sotto flusso.La microscopia confocale ha indicato che tutte le superfici dei canali vascolari erano coperte da cellule endoteliali, formando un lume 3D completo in bMFA. Dopo aver preparato tre diversi dispositivi bMFA, caricare tre siringhe da un millilitro con terreni di coltura cellulare o TNF-alfa o TNF-alfa combinati rispettivamente con l'inibitore delta PKC, dove TNF-alfa e citochina infiammatoria viene utilizzato per stimolare le cellule endoteliali e i neutrofili. L'inibitore delta della PKC è un nuovo inibitore antinfiammatorio.Collegare le tre siringhe caricate a tre dispositivi bMFA. Utilizzando il tampone TNF-alfa o TNF-alfa con l'aggiunta di inibitori, trattare le cellule endoteliali microvascolari polmonari umane per quattro ore a 0,1 microlitri al minuto. Dopo aver isolato i neutrofili umani come descritto nel manoscritto di testo, risospese i neutrofili in 999 microlitri di tampone HEPES e aggiungere un microlitro di soluzione madre colorante CFDA SE da 10 millimolari alla sospensione, ottenendo una soluzione di lavoro a 10 micromolari di CFDA SE e incubarla per 10 minuti a temperatura ambiente.Lavare le cellule due volte con tampone HEPES centrifugando la soluzione per cinque minuti a 315 volte G.Dopo aver contato le cellule, risospendere a 2 milioni di neutrofili per millilitro in terreni di coltura cellulare o TNF-alfa o TNF-alfa aggiunti con inibitore delta PKC e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Riempire la siringa con un micromolare di un chemio-attrattivo, fMLP, preparato in terreni di coltura cellulare. Aprire una porta di ingresso e una porta di uscita del bMFA.Rimuovere il tubo della porta dal compartimento del tessuto e inserire il tubo fMLP. Iniettare circa 20 microlitri di fMLP nel compartimento tissutale per tutti i bMFA, lasciando quello trattato con terreni di coltura cellulare. Tagliare il tubo e bloccarlo.Riempire la siringa con circa 200 microlitri di sospensione per neutrofili e montare la siringa sulla pompa della siringa. Dopo aver posizionato il dispositivo su uno stadio di microscopio invertito, impostare la portata a un microlitro al minuto e avviare la pompa. Attendere che una piccola goccia della sospensione dei neutrofili esca dal tubo e inserire il tubo nella porta di ingresso.I neutrofili marcati fluorescenti fluiscono nei canali vascolari e interagiscono con le cellule endoteliali e le condizioni di flusso fisiologicamente rilevanti. Dopo 10 minuti dall'inizio dell'esperimento, aprire il software di analisi delle immagini, impostare l'obiettivo su 10x e utilizzare il joystick del palco per centrare il dispositivo al microscopio. Per ottenere la mappa di adesione, andare su Acquisisci, fare clic su Scansione immagine grande.Viene visualizzata una nuova finestra. Scegli Obiettivo 10x e imposta l'opzione campo, ad esempio 5 per 3. Fare clic su Scansione, fare clic su File e salvare la mappa di adesione.Per ottenere la mappa di migrazione per l'analisi della migrazione, centrare il dispositivo al microscopio utilizzando il joystick dello stage. Fare clic su Visualizza, Controlli acquisizione, Acquisizione ND. Viene visualizzata una nuova finestra.Impostare il percorso per salvare il file e digitare il nome del file. Controlla la funzione Immagine grande, imposta Area di scansione, ad esempio 5 per 3. Controlla la funzione Tempo, imposta l'intervallo su cinque minuti e La durata su 60 minuti.Scatta immagini time lapse del compartimento tissutale, con un'immagine scattata ogni cinque minuti durante l'ora successiva. La simulazione CFD mostra il modello di flusso laminare nei canali vascolari, ad eccezione delle aree di biforcazione in cui il modello di flusso è disturbato. Dopo aver eseguito il test biomimetico del microfluido, le immagini di contrasto di fase hanno rivelato che le superfici dei canali vascolari erano coperte da cellule endoteliali e allineate nella direzione del flusso di taglio dopo 48 ore di coltura.L'imaging a fluorescenza è stato effettuato utilizzando la microscopia confocale, indicando che le cellule endoteliali formano un lume tridimensionale completo in bMFA È stata ottenuta una mappa di adesione dei neutrofili, che ha rivelato che esiste un'adesione significativa dei neutrofili alle cellule endoteliali in bMFA. La mappa di migrazione dei neutrofili in bMFA ha rivelato che dopo l'attivazione del TNF-alfa, una notevole migrazione dei neutrofili avviene all'interno del compartimento tissutale, mentre tale migrazione non è stata osservata senza l'attivazione del TNF-alfa. Una mappa di adesione che correla la distribuzione spaziale dei neutrofili con la velocità di taglio ha dimostrato che l'adesione dei neutrofili si è verificata preferenzialmente in vasi con bassa velocità di taglio e vicino a regioni di biforcazione.Inoltre, il trattamento con TNF-alfa aumenta significativamente l'adesione, che è stata inibita con l'inibitore delta PKC. L'analisi delle immagini time lapse ha indicato che l'attivazione del TNF delle cellule endoteliali aumenta la migrazione dei neutrofili in risposta alla fMLP, mentre il trattamento con l'inibitore delta PKC ha ridotto la migrazione rispetto alle cellule trattate con TNF-alfa. Pertanto, bMFA può essere utilizzato per testare l'efficacia di una nuova terapia per il trattamento della malattia infiammatoria.Il bMFA può anche essere utilizzato per studiare l'integrità dell'endotelio misurando variabili come la permeabilità e la resistenza elettrica trans-endoteliale, ciò che viene chiamato TEER e l'espressione della molecola di adesione durante l'infiammazione. Il test microfluidico biomimetico può imitare il microambiente di diversi organi e non è limitato a singoli tipi di cellule o specie, e può anche modellare la comunicazione cellula / cellula fondamentale per la funzione degli organi e modellare diverse malattie.

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