Name: a microphysiological system to study leukocyte-endothelial cell interaction during inflammation
Uploaded: 2021-12-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health, Grant Number: GM114359 og GM134701 (M.F.K. og L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), og Defense Threat Reduction Agency, Grant Number: HDTRA11910012 (M.F.K. og L.E.K.).

Heparinisert humant blod er oppnådd for nøytrofil isolasjon fra friske voksne donorer (menn og kvinner, i alderen 21 til 60 år), etter informert samtykke som godkjent av Institutional Review Board of Temple University (Philadelphia, PA, USA).
1. Priming og belegg enheten med menneskelig fibronectin
MERK: bMFA har to innløpsporter og to uttaksporter koblet til det vaskulære rommet. Den har også en port koblet til vevskammeret (<strong class="xfig...

<ol>
	<li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+approaches+to+understanding+microvascular+endothelial+heterogeneity:+A+roadmap+for+developing+anti-inflammatory+therapeutics.">Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).</li><li>Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+responses+in+sepsis.">Endothelial responses in sepsis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).</li><li>Ince, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelium+in+sepsis.">The endothelium in sepsis.</a> Shock. 45, 259-270 (2016).</li><li>Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+processes+in+cardiovascular+disease:+a+route+to+targeted+therapies.">Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).</li><li>Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+approaches+to+evaluate+leukocyte-endothelial+cell+interactions+in+sepsis+and+inflammation.">Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation.</a> Shock. 53, 585-595 (2020).</li><li>Langer, H. F., Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+interactions+in+inflammation.">Leukocyte-endothelial interactions in inflammation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).</li><li>Sadik, C. D., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-cytokine-chemokine+cascades+orchestrate+leukocyte+recruitment+in+inflammation.">Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).</li><li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neutrophil+in+vascular+inflammation.">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).</li><li>Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelium+in+acute+lung+injury/acute+respiratory+distress+syndrome.">The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome.</a> Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).</li><li>Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+leukocyte-tissue+interactions.">Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions.</a> Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).</li><li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+shear+stress+on+endothelial+cells:+go+with+the+flow.">Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow.</a> Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).</li><li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. -. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature.">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).</li><li>Zou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSGL-1+derived+from+human+neutrophils+is+a+high-efficiency+ligand+for+endothelium-expressed+E-selectin+under+flow.">PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).</li><li>Lamberti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+microfluidic+assay+for+in+vitro+modeling+of+leukocyte-endothelium+interactions.">Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions.</a> Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).</li><li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microvascular+networks+for+quantitative+analysis+of+particle+adhesion.">Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion.</a> Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).</li><li>Soroush, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microfluidic+assay+reveals+a+key+role+for+protein+kinase+C+delta+in+regulating+human+neutrophil-endothelium+interaction.">A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).</li><li>Roth, N. M., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;geographic+information+systems&amp;#34;+based+technique+for+the+study+of+microvascular+networks.">A &amp;#34;geographic information systems&amp;#34; based technique for the study of microvascular networks.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).</li><li>Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifurcations:+Focal+points+of+particle+adhesion+in+microvascular+networks.">Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks.</a> Microcirculation. 18, 380-389 (2011).</li><li>Rosano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiologically+realistic+in+vitro+model+of+microvascular+networks.">A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).</li><li>Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+adhesion+of+leukocytes+near+bifurcations+is+endothelium+independent.">Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent.</a> Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).</li><li>Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+and+neutrophil+isolation+and+migration+assays.">Monocyte and neutrophil isolation and migration assays.</a> Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).</li><li>Entschladen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+methods+of+human+cell+migration.">Analysis methods of human cell migration.</a> Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).</li><li>Chen, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.+Methods+in+Molecular+Biology.">Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology.</a> Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , (2005).</li><li>Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+dynamic+neonatal+blood-brain+barrier+on+a+chip.">A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip.</a> PloS one. 10, 142725 (2015).</li><li>Soroush, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-endothelial+interactions+of+murine+cells+is+not+a+good+predictor+of+their+interactions+in+human+cells.">Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells.</a> The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).</li><li>Soroush, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C-Delta+(PKC&#948;)+tyrosine+phosphorylation+is+a+critical+regulator+of+neutrophil-endothelial+cell+interaction+in+inflammation.">Protein Kinase C-Delta (PKC&#948;) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation.</a> Shock. 51 (5), 538-547 (2019).</li><li>Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#948;+inhibition+as+a+novel+medical+countermeasure+for+radiation-induced+vascular+damage.">PKC&#948; inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage.</a> The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).</li><li>Pradhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microvascularized+tumor-mimetic+platform+for+assessing+anti-cancer+drug+efficacy.">A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).</li><li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomimetic+microfluidic+tumor+microenvironment+platform+mimicking+the+EPR+effect+for+rapid+screening+of+drug+delivery+systems.">A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-delta+inhibition+protects+blood-brain+barrier+from+sepsis-induced+vascular+damage.">Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).</li><li>Mondrinos, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+endothelial+protein+kinase+C-delta+(PKCd)+regulates+neutrophil+migration+in+acute+lung+inflammation.">Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation.</a> The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).</li><li>Kilpatrick, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+sepsis-induced+lung+injury+by+selective+inhibition+of+protein+kinase+C-d+(d-PKC).">Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC).</a> Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).</li><li>Mondrinos, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+and+efficacy+of+targeted+pulmonary+delivery+of+a+protein+kinase+C-d+inhibitory+peptide:+Impact+on+Indirect+lung+Injury.">Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).</li><li>Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+protein+kinase+C-delta+in+regulating+platelet+activation+and+platelet-leukocyte+interaction+during+sepsis.">Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis.</a> PloS one. 13, 0195379 (2018).</li><li>Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+shear+adhesion+map+using+SynVivo+synthetic+microvascular+networks.">Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).</li></ol>

bMFA reproduserer topografien og strømningsforholdene til in vivo-mikrovaskulære nettverk og kan brukes til å studere leukocyte-endotelial celleinteraksjon og endotelfunksjon in vitro under fysiologisk realistiske forhold. I mikrovaskulaturen til enten mus eller menneske er geometrien til de mikrovaskulære nettverkene selvliknende og fraktal, og Reynolds-nummeret << 1, noe som indikerer at vaskulær geometri ikke påvirker strømningsmønstrene betydelig. Derfor kan bFMA brukes til å studere leukoc...

Betennelse er vertsresponsen på infeksjon og skade, og endotelet spiller en viktig rolle i den inflammatoriske responsen 1,2,3. Inflammatorisk dysregulering er den underliggende årsaken til en rekke sykdomspatologier som sepsis, kardiovaskulære sykdommer, astma, inflammatorisk tarmsykdom, kreft og COVID-19. Leukocytt-endotelcelleinteraksjoner spiller en sentral rolle i disse inflammatoriske sykdommene. Under betennelse aktiverer frigjøringen av PAMPS (patogen-assosierte molekylære mønstre) fra patogener eller DAMPS (skaderelaterte molekylære mønstre) fra skadede vev immunceller for å frigjøre cytokiner/kjemokiner og andre proinflammatoriske mediatorer som fører til aktivering av endotel, noe som resulterer i endringer i vaskulær endotelbarrierefunksjon og økt permeabilitet 3,4 . Økt aktivering av endotelceller under betennelse resulterer i forbedret leukocytt-endotelial celleinteraksjon som fører til overdreven migrering av aktiverte leukocytter over det vaskulære endotelet i nøkkelorganer 1,5,6,7.
Rekrutteringen av leukocytter er initiert av kjemisk mangfoldige kjemoattractants sammensatt av bioaktive lipider, cytokiner, kjemokiner og komplementkomponenter 8,9. Leukocyttrekruttering er en flertrinnsprosess som inkluderer fem diskrete trinn: 1) leukocyttmarginering og fangst/vedlegg, 2) rullende, 3) fast arrestasjon, 4) spredning og kryping og 5) ekstravasasjon/migrasjon (figur 1). Hvert trinn i denne prosessen krever krysstale mellom leukocytter og endotelceller for å orkestrere dette dynamiske fenomenet 1,9. Til syvende og sist, arrestert leukocytter ekstravasat til betent vev over endotel via en flertrinnsprosess kontrollert av samtidige kjemoattractant-avhengige signaler, lim hendelser og hemodynamisk skjær tvinger 1,9,10,11,12.
Gitt den sentrale rollen av skjærspenning i regulering av endotelcellefunksjon og betydningen av leukocyte-endotelcelleinteraksjonene13, har flere in vitro-modeller blitt utviklet i løpet av de siste tiårene for å studere ulike aspekter av leukocyttmigrasjonskaskaden i et mer kontrollert miljø14. Tradisjonelle fluidiske enheter for å studere leukocytt-endotelcelleinteraksjoner kan klassifiseres i to brede kategorier14: a) enheter for å studere leukocyttrulling, vedheft og vedheft molekyluttrykk som parallelle platestrømningskamre og b) enheter for å studere leukocyttmigrasjon under statiske forhold som transwellkamre. Systemer som parallelle platestrømningskamre har blitt brukt til å studere rollene til vedheftsmolekyler og deres ligander i vedheftkaskaden under skjærkrefter15. En betydelig ulempe er imidlertid at disse forenklede, idealiserte enhetene (f.eks. rett kanal) ikke er i stand til å reprodusere skalaen og geometrien til in vivo-mikrovaskulaturen (f.eks. påfølgende vaskulære bifurkasjoner, vaskulær morfologi) og de resulterende strømningsforholdene (f.eks. konvergerende eller avvikende strømmer ved bifurkasjoner). Som et resultat kan disse enhetene bare modellere vedheft, men ikke transmigrasjon. Transwell kamre kan bare studere transmigrasjon under statiske forhold uten å vurdere in vivo geometriske egenskaper og strømningsforhold. Dermed etterligner disse tradisjonelle modellene ikke mikromiljøet av levende vev eller løser vedheft og migrasjon kaskade i en enkelt analyse6.
For å løse denne begrensningen har vi utviklet og i stor grad validert en ny 3D biomimetisk mikrofluidisk analyse (bMFA) (figur 2), som realistisk reproduserer in vivo-mikrovaskulære nettverk på enchip 16,17,18. Protokollen for mikrofabrikasjon av denne enheten har blitt publisert tidligere17 og er bare kort beskrevet her. Mikrovasculature av mus cremaster muskelen ble digitalisert ved hjelp av en modifisert Geographic Information System (GIS) tilnærming19. Deretter ble det syntetiske mikrovaskulære nettverket generert på polydimetylsiloksan (PDMS) ved hjelp av myke litografiprosesser basert på det digitaliserte mikrovaskulære nettverket 14,17,20,21,22. Kort fortalt ble de digitaliserte nettverksbildene trykt på Mylar-filmen, som deretter ble brukt som en maske for å mønstre en SU-8 positiv fotoresist på toppen av en silisiumskive for å lage mesterne for fabrikasjon. Mikrofabricated søyler (10 μm diameter, 3 μm høy) ble brukt til å skape 3 μm høy og 100 μm brede porer, en optimal størrelse for leukocytt migrasjon 23,24,25, forbinder vaskulære kanaler og vevsrom. PDMS ble utarbeidet i henhold til produsentens instruksjoner og helles over de utviklede mesterne. Videre ble PDMS avgasset og fikk lov til å kurere over natten i en ovn (65 °C) for å lage komplementære mikrokanaler i PDMS. Deretter ble den herdede PDMS skrelt fra SU-8-mesteren, etterfulgt av stanseporter for innløp/uttak. Deretter ble PMDS plasma bundet til et glasssklie. Overflaten på den mikrofluidiske enheten består av innfødt glass og PDMS. For å fremme celletilknytning, spredning og spredning, er det nødvendig med ekstracelluarmatrise (ECM) belegg. bMFA inkluderer et mikrovaskulært nettverk og et vevsrom koblet via 3 μm høye og 100 μm brede porer (figur 2). Dette mikrofluidiske systemet reproduserer hele leukocyttadhesjons-/migrasjonskaskaden i et fysiologisk relevant 3D-miljø i et komplett mikrovaskulært nettverk med sammenkoblede kar og bifurkasjoner, inkludert sirkulasjon, marginering, rulling, vedheft og migrasjon av leukocytter inn i det ekstra vaskulære vevsrommet i et enkelt system 14,16,17,21,21,21,21,6 
Det skal bemerkes at selv når strømningshastigheten ved innløpet til bMFA er løst, varierer strømningsforholdene i nettverket på forskjellige steder og kan ikke beregnes med en enkel matematisk formel. En beregningsvæskedynamikk (CFD)-basert modell ble utviklet for å beregne forskjellige strømningsparametere (f.eks. skjærspenning, skjærhastighet, hastighet) på forskjellige steder i nettverket. Denne CFD-modellen ble brukt til å simulere fargestoffperfusjonsmønstre og strømningsparametere i bMFA. Kryssvalidering med eksperimentelle resultater antydet at strømningsmotstandene over nettverket er godt spådd av beregningsmodellen (figur 3)17. Denne CFD-modellen ble deretter brukt til å estimere hastighets- og skjærhastighetsprofil i hvert fartøy av bMFA (figur 4), noe som muliggjør analyse av effektene av skjærstrøm og geometri på leukocyttrulling, vedheft og migrasjon16. Leukocytter holder seg fortrinnsvis nær bifurkasjoner og i lave skjærregioner in vivo, og disse romlige mønstrene for leukocyttadhesjon ble vellykket demonstrert i bMFA ved hjelp av nøytrofiler (figur 5)16. Dette dokumentet beskriver protokollen for å forberede bMFA til å studere leukocytt-endotelial celleinteraksjon under inflammatoriske forhold ved hjelp av humane lungemikrovaskulære endotelceller (HLMVEC) og humane nøytrofiler. Mikrofysiologiske systemer, som bMFA, kan brukes til å studere endotelcelleinteraksjoner med forskjellige typer celler som nøytrofiler, monocytter, lymfocytter og tumorceller 18,27,28,29,30. bMFA kan frøs med primære endotelceller fra forskjellige organer (f.eks. lunge vs. hjerne) og forskjellige arter (f.eks. humane vs. murine endotelceller), samt endotelcellelinjer 21,27,31,32. bMFA kan brukes til å studere flere cellulære responser, cellecelleinteraksjoner, barrierefunksjon, legemiddellevering og legemiddeltoksisitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomimetic microfluidic assay (bMFA)</td>
			<td>SynVivo</td>
			<td>SMN1-C001</td>
			<td>Exclusive at SynVivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG24-0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C70-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFDA, SE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, 250,000, Powder</td>
			<td>Spectrum Chemical Mfg. Corp</td>
			<td>DE-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Premium</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>17-5442-02</td>
			<td>Leukocyte isolation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fMLP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1692630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>33-016-015</td>
			<td>use vendor recommended ECM for different cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3202</td>
			<td>Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lung microvascular endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-2527</td>
			<td>use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-elements, 5.20.01</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhD Ultra Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3007</td>
			<td>Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-003-763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide clamp</td>
			<td>SynVivo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S640-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synvivo Pneumatic Primer</td>
			<td>SynVivo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-5034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-206-8921</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microphysiological system to study leukocyte-endothelial cell interaction during inflammation

Leukocytt-endoteliale celleinteraksjoner spiller en viktig rolle i inflammatoriske sykdommer som sepsis. Under betennelse kan overdreven migrering av aktiverte leukocytter over det vaskulære endotelet i nøkkelorganer føre til organsvikt. En fysiologisk relevant biomimetisk mikrofluidisk analyse (bMFA) er utviklet og validert ved hjelp av flere eksperimentelle og beregningsteknikker, som kan reprodusere hele leukocyttrullingen/adhesjonen/migrasjonskaskaden for å studere leukocytt-endotelcelleinteraksjoner. Mikrovaskulære nettverk hentet fra in vivo-bilder hos gnagere ble digitalisert ved hjelp av en Geographic Information System (GIS) tilnærming og mikrofabricated med polydimetylsiloksan (PDMS) på et mikroskop lysbilde. For å studere effekten av skjærhastighet og vaskulær topologi på leukocyte-endoteliale celleinteraksjoner, ble en COMputational Fluid Dynamics (CFD) -modell utviklet for å generere et tilsvarende kart over skjærhastigheter og hastigheter i hele nettverket. bMFA muliggjør kvantifisering av leukocytt-endoteliale celler interaksjoner, inkludert rullehastighet, antall tilhørende leukocytter som svar på forskjellige skjærhastigheter, antall migrerte leukocytter, endotelcellepermeabilitet, adhesjonsmolekyluttrykk og andre viktige variabler. Videre, ved å bruke menneskerelaterte prøver, for eksempel humane endotelceller og leukocytter, gir bMFA et verktøy for rask screening av potensielle terapeutiske behandlinger for å øke deres kliniske overførbarhet.

Etter 48 timers kultur under skjærstrøm i bMFA dekket endotelceller overflaten av de vaskulære kanalene i bMFA og justert i strømningsretningen (figur 6). Konfokal mikroskopi indikerte at alle overflater av de vaskulære kanalene var dekket av endotelceller, og dannet en komplett 3D lumen i bMFA18.
Ved hjelp av denne protokollen kan et nøytrofiladhesjonskart anskaffes, noe som viser at det er betydelig vedheft av nøytrofiler til endot...

Watch this Scientific Journal Video about A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation at JoVE.com

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

I denne protokollen brukes en biomimetisk mikrofluidanalyse, som kan reprodusere et fysiologisk relevant mikrovaskulært miljø og reprodusere hele leukocyttadhesjons-/migrasjonskaskaden, til å studere leukocytt-endoteliale celleinteraksjoner ved inflammatorisk sykdom.

Et mikrofysiologisk system for å studere leukocytt-endotelial celleinteraksjon under betennelse

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

Leukocytt-endoteliale celleinteraksjoner spiller en viktig rolle i inflammatoriske sykdommer som sepsis. Betennelsesdysregulering forårsaker ofte endret vaskulær endotelbarrierefunksjon og overdreven leukocytthandel, noe som kan føre til organskade. Den biomimetiske mikrofluidiske analysen, det vi kaller bMFA, reproduserer topografi og strømningsforhold for in-vivo mikrovaskulære nettverk og muliggjør sanntidsvurdering av rullende, fast vedheft, spredning og migrering av nøytrofiler inn i vevsrommet.En styrke ved den biomimetiske mikrofluidiske analysen er evnen til å bruke primære menneskelige celler og klinisk relevante pasientprøver for å øke klinisk oversettelse og raskt screene potensielle terapeutiske behandlinger. Å demonstrere prosedyrene vil være Mr.Qingliang Yang, en vitenskapelig assistent fra laboratoriet mitt. Begynn å sette inn røret på rundt en tomme i lengden i portene ved hjelp av fine tang, bortsett fra en innløpsport.Bruk kjeveklemmer til å klemme de to utløpsportene og vevsrommet sammen. Fortynn fibronectin lagerløsningen til 100 mikrogram per milliliter med PBS. Legg en sprøyte med én milliliter koblet til en 24-gauge stump nål med den fortynnede fibronektinoppløsningen og koble sprøyten til en fire tommer lang slange.Sett slangen inn i den åpne innløpsporten, og skyv deretter stempelet til human fibronectin slippes ut fra en annen innløpsport og klemmer den. Gjenta prosessen for de resterende portene til alle kanaler, vevsrom og rør er fylt med den menneskelige fibronectin-løsningen. Fjern nålen, men hold den fire tommers lange slangen satt inn og ulamped.For å utføre avgassing, koble den ulampede slangen til den pneumatiske primeren som er koblet til en komprimert nitrogentank med et trykk på fem pund per kvadrattomme i 15 minutter. Under mikroskopet må du kontrollere at det ikke er noen luftbobler fanget i kanalen eller vevskammeret og koble til enheten igjen hvis luftboblene er til stede. Fjern enheten fra den pneumatiske primeren og inkuber den ved 37 grader Celsius i en time.Bruk forvarmet human lungemikrovaskulære endotelale cellekulturmedier, skyll alle kanaler og vevsrom. Etter høsting av endotelcellene som beskrevet i tekstmanuskriptet, pellet cellene ved sentrifugering i fem minutter ved 150 ganger G.In den programmerbare sprøytepumpen, monter en sprøyte med en milliliter og fest slangen til den stumpe nålen. Trekk omtrent 20 mikroliter av cellefjæringen inn i slangen uten å slippe den inn i sprøytefatet.Fjern klemmen fra utløpsporten på enheten. Koble slangen til innløpsporten uten å introdusere noen luftboble i kanalen. Stopp pumpen med en strømningshastighet på fire til åtte mikroliter per minutt og observer under mikroskopet.Stopp pumpen når kanalene er fylt med celler. Klem utløpet og kutt innløpsslangen. Plasser enheten i inkubatoren i fire timer ved 5% karbondioksid og 37 grader Celsius.Etter fire timer med inkubasjon, lag en ny sprøyte og fyll den med friske cellekulturmedier. Monter sprøyten i en sprøytepumpe og koble den til innløpsporten. Fjern klemmen fra utløpsporten.Før det ferske mediet gjennom enheten i omtrent fem minutter på fire til åtte mikroliter per minutt for å fjerne de flytende eller uattrliggende cellene. Forbered en sprøyte ved å fylle den med friske cellekulturmedier. Monter sprøyten i en sprøytepumpe og koble den til én innløpsport samtidig som utløpsporten holdes åpen.Plasser enheten i en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Programmer sprøytepumpen for å dyrke endotelceller under strømning som beskrevet i tekstmanuskriptet. Bruk et mikroskop, sjekk bMFA etter 48 timer med kultur under strømning.Konfokal mikroskopi indikerte at alle overflater av de vaskulære kanalene var dekket av endotelceller, og dannet en komplett 3D-lumen i bMFA. Etter å ha forberedt tre forskjellige bMFA-enheter, last tre en milliliter sprøyter med cellekulturmedier eller TNF-alfa eller TNF-alfa kombinert med henholdsvis PKC deltahemmer, hvor TNF-alfa og inflammatorisk cytokin brukes til å stimulere endotelceller og nøytrofiler. PKC deltahemmer er en ny antiinflammatorisk hemmer.Koble de tre innlastede sprøytene til tre bMFA-enheter. Bruk buffer TNF-alfa eller TNF-alfa med ekstra hemmer, behandle humane lungemikrovaskulære endotelceller i fire timer ved 0,1 mikroliter per minutt. Etter å ha isolert de menneskelige nøytrofiler som beskrevet i tekstmanuskriptet, resuspend nøytrofiler i 999 mikroliter av HEPES buffer og legge til en mikroliter av 10-millimolar CFDA SE fargestoff løsning til suspensjonen, noe som resulterer i en 10-mikromolar arbeidsløsning av CFDA SE og inkubere den i 10 minutter ved romtemperatur.Vask cellene to ganger med HEPES-buffer ved å sentrifugere løsningen i fem minutter ved 315 ganger G.Etter å ha talt cellene, resuspend ved 2 millioner nøytrofiler per milliliter i cellekulturmedier eller TNF-alfa eller TNF-alfa tilsatt med PKC deltahemmer og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter. Fyll sprøyten med en mikromolar av en kjemo-tiltrekkende, fMLP, tilberedt i cellekulturmedier. Åpne ett innløp og én uttaksport på bMFA.Fjern portslangen fra vevsrommet og sett inn fMLP-slangen. Injiser ca. 20 mikroliter fMLP i vevsrommet for alle bMFA, slik at den behandles med cellekulturmedier. Klipp slangen og klem den fast.Gjenta sprøyten med ca. 200 mikroliter nøytrofil suspensjon og monter sprøyten på sprøytepumpen. Etter å ha plassert enheten på et invertert mikroskopstadium, sett strømningshastigheten på en mikroliter per minutt og start pumpen. Vent til en liten dråpe av nøytrofilfjæringen kommer ut av slangen og sett slangen inn i innløpsporten.Fluorescerende merkede nøytrofiler strømmer inn i de vaskulære kanalene og samhandler med endotelceller og de fysiologisk relevante strømningsforholdene. Etter 10 minutter fra du starter eksperimentet, åpner du bildeanalyseprogramvaren, bytter objektivlinsen til 10x og bruker trinn joystick til å midtstille enheten under mikroskopet. Hvis du vil hente adhesjonskartet, går du til Hent, klikker Skann stort bilde.Et nytt vindu dukker opp. Velg 10x objektiv og angi feltalternativet, for eksempel 5 x 3. Klikk Skann, klikk Fil, og lagre vedheftskartet.Hvis du vil hente overføringstilordningen for overføringsanalyse, midtstiller du enheten under mikroskopet ved hjelp av styrespaken for scenen. Klikk på Vis, Anskaffelseskontroller, Anskaffelse av ND. Et nytt vindu dukker opp.Angi banen for å lagre filen og skrive inn filnavnet. Kontroller funksjonen Stort bilde, angi Skanneområde, for eksempel 5 x 3. Kontroller Tid-funksjonen, angi Intervall som fem minutter og Varighet som 60 minutter.Ta tidsforløpbilder av vevsrommet, med ett bilde tatt hvert femte minutt i løpet av den neste timen. CFD-simulering viser laminært strømningsmønster i vaskulære kanaler, bortsett fra bifurkasjonsområder der strømningsmønsteret forstyrres. Etter å ha utført den biomimetiske mikrofluidanalysen, viste fasekontrastbilder at overflatene på de vaskulære kanalene var dekket med endotelceller, og justert i retning av skjærstrøm etter 48 timers kultur.Fluorescensavbildning ble utført ved hjelp av konfokal mikroskopi, noe som indikerer at endotelcellene danner en komplett tredimensjonal lumen i bMFA Et nøytrofiladhesjonskart ble oppnådd, noe som avslørte at det er betydelig vedheft av nøytrofiler til endotelceller i bMFA. Neutrophil migrasjonskart i bMFA avslørte at ved TNF-alfaaktivering skjer betydelig migrering av nøytrofiler inne i vevsrommet, mens ingen slik migrasjon ble observert uten TNF-alfaaktivering. Et adhesjonskart som korrelerer den romlige fordelingen av nøytrofiler med skjærhastigheten, viste at nøytrofiladhesjon foregikk fortrinnsvis i fartøy med lav skjærhastighet og nær bifurkasjonsregioner.Videre øker TNF-alfa-behandlingen signifikant vedheft, som ble hemmet med PKC-deltahemmeren. Analyse av tidsforløpbilder indikerte at TNF-aktivering av endotelceller øker nøytrofil migrasjon som svar på fMLP, mens behandling med PKC deltahemmer reduserte migreringen sammenlignet med TNF-alfabehandlede celler. Dermed kan bMFA brukes til å teste effekten av en ny terapeutisk for behandling av inflammatorisk sykdom.bMFA kan også brukes til å studere endotelintegriteten ved å måle variabler som permeabilitet og trans-endotelial elektrisk motstand, det som kalles TEER, og adhesjonsmolekyluttrykk under betennelse. Den biomimetiske mikrofluidiske analysen kan etterligne mikromiljøet i forskjellige organer og er ikke begrenset til enkeltcelletyper eller arter, og kan også modellere celle/cellekommunikasjon som er kritisk for organfunksjon og modellering av ulike sykdommer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Bygging av en lav-budsjett Laser Axotomy System til Study Axon Regeneration i C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Et eksperimentelt system for å studere Mechanotransduction i Fetal lungeceller

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Microfabrication av nanoporøse Gold Patterns for Cell-materielle Interaksjonsstudier

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Vurdere Leukocytt-endotelial Interaksjoner Under strømningsforholdene i en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Chamber analysen

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Konsentriske Gel System for å studere den Biofysikalsk rolle Matrix mikromiljøet på 3D-Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Live-Cell Imaging under Mekanisk Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Bygging av Definert menneske Engineered Hjerte Vev å studere mekanismer Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

En mikrofluidsystem med Surface Mønstring for Gransker Kavitasjon Bubble (e)-celle Samhandling og den resulterende bioeffekter på Single-cellenivå

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

DNA nanorør som et allsidig verktøy for å studere Semiflexible polymerer

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...