Name: a microphysiological system to study leukocyte-endothelial cell interaction during inflammation
Uploaded: 2021-12-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, Número de Subvenção: GM114359 e GM134701 (M.F.K. e L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), e Agência de Redução de Ameaças de Defesa, Número de Subvenção: HDTRA11910012 (M.F.K. e L.E.K.).

O sangue humano heparinizado é obtido para isolamento de neutrófilos de doadores adultos saudáveis (homens e mulheres, com idade entre 21 e 60 anos), seguindo o consentimento informado, conforme aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Temple University (Filadélfia, PA, EUA).
1. Priming e revestimento do dispositivo com fibronectina humana
NOTA: O bMFA possui duas portas de entrada e duas portas de saída conectadas ao compartimento vas...

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	<li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. 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F., Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+interactions+in+inflammation.">Leukocyte-endothelial interactions in inflammation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).</li><li>Sadik, C. D., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-cytokine-chemokine+cascades+orchestrate+leukocyte+recruitment+in+inflammation.">Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).</li><li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neutrophil+in+vascular+inflammation.">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).</li><li>Maniatis, N. A., Orfanos, S. 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F., Prabhakarpandian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+adhesion+of+leukocytes+near+bifurcations+is+endothelium+independent.">Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent.</a> Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).</li><li>Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+and+neutrophil+isolation+and+migration+assays.">Monocyte and neutrophil isolation and migration assays.</a> Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).</li><li>Entschladen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+methods+of+human+cell+migration.">Analysis methods of human cell migration.</a> Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).</li><li>Chen, H. -. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+endothelial+protein+kinase+C-delta+(PKCd)+regulates+neutrophil+migration+in+acute+lung+inflammation.">Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation.</a> The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).</li><li>Kilpatrick, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+sepsis-induced+lung+injury+by+selective+inhibition+of+protein+kinase+C-d+(d-PKC).">Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC).</a> Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).</li><li>Mondrinos, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+and+efficacy+of+targeted+pulmonary+delivery+of+a+protein+kinase+C-d+inhibitory+peptide:+Impact+on+Indirect+lung+Injury.">Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).</li><li>Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+protein+kinase+C-delta+in+regulating+platelet+activation+and+platelet-leukocyte+interaction+during+sepsis.">Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis.</a> PloS one. 13, 0195379 (2018).</li><li>Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+shear+adhesion+map+using+SynVivo+synthetic+microvascular+networks.">Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).</li></ol>

O bMFA reproduz as condições de topografia e fluxo das redes microvasculares in vivo e pode ser usado para estudar a interação celular leucócito-endotelial e a função endotelial in vitro em condições fisiologicamente realistas. Na microvasculatura de camundongos ou humanos, a geometria das redes microvasculares são auto-similares e fractais, e o número reynolds << 1, indicando que a geometria vascular não afeta significativamente os padrões de fluxo. Portanto, o bFMA pode ser usado para est...

A inflamação é a resposta do hospedeiro à infecção e lesão, e o endotélio desempenha um papel importante na resposta inflamatória 1,2,3. A desregulação inflamatória é a causa básica de uma série de patologias da doença, como sepse, doenças cardiovasculares, asma, doença inflamatória intestinal, câncer e COVID-19. As interações leucócito-endotelial desempenham um papel central nessas doenças inflamatórias. Durante a inflamação, a liberação de PAMPS (padrões moleculares associados ao patógeno) de patógenos ou DAMPS (padrões moleculares associados a danos) de tecidos feridos ativam células imunes para liberar citocinas/quimiocinas e outros mediadores proinflamatórios que levam à ativação do endotélio, resultando em alterações na função de barreira de endotélio vascular e aumento da permeabilidade 3,4 . O aumento da ativação das células endoteliais durante a inflamação resulta em uma interação leucócito-endotelial aprimorada levando à migração excessiva de leucócitos ativados através do endotélio vascular em órgãos-chave 1,5,6,7.
O recrutamento de leucócitos é iniciado por quimioattractants quimicamente diversos compostos por lipídios bioativos, citocinas, quimiocinas e componentes complementares 8,9. O recrutamento de leucócitos é um processo de várias etapas que inclui cinco passos discretos: 1) margem leucócito e captura/apego, 2) rolamento, 3) prisão firme, 4) espalhamento e rastreamento e 5) extravasão/migração (Figura 1). Cada etapa desse processo requer conversa cruzada entre leucócitos e células endoteliais para orquestrar esse fenômeno dinâmico 1,9. Em última análise, leucócitos presos extravasam para tecidos inflamados através de endotélio através de um processo de várias etapas controlado por sinais quimiócitos, eventos adesivos e hemodinâmicas de tesoura 1,9,10,11,12.
Dado o papel central do estresse da cisalhamento na regulação da função celular endotelial e o significado das interações células leucócito-endotélio13, vários modelos in vitro foram desenvolvidos durante as últimas décadas para estudar vários aspectos da cascata de migração leucócito em um ambiente mais controlado14. Dispositivos fluidos tradicionais para estudar interações células leucócitos-endoteliais podem ser classificados em duas grandes categorias14: a) dispositivos para estudar a expressão de moléculas de rolamento, adesão e adesão de leucócitos, como câmaras de fluxo de placas paralelas e b) dispositivos para estudar a migração de leucócitos em condições estáticas, como câmaras transwell. Sistemas como câmaras de fluxo de placas paralelas têm sido usados para estudar os papéis das moléculas de adesão e seus ligantes na cascata de aderência sob as forçasde cisalhamento 15. No entanto, uma desvantagem significativa é que esses dispositivos simplistas e idealizados (por exemplo, canal reto) não são capazes de reproduzir a escala e a geometria da microvasculatura in vivo (por exemplo, bifurcações vasculares sucessivas, morfologia vascular) e as condições de fluxo resultantes (por exemplo, fluxos convergentes ou divergentes em bifurcações). Como resultado, esses dispositivos só podem modelar a adesão, mas não a transmigração. As câmaras transwell só podem estudar a transmigração em condições estáticas sem considerar as características geométricas in vivo e as condições de fluxo. Assim, esses modelos tradicionais não imitam o microambiente dos tecidos vivos nem resolvem a adesão e a cascata migratória em um único ensaio6.
Para lidar com essa limitação, desenvolvemos e validamos extensivamente um novo ensaio microfluido biomimetético 3D (bMFA) (Figura 2), que reproduz realisticamente redes microvasculares in vivo em um chip 16,17,18. O protocolo de microfabricção deste dispositivo foi publicado anteriormente17 e é apenas brevemente descrito aqui. A microvasculatura do músculo cremaster do rato foi digitalizada usando uma abordagem modificada do Geographic Information System (GIS)19. Em seguida, a rede microvascular sintética foi gerada em polidimtilsiloxano (PDMS) utilizando processos de litografia suave com base na rede microvascular digitalizada 14,17,20,21,22. Resumidamente, as imagens digitalizadas da rede foram impressas no filme Mylar, que foi então usado como uma máscara para padronizar um fotoresist positivo SU-8 em cima de um wafer de silício para criar os mestres para fabricação. Pilares microfabricados (10 μm de diâmetro, 3 μm de altura) foram utilizados para criar os poros de 3 μm de altura e 100 μm de largura, um tamanho ideal para a migração de leucócitos 23,24,25, conectando os canais vasculares e compartimentos teciduais. O PDMS foi preparado de acordo com as instruções do fabricante e derramado sobre os mestres desenvolvidos. Além disso, o PDMS foi desgaseado e autorizado a curar durante a noite em um forno (65 °C) para criar microcanais complementares em PDMS. Posteriormente, o PDMS curado foi descascado do mestre SU-8, seguido de portas perfuradoras para entradas/tomadas. Então, o PMDS foi ligado a um deslizamento de vidro. A superfície do dispositivo microfluido compreende vidro nativo e PDMS. Para promover o apego da célula, a disseminação e a proliferação, é necessário o revestimento da matriz extraceluar (ECM). O bMFA inclui uma rede microvascular e um compartimento de tecido conectado através de poros de 3 μm de altura e 100 μm de largura (Figura 2). Este sistema microfluido reproduz toda a cascata de adesão/migração leucócito em um ambiente 3D fisiologicamente relevante de uma rede microvascular completa com vasos interligados e bifurcações, incluindo circulação, margem, rolamento, adesão e migração de leucócitos para o compartimento vascular extra-tecido em um único sistema 14,16,17,21,26.
Deve-se notar que mesmo quando a taxa de fluxo na entrada de bMFA é fixada, as condições de fluxo na rede variam em diferentes locais e não podem ser calculadas por uma fórmula matemática simples. Um modelo baseado em dinâmica de fluidos computacionais (CFD) foi desenvolvido para calcular diferentes parâmetros de fluxo (por exemplo, estresse de cisalhamento, taxa de cisalhamento, velocidade) em diferentes locais da rede. Este modelo cfd foi utilizado para simular os padrões de perfusão de corante e parâmetros de fluxo no bMFA. A validação cruzada com resultados experimentais sugeriu que as resistências de fluxo em toda a rede são bem previstas pelo modelo computacional (Figura 3)17. Este modelo de CFD foi então utilizado para estimar o perfil de velocidade e taxa de cisalhamento em cada vaso de bMFA (Figura 4), permitindo a análise dos efeitos do fluxo de cisalhamento e geometria sobre rolamento de leucócitos, adesão e migração16. Leucócitos preferencialmente aderem perto de bifurcações e em regiões de baixa tesoura in vivo, e esses padrões espaciais de adesão leucócito foram demonstrados com sucesso na BMFA usando neutrófilos (Figura 5)16. Este artigo descreve o protocolo de preparação da BMFA para estudar a interação leucócito-endotelial sob condições inflamatórias usando células endoteliais pulmonares humanas (HLMVEC) e neutrófilos humanos. Sistemas microfisiológicos, como o bMFA, podem ser usados para estudar interações celulares endoteliais com diferentes tipos de células, como neutrófilos, monócitos, linfócitos e células tumorais 18,27,28,29,30. O bMFA pode ser semeado com células endoteliais primárias de diferentes órgãos (por exemplo, pulmão vs. cérebro) e diferentes espécies (por exemplo, células endoteliais humanas vs. murinas), bem como linhas de células endoteliais 21,27,31,32. O bMFA pode ser usado para estudar múltiplas respostas celulares, interações célula-células, função de barreira, entrega de drogas e toxicidade de drogas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomimetic microfluidic assay (bMFA)</td>
			<td>SynVivo</td>
			<td>SMN1-C001</td>
			<td>Exclusive at SynVivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG24-0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C70-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFDA, SE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, 250,000, Powder</td>
			<td>Spectrum Chemical Mfg. Corp</td>
			<td>DE-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Premium</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>17-5442-02</td>
			<td>Leukocyte isolation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fMLP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1692630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>33-016-015</td>
			<td>use vendor recommended ECM for different cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3202</td>
			<td>Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lung microvascular endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-2527</td>
			<td>use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-elements, 5.20.01</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhD Ultra Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3007</td>
			<td>Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-003-763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide clamp</td>
			<td>SynVivo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S640-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synvivo Pneumatic Primer</td>
			<td>SynVivo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-5034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-206-8921</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microphysiological system to study leukocyte-endothelial cell interaction during inflammation

As interações leucócito-endotelial desempenham um papel importante em doenças inflamatórias, como a sepse. Durante a inflamação, a migração excessiva de leucócitos ativados através do endotélio vascular em órgãos-chave pode levar à falência de órgãos. Um ensaio microfluido biomimético fisiologicamente relevante (bMFA) foi desenvolvido e validado utilizando várias técnicas experimentais e computacionais, que podem reproduzir toda a cascata de rolagem/adesão/migração leucócitos para estudar interações células leucócitos-endoteliais. Redes microvasculares obtidas a partir de imagens in vivo em roedores foram digitalizadas usando uma abordagem do Sistema de Informações Geográficas (SIG) e microfabricadas com polidimtilsiloxano (PDMS) em um slide de microscópio. Para estudar o efeito da taxa de corte e topologia vascular nas interações leucócito-endotelial, foi desenvolvido um modelo de Dinâmica de Fluidos Computacionais (CFD) para gerar um mapa correspondente de taxas de corte e velocidades em toda a rede. O bMFA permite a quantificação de interações leucócito-endotelial, incluindo velocidade de rolamento, número de leucócitos aderidos em resposta a diferentes taxas de tesoura, número de leucócitos migrados, permeabilidade de células endoteliais, expressão de molécula de adesão e outras variáveis importantes. Além disso, utilizando amostras relacionadas ao homem, como células endoteliais humanas e leucócitos, a BMFA fornece uma ferramenta para uma triagem rápida de potenciais terapêuticas para aumentar sua tradução clínica.

Após 48h de cultura sob fluxo de cisalhamento na BMFA, as células endoteliais cobriam a superfície dos canais vasculares na BMFA e se alinhavam na direção do fluxo (Figura 6). A microscopia confocal indicou que todas as superfícies dos canais vasculares estavam cobertas por células endoteliais, formando um lúmen 3D completo em bMFA18.
Usando este protocolo, um mapa de adesão de neutrófilos pode ser adquirido, mostrando que há uma...

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A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Neste protocolo, um ensaio biomimético de microfluido, que pode reproduzir um ambiente microvascular fisiologicamente relevante e reproduzir toda a cascata de adesão/migração leucócito, é empregado para estudar interações células leucócitos-endoteliais em doenças inflamatórias.

Um sistema microfisiológico para estudar a interação das células leucócitos-endoteliais durante a inflamação

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

As interações leucócito-endotelial desempenham um papel importante em doenças inflamatórias, como a sepse. A desregulação da inflamação muitas vezes causa uma função alterada da barreira do endotélio vascular e o tráfico excessivo de leucócitos, o que pode resultar em danos aos órgãos. O ensaio microfluido biomimético, o que chamamos de bMFA, reproduz condições de topografia e fluxo de redes microvasculares in-vivo e permite a avaliação em tempo real de rolagem, adesão firme, disseminação e migração de neutrófilos para o compartimento tecidual.Uma força do ensaio microfluido biomimético é a capacidade de usar células humanas primárias e amostras de pacientes clinicamente relevantes para aumentar a tradução clínica e rapidamente testar potenciais terapêuticos. Demonstrando os procedimentos estará o Sr. Qingliang Yang, um assistente de pesquisa de pós-graduação do meu laboratório. Comece a inserir o tubo de cerca de uma polegada de comprimento dentro das portas usando fórceps finos, exceto por uma porta de entrada.Usando grampos na mandíbula, fixar as duas portas de saída e o compartimento de tecido juntos. Diluir a solução de estoque de fibronectina para 100 microgramas por mililitro com PBS. Carregue uma seringa de um mililitro conectada a uma agulha cega de 24 calibres com a solução de fibronectina diluída e conecte a seringa a uma tubulação de quatro polegadas de comprimento.Insira a tubulação na porta de entrada aberta e empurre o êmbolo até que a fibronectina humana seja liberada de outra porta de entrada e aperte-a. Repita o processo para as portas restantes até que todos os canais, compartimento de tecido e tubos estejam preenchidos com a solução de fibronectina humana. Remova a agulha, mas mantenha o tubo de quatro polegadas de comprimento inserido e sem farol.Para realizar a desgaseamento, conecte a tubulação nãoclampada ao primer pneumático conectado a um tanque de nitrogênio comprimido com uma pressão de cinco libras por polegada quadrada por 15 minutos. Sob o microscópio, verifique se não há bolhas de ar presas dentro do canal ou compartimento de tecido e reconecte o dispositivo se as bolhas de ar estiverem presentes. Remova o dispositivo do primer pneumático e incuba-o a 37 graus Celsius durante uma hora.Usando mídia de cultura de células microvasculares microvasculares do pulmão humano pré-aquecida, lave todos os canais e compartimento de tecido. Depois de colher as células endoteliais como descrito no manuscrito do texto, pelotar as células por centrifugação por cinco minutos a 150 vezes G.In a bomba de seringa programável, montar uma seringa de um mililitro e anexar a tubulação à agulha cega. Desenhe aproximadamente 20 microliters da suspensão da célula para dentro da tubulação sem deixá-lo entrar no barril de seringa.Remova o grampo da porta de saída do dispositivo. Conecte a tubulação à porta de entrada sem introduzir nenhuma bolha de ar no canal. Pare a bomba com uma taxa de fluxo de quatro a oito microlitros por minuto e observe sob o microscópio.Pare a bomba quando os canais estiverem cheios de células. Aperte a saída e corte a tubulação de entrada. Coloque o dispositivo na incubadora por quatro horas a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius.Depois de quatro horas de incubação, prepare outra seringa e preencha-a com novas mídias de cultura celular. Monte a seringa em uma bomba de seringa e conecte-a à porta de entrada. Remova o grampo da porta de saída.Passe a mídia fresca através do dispositivo por cerca de cinco minutos a quatro a oito microliters por minuto para remover as células flutuantes ou não.. Prepare uma seringa preenchendo-a com mídia de cultura celular fresca. Monte a seringa em uma bomba de seringa e conecte-a a uma porta de entrada, mantendo a porta de saída aberta.Coloque o dispositivo em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Programe a bomba de seringa para cultivar células endoteliais sob fluxo, conforme descrito no manuscrito do texto. Usando um microscópio, verifique bMFA após 48 horas de cultura sob fluxo.A microscopia confocal indicou que todas as superfícies dos canais vasculares estavam cobertas por células endoteliais, formando um lúmen 3D completo em bMFA. Depois de preparar três dispositivos diferentes de bMFA, carregue três seringas de um mililitro com mídia de cultura celular ou TNF-alfa ou TNF-alfa combinados com inibidor delta PKC, respectivamente, onde tnf-alfa e citocina inflamatória é usado para estimular células endoteliais e neutrófilos. O inibidor delta PKC é um novo inibidor anti-inflamatório.Conecte as três seringas carregadas a três dispositivos bMFA. Usando tampão TNF-alfa ou TNF-alfa com inibidor adicionado, trate células endoteliais microvasculares pulmonares humanas por quatro horas a 0,1 microliters por minuto. Depois de isolar os neutrófilos humanos como descrito no manuscrito do texto, resuspensar os neutrófilos em 999 microliters de tampão HEPES e adicionar um microliter de 10 milimônios solução de corante CFDA SE à suspensão, resultando em uma solução de trabalho de 10 micromolars da CFDA SE e incuba-lo por 10 minutos à temperatura ambiente.Lave as células duas vezes com tampão HEPES, centrifugando a solução por cinco minutos a 315 vezes G.Depois de contar as células, resuspenque em 2 milhões de neutrófilos por mililitro em mídia de cultura celular ou TNF-alfa ou TNF-alfa adicionado com inibidor de delta PKC e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. Encha a seringa com um micromolar de um atrativo de quimioterapia, fMLP, preparado em meios de cultura celular. Abra uma entrada e uma porta de saída da bMFA.Remova a tubulação da porta do compartimento de tecido e insira a tubulação fMLP. Injete aproximadamente 20 microliters de fMLP no compartimento tecidual para toda a BMFA, deixando aquele tratado com mídia de cultura celular. Corte a tubulação e aperte-a.Coe a seringa com aproximadamente 200 microliters de suspensão de neutrófilos e monte a seringa na bomba de seringa. Depois de colocar o dispositivo em um estágio de microscópio invertido, defina a taxa de fluxo em um microliter por minuto e inicie a bomba. Espere até que uma pequena gota da suspensão do neutrófilo saia da tubulação e insira a tubulação na porta de entrada.Neutrófilos fluorescentes fluem para os canais vasculares e interagem com células endoteliais e condições de fluxo fisiologicamente relevantes. Após 10 minutos após o início do experimento, abra o software de análise de imagem, mude a lente objetiva para 10x e use o joystick de palco para centralizar o dispositivo sob o microscópio. Para obter o mapa de adesão, vá para Adquirir, clique em Digitalizar grande imagem.Uma nova janela aparece. Escolha 10x Lente objetiva e defina a opção de campo, por exemplo, 5 por 3. Clique em Digitalizar, clique em Arquivo e salve o mapa de adesão.Para obter o mapa de migração para análise de migração, centralizar o dispositivo sob o microscópio usando o joystick de palco. Clique em Exibir, Controles de Aquisição, Aquisição ND. Uma nova janela aparece.Defina o Caminho para salvar o arquivo e digite o nome do arquivo. Verifique a função Imagem Grande, defina Área de Varredura, por exemplo, 5 por 3. Verifique a função Tempo, defina o intervalo como cinco minutos e a duração em 60 minutos.Tire imagens de lapso de tempo do compartimento de tecido, com uma imagem tirada a cada cinco minutos durante a próxima hora. A simulação de CFD mostra o padrão de fluxo laminar nos canais vasculares, exceto para áreas de bifurcação onde o padrão de fluxo é perturbado. Após a realização do ensaio biomimético de microfluidos, imagens de contraste de fase revelaram que as superfícies dos canais vasculares foram cobertas com células endoteliais, e alinhadas na direção do fluxo de cisalhamento após 48 horas de cultura.A imagem de fluorescência foi realizada por meio de microscopia confocal, indicando que as células endoteliais formam um lúmen tridimensional completo no mapa de adesão de neutrófilos bMFA A, que revelou que há uma adesão significativa de neutrófilos às células endoteliais no BMFA. O mapa de migração de neutrófilos na bMFA revelou que, após a ativação TNF-alfa, uma migração considerável de neutrófilos ocorre dentro do compartimento tecidual, enquanto tal migração não foi observada sem ativação TNF-alfa. Um mapa de adesão correlacionando a distribuição espacial de neutrófilos com a taxa de corte demonstrou que a adesão de neutrófilos ocorreu preferencialmente em vasos com baixa taxa de corte e regiões próximas à bifurcação.Além disso, o tratamento TNF-alfa aumenta significativamente a adesão, que foi inibida com o inibidor delta PKC. Analisar imagens de lapso de tempo indicou que a ativação de células endoteliais aumenta a migração de neutrófilos em resposta ao fMLP, enquanto o tratamento com o inibidor delta PKC reduziu a migração em comparação com células tratadas TNF-alfa. Assim, a BMFA pode ser utilizada para testar a eficácia de um novo terapêutico para o tratamento de doenças inflamatórias.O bMFA também pode ser usado para estudar a integridade do endotélio medindo variáveis como permeabilidade e resistência elétrica trans-endotelial, o que é chamado de TEER, e expressão de molécula de adesão durante a inflamação. O ensaio microfluido biomimético pode imitar o microambiente de diferentes órgãos e não se limita a tipos ou espécies de células únicas, podendo também modelar a comunicação celular/celular crítica à função do órgão e modelar diferentes doenças.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

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Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Bioengenharia

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

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Construção de um baixo orçamento Laser Sistema axotomia para estudar a regeneração do axônio em C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Um sistema experimental para estudar Mecanotransdução em células do pulmão fetal

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Microfabricação de Padrões de Ouro Nanoporosos para celular-primas estudos de interacção

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Avaliando interação leucócito-endotélio em condições de fluxo em um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Câmara Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Sistema de Gel Concentric para estudar o papel Biofísica da Matrix Microenvironment sobre a migração celular 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Imagens de células vivas durante Mecânica estiramento

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

Um sistema microfluídico com padrões de superfície para investigar bolha de cavitação (s) Interação -cell e os Efeitos Biológicos resultante no nível de célula única

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Nanotubos de DNA como uma ferramenta versátil para estudar semiflexível polímeros

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...