Name: a microphysiological system to study leukocyte-endothelial cell interaction during inflammation
Uploaded: 2021-12-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения, номер гранта: GM114359 и GM134701 (M.F.K. и L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), и Агентством по уменьшению угрозы обороны, номер гранта: HDTRA11910012 (M.F.K. и L.E.K.).

Гепаринизированная человеческая кровь получается для выделения нейтрофилов от здоровых взрослых доноров (мужчин и женщин в возрасте от 21 до 60 лет) после информированного согласия, одобренного Советом по институциональному обзору Университета Темпл (Филадельфия, штат Пенсильвания, СШ...

<ol>
	<li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+approaches+to+understanding+microvascular+endothelial+heterogeneity:+A+roadmap+for+developing+anti-inflammatory+therapeutics.">Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).</li><li>Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+responses+in+sepsis.">Endothelial responses in sepsis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).</li><li>Ince, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelium+in+sepsis.">The endothelium in sepsis.</a> Shock. 45, 259-270 (2016).</li><li>Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+processes+in+cardiovascular+disease:+a+route+to+targeted+therapies.">Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).</li><li>Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+approaches+to+evaluate+leukocyte-endothelial+cell+interactions+in+sepsis+and+inflammation.">Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation.</a> Shock. 53, 585-595 (2020).</li><li>Langer, H. F., Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+interactions+in+inflammation.">Leukocyte-endothelial interactions in inflammation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).</li><li>Sadik, C. D., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-cytokine-chemokine+cascades+orchestrate+leukocyte+recruitment+in+inflammation.">Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).</li><li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neutrophil+in+vascular+inflammation.">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).</li><li>Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelium+in+acute+lung+injury/acute+respiratory+distress+syndrome.">The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome.</a> Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).</li><li>Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+leukocyte-tissue+interactions.">Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions.</a> Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).</li><li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+shear+stress+on+endothelial+cells:+go+with+the+flow.">Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow.</a> Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).</li><li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. -. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature.">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).</li><li>Zou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSGL-1+derived+from+human+neutrophils+is+a+high-efficiency+ligand+for+endothelium-expressed+E-selectin+under+flow.">PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).</li><li>Lamberti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+microfluidic+assay+for+in+vitro+modeling+of+leukocyte-endothelium+interactions.">Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions.</a> Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).</li><li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microvascular+networks+for+quantitative+analysis+of+particle+adhesion.">Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion.</a> Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).</li><li>Soroush, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microfluidic+assay+reveals+a+key+role+for+protein+kinase+C+delta+in+regulating+human+neutrophil-endothelium+interaction.">A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).</li><li>Roth, N. M., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;geographic+information+systems&amp;#34;+based+technique+for+the+study+of+microvascular+networks.">A &amp;#34;geographic information systems&amp;#34; based technique for the study of microvascular networks.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).</li><li>Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifurcations:+Focal+points+of+particle+adhesion+in+microvascular+networks.">Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks.</a> Microcirculation. 18, 380-389 (2011).</li><li>Rosano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiologically+realistic+in+vitro+model+of+microvascular+networks.">A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).</li><li>Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+adhesion+of+leukocytes+near+bifurcations+is+endothelium+independent.">Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent.</a> Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).</li><li>Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+and+neutrophil+isolation+and+migration+assays.">Monocyte and neutrophil isolation and migration assays.</a> Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).</li><li>Entschladen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+methods+of+human+cell+migration.">Analysis methods of human cell migration.</a> Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).</li><li>Chen, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.+Methods+in+Molecular+Biology.">Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology.</a> Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , (2005).</li><li>Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+dynamic+neonatal+blood-brain+barrier+on+a+chip.">A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip.</a> PloS one. 10, 142725 (2015).</li><li>Soroush, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-endothelial+interactions+of+murine+cells+is+not+a+good+predictor+of+their+interactions+in+human+cells.">Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells.</a> The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).</li><li>Soroush, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C-Delta+(PKC&#948;)+tyrosine+phosphorylation+is+a+critical+regulator+of+neutrophil-endothelial+cell+interaction+in+inflammation.">Protein Kinase C-Delta (PKC&#948;) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation.</a> Shock. 51 (5), 538-547 (2019).</li><li>Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#948;+inhibition+as+a+novel+medical+countermeasure+for+radiation-induced+vascular+damage.">PKC&#948; inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage.</a> The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).</li><li>Pradhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microvascularized+tumor-mimetic+platform+for+assessing+anti-cancer+drug+efficacy.">A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).</li><li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomimetic+microfluidic+tumor+microenvironment+platform+mimicking+the+EPR+effect+for+rapid+screening+of+drug+delivery+systems.">A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-delta+inhibition+protects+blood-brain+barrier+from+sepsis-induced+vascular+damage.">Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).</li><li>Mondrinos, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+endothelial+protein+kinase+C-delta+(PKCd)+regulates+neutrophil+migration+in+acute+lung+inflammation.">Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation.</a> The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).</li><li>Kilpatrick, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+sepsis-induced+lung+injury+by+selective+inhibition+of+protein+kinase+C-d+(d-PKC).">Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC).</a> Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).</li><li>Mondrinos, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+and+efficacy+of+targeted+pulmonary+delivery+of+a+protein+kinase+C-d+inhibitory+peptide:+Impact+on+Indirect+lung+Injury.">Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).</li><li>Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+protein+kinase+C-delta+in+regulating+platelet+activation+and+platelet-leukocyte+interaction+during+sepsis.">Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis.</a> PloS one. 13, 0195379 (2018).</li><li>Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+shear+adhesion+map+using+SynVivo+synthetic+microvascular+networks.">Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).</li></ol>

bMFA воспроизводит топографию и условия течения микрососудистых сетей in vivo и может быть использован для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток и функции эндотелия in vitro в физиологически реалистичных условиях. В микроциркуляторном русле мыши или человека г...

Воспаление является ответом хозяина на инфекцию и травму, а эндотелий играет важную роль в воспалительной реакции 1,2,3. Воспалительная дисрегуляция является основной причиной ряда патологий заболеваний, таких как сепсис, сердечно-сосудистые заболевания, астма, воспалительные заболевания кишечника, рак и COVID-19. Взаимодействие лейкоцитов и эндотелиальных клеток играет центральную роль в этих воспалительных заболеваниях. Во время воспаления высвобождение PAMPS (патоген-ассоциированных молекулярных паттернов) из патогенов или DAMPS (связанных с повреждением молекулярных паттернов) из поврежденных тканей активирует иммунные клетки для высвобождения цитокинов / хемокинов и других провоспалительных медиаторов, которые приводят к активации эндотелия, что приводит к изменениям в барьерной функции эндотелия сосудов и повышению проницаемости 3,4 . Повышенная активация эндотелиальных клеток при воспалении приводит к усилению взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток, что приводит к чрезмерной миграции активированных лейкоцитов через эндотелий сосудов в ключевые органы 1,5,6,7.
Рекрутирование лейкоцитов инициируется химически разнообразными хемоаттрактантантами, состоящими из биологически активных липидов, цитокинов, хемокинов и компонентов комплемента 8,9. Рекрутирование лейкоцитов представляет собой многоступенчатый процесс, который включает в себя пять дискретных этапов: 1) маржинирование и захват/прикрепление лейкоцитов, 2) прокатка, 3) твердая остановка, 4) распространение и ползание и 5) экстравазация/миграция (рисунок 1). Каждый этап этого процесса требует перекрестных помех между лейкоцитами и эндотелиальными клетками для оркестровки этого динамического явления 1,9. В конечном счете, арестованные лейкоциты экстравазируются в воспаленные ткани через эндотелий с помощью многоступенчатого процесса, контролируемого одновременными химиоаттруктант-зависимыми сигналами, адгезивными событиями и гемодинамическими сдвиговыми силами 1,9,10,11,12.
Учитывая центральную роль сдвигового стресса в регулировании функции эндотелиальных клеток и значимость взаимодействия лейкоцитов и эндотелий клеток13, за последние несколько десятилетий было разработано несколько моделей in vitro для изучения различных аспектов каскада миграции лейкоцитов в более контролируемой среде14. Традиционные жидкостные устройства для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток можно классифицировать на две широкие категории14: а) устройства для изучения подвижности лейкоцитов, адгезии и экспрессии молекул адгезии, такие как параллельные пластинчатые проточные камеры и б) устройства для изучения миграции лейкоцитов в статических условиях, таких как трансвеллентные камеры. Такие системы, как параллельные пластинчатые проточные камеры, использовались для изучения роли молекул адгезии и их лигандов в каскаде адгезии при силах сдвига15. Однако существенным недостатком является то, что эти упрощенные, идеализированные устройства (например, прямой канал) не способны воспроизводить масштаб и геометрию микроциркуляторного русла in vivo (например, последовательные сосудистые бифуркации, морфологию сосудов) и результирующие условия потока (например, сходящиеся или расходящиеся потоки при бифуркациях). В результате эти устройства могут моделировать только адгезию, но не трансмиграцию. Трансвелл-камеры могут изучать только трансмиграцию в статических условиях без учета геометрических особенностей in vivo и условий потока. Таким образом, эти традиционные модели не имитируют микроокружение живых тканей и не разрешают каскад адгезии и миграции в одном анализе6.
Чтобы устранить это ограничение, мы разработали и тщательно проверили новый 3D-биомиметический микрофлюидный анализ (bMFA) (рисунок 2), который реалистично воспроизводит микрососудистые сети in vivo на чипе 16,17,18. Протокол микропроизводства этого устройства был опубликован ранее17 и лишь кратко описан здесь. Микроциркуляторное русло мышиной кремастерной мышцы было оцифровано с использованием модифицированного подхода19 Географической информационной системы (ГИС). Затем синтетическую микрососудистую сеть генерировали на полидиметилсилоксане (PDMS) с помощью процессов мягкой литографии на основе оцифрованной микрососудистой сети 14,17,20,21,22. Вкратце, оцифрованные сетевые изображения были напечатаны на майларовой пленке, которая затем использовалась в качестве маски для создания положительного фоторезиста СУ-8 поверх кремниевой пластины для создания мастеров для изготовления. Микрофабрикированные столбы (диаметр 10 мкм, высота 3 мкм) использовались для создания пор высотой 3 мкм и шириной 100 мкм, оптимального размера для миграции лейкоцитов 23,24,25, соединяющих сосудистые каналы и тканевые отсеки. ПДМС готовили по инструкции производителя и заливали над разработанными мастерами. Кроме того, PDMS дегазировали и позволяли отверждать в течение ночи в печи (65 ° C) для создания дополнительных микроканалов в PDMS. Впоследствии отвержденный ПДМС отклеивали от капитана СУ-8 с последующей штамповкой отверстий для входов/розеток. Затем PMDS был плазменным соединением со стеклянным слайдом. Поверхность микрофлюидного устройства содержит нативное стекло и PDMS. Чтобы способствовать прикреплению, распространению и пролиферации клеток, требуется покрытие внеклеточной матрицы (ECM). bMFA включает микрососудистую сеть и тканевой компартмент, соединенный через поры высотой 3 мкм и шириной 100 мкм (рисунок 2). Эта микрофлюидная система воспроизводит весь каскад адгезии/миграции лейкоцитов в физиологически значимой 3D-среде полной микрососудистой сети со взаимосвязанными сосудами и бифуркациями, включая циркуляцию, маржинацию, прокатку, адгезию и миграцию лейкоцитов во внесосудистый тканевой компартмент в единую систему 14,16,17,21,26.
Следует отметить, что даже при фиксированном расходе на входе bMFA условия потока в сети изменяются в разных местах и не могут быть рассчитаны по простой математической формуле. Была разработана модель на основе вычислительной гидродинамики (CFD) для расчета различных параметров потока (например, напряжения сдвига, скорости сдвига, скорости) в разных местах сети. Эта модель CFD использовалась для моделирования паттернов перфузии красителя и параметров потока в bMFA. Перекрестная валидация с экспериментальными результатами показала, что сопротивления потока по сети хорошо предсказаны вычислительной моделью (рисунок 3)17. Эта модель CFD затем использовалась для оценки скорости и профиля скорости сдвига в каждом сосуде bMFA (рисунок 4), что позволило проанализировать влияние сдвигового потока и геометрии на крение лейкоцитов, адгезию и миграцию16. Лейкоциты преимущественно прилипают вблизи бифуркации и в областях с низким сдвигом in vivo, и эти пространственные паттерны адгезии лейкоцитов были успешно продемонстрированы в bMFA с использованием нейтрофилов (рисунок 5)16. В данной работе описан протокол подготовки bMFA для изучения взаимодействия лейкоцитарно-эндотелиальных клеток при воспалительных состояниях с использованием микрососудистых эндотелиальных клеток легких человека (HLMVEC) и нейтрофилов человека. Микрофизиологические системы, такие как bMFA, могут быть использованы для изучения взаимодействия эндотелиальных клеток с различными типами клеток, такими как нейтрофилы, моноциты, лимфоциты и опухолевые клетки 18,27,28,29,30. bMFA может быть засеян первичными эндотелиальными клетками из разных органов (например, легких против мозга) и различных видов (например, человеческие и мышиные эндотелиальные клетки), а также эндотелиальными клеточными линиями 21,27,31,32. bMFA может быть использован для изучения множественных клеточных реакций, клеточно-клеточных взаимодействий, барьерной функции, доставки лекарств и токсичности лекарств.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomimetic microfluidic assay (bMFA)</td>
			<td>SynVivo</td>
			<td>SMN1-C001</td>
			<td>Exclusive at SynVivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG24-0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C70-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFDA, SE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, 250,000, Powder</td>
			<td>Spectrum Chemical Mfg. Corp</td>
			<td>DE-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Premium</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>17-5442-02</td>
			<td>Leukocyte isolation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fMLP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1692630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>33-016-015</td>
			<td>use vendor recommended ECM for different cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3202</td>
			<td>Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lung microvascular endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-2527</td>
			<td>use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-elements, 5.20.01</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhD Ultra Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3007</td>
			<td>Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-003-763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide clamp</td>
			<td>SynVivo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S640-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synvivo Pneumatic Primer</td>
			<td>SynVivo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-5034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-206-8921</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microphysiological system to study leukocyte-endothelial cell interaction during inflammation

Взаимодействие лейкоцитов и эндотелиальных клеток играет важную роль при воспалительных заболеваниях, таких как сепсис. Во время воспаления чрезмерная миграция активированных лейкоцитов через эндотелий сосудов в ключевые органы может привести к органной недостаточности. Физиологически значимый биомиметический микрофлюидный анализ (bMFA) был разработан и подтвержден с использованием нескольких экспериментальных и вычислительных методов, которые могут воспроизводить весь каскад перекатки /адгезии/миграции лейкоцитов для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток. Микрососудистые сети, полученные из изображений in vivo у грызунов, были оцифрованы с использованием подхода Географической информационной системы (ГИС) и микрофабрикованы с полидиметилсилоксаном (PDMS) на слайде микроскопа. Для изучения влияния скорости сдвига и сосудистой топологии на взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток была разработана модель вычислительной гидродинамики (CFD) для создания соответствующей карты скоростей сдвига и скоростей по всей сети. bMFA позволяет количественно оценивать взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток, включая скорость качения, количество прилипших лейкоцитов в ответ на различные скорости сдвига, количество мигрирующих лейкоцитов, проницаемость эндотелиальных клеток, экспрессию молекул адгезии и другие важные переменные. Кроме того, используя связанные с человеком образцы, такие как эндотелиальные клетки человека и лейкоциты, bMFA предоставляет инструмент для быстрого скрининга потенциальных терапевтических средств для повышения их клинической переводимости.

После 48 ч культуры под сдвиговым потоком в бМФА эндотелиальные клетки покрывали поверхность сосудистых каналов в бМФА и выравнивались в направлении течения (фиг.6). Конфокальная микроскопия показала, что все поверхности сосудистых каналов были покрыты эндотелиальными ...

Watch this Scientific Journal Video about A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation at JoVE.com

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

В этом протоколе биомиметический микрофлюидный анализ, который может воспроизводить физиологически значимую микрососудистую среду и воспроизводить весь каскад адгезии / миграции лейкоцитов, используется для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток при воспалительных заболеваниях.

Микрофизиологическая система для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток при воспалении

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

Взаимодействие лейкоцитов и эндотелиальных клеток играет важную роль при воспалительных заболеваниях, таких как сепсис. Нарушение регуляции воспаления часто вызывает изменение барьерной функции эндотелия сосудов и чрезмерный трафик лейкоцитов, что может привести к повреждению органов. Биомиметический микрофлюидный анализ, который мы называем bMFA, воспроизводит топографию и условия потока микрососудистых сетей in-vivo и позволяет в режиме реального времени оценивать прокатку, твердую адгезию, распространение и миграцию нейтрофилов в тканевый компартмент.Сильной стороной биомиметического микрофлюидного анализа является способность использовать первичные клетки человека и клинически значимые образцы пациентов для увеличения клинического перевода и быстрого скрининга потенциальных терапевтических средств. Демонстрировать процедуры будет г-н Цинлян Ян, аспирант-исследователь из моей лаборатории. Начните вставлять трубку длиной около одного дюйма в порты, используя тонкие щипцы, за исключением одного входного порта.Используя щековые зажимы, зажмите два выходных порта и тканевый отсек вместе. Разбавить раствор фибронектина до 100 мкг на миллилитр с помощью PBS. Загрузите одномиллилитровой шприц, соединенный с тупой иглой 24-го калибра с разбавленным раствором фибронектина, и подключите шприц к трубке длиной четыре дюйма.Вставьте трубку в открытый входной порт, затем нажмите плунжер до тех пор, пока фибронектин человека не будет освобожден из другого входного отверстия, и зажмите его. Повторяйте процесс для оставшихся портов до тех пор, пока все каналы, тканевый отсек и трубки не будут заполнены раствором фибронектина человека. Извлеките иглу, но держите трубку длиной четыре дюйма вставленной и незажатой.Для выполнения дегазации подключите незажатую трубку к пневматической грунтовке, подключенной к резервуару для сжатого азота с давлением пять фунтов на квадратный дюйм в течение 15 минут. Под микроскопом проверьте, что в канале или тканевом отсеке нет пузырьков воздуха, и снова подключите устройство, если пузырьки воздуха присутствуют. Снимите прибор с пневматической грунтовки и высиживайте его при 37 градусах Цельсия в течение одного часа.Используя предварительно нагретые микрососудистые эндотелиальные клеточные питательные среды легких человека, промывают все каналы и тканевый компартмент. После сбора эндотелиальных клеток, как описано в текстовой рукописи, гранулируйте клетки центрифугированием в течение пяти минут в 150 раз G.In программируемый шприц-насос, установите шприц в один миллилитр и прикрепите трубку к тупой игле. Втяните примерно 20 микролитров клеточной суспензии в трубку, не впуская ее в шприцевой ствол.Снимите зажим с выходного порта устройства. Подключите трубку к входному отверстию без введения пузырьков воздуха в канал. Остановите насос со скоростью потока от четырех до восьми микролитров в минуту и наблюдайте под микроскопом.Остановите насос, когда каналы заполнены ячейками. Зажмите выходное отверстие и отрежьте впускную трубку. Поместите устройство в инкубатор на четыре часа при 5% углекислого газа и 37 градусах Цельсия.После четырех часов инкубации подготовьте еще один шприц и наполните его свежей клеточной культуральной средой. Установите шприц в шприцевой насос и подключите его к входному порту. Снимите зажим с выходного отверстия.Пропускайте свежие носители через устройство в течение примерно пяти минут со скоростью от четырех до восьми микролитров в минуту, чтобы удалить плавающие или неприкрепленные ячейки. Приготовьте шприц, заполнив его свежими питательными средами для культивирования клеток. Установите шприц в шприцевой насос и подключите его к одному входному порту, сохраняя выходной порт открытым.Поместите устройство в инкубатор при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Запрограммируйте шприцевой насос для культивирования эндотелиальных клеток под потоком, как описано в текстовой рукописи. Используя микроскоп, проверьте bMFA после 48 часов посева под потоком.Конфокальная микроскопия показала, что все поверхности сосудистых каналов были покрыты эндотелиальными клетками, образующими полный 3D-просвет в bMFA. После приготовления трех различных устройств bMFA загрузите три одномиллилитрных шприца с клеточной культуральной средой или TNF-альфа или TNF-альфа в сочетании с ингибитором дельты PKC соответственно, где TNF-альфа и воспалительный цитокин используются для стимуляции эндотелиальных клеток и нейтрофилов. Дельта-ингибитор PKC является новым противовоспалительным ингибитором.Подключите три нагруженных шприца к трем устройствам bMFA. Используя буфер TNF-альфа или TNF-альфа с добавлением ингибитора, обрабатывайте микрососудистые эндотелиальные клетки легких человека в течение четырех часов со скоростью 0,1 микролитра в минуту. После выделения нейтрофилов человека, как описано в рукописи текста, повторно суспендируют нейтрофилы в 999 микролитрах буфера HEPES и добавляют один микролитр 10-миллимолярного раствора красителя CFDA SE в суспензию, в результате чего получается 10-микромолярный рабочий раствор CFDA SE и инкубируют его в течение 10 минут при комнатной температуре.Промывайте клетки дважды буфером HEPES путем центрифугирования раствора в течение пяти минут в 315 раз G. После подсчета клеток повторно суспендируют при 2 миллионах нейтрофилов на миллилитр в среде клеточной культуры или TNF-альфа или TNF-альфа, добавленные с ингибитором дельты PKC, и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. Наполните шприц одномикроляром химиоаттрактанта, fMLP, приготовленным в среде клеточной культуры. Откройте один входной и один выходной порт bMFA.Извлеките трубку из тканевого отсека и вставьте трубку fMLP. Вводят приблизительно 20 микролитров fMLP в тканевой компартмент для всех bMFA, оставляя тот, который обработан клеточными культуральными средами. Отрежьте трубку и зажмите ее.Наполните шприц примерно 200 микролитрами нейтрофильной суспензии и установите шприц на шприцевом насосе. После размещения устройства на перевернутой ступени микроскопа установите скорость потока на уровне одного микролитра в минуту и запустите насос. Подождите, пока небольшая капля нейтрофильной суспензии выйдет из трубки и вставьте трубку во входное отверстие.Флуоресцентно меченые нейтрофилы проникают в сосудистые каналы и взаимодействуют с эндотелиальными клетками и физиологически значимыми условиями потока. Через 10 минут после начала эксперимента откройте программное обеспечение для анализа изображений, переключите объектив на 10x и используйте джойстик сцены, чтобы центрировать устройство под микроскопом. Чтобы получить карту адгезии, перейдите в раздел Приобретение, щелкните Сканировать большое изображение.Появится новое окно. Выберите объектив 10x и установите параметр поля, например, 5 на 3. Нажмите кнопку Сканировать, выберите Файл и сохраните карту адгезии.Чтобы получить карту миграции для анализа миграции, центрируйте устройство под микроскопом с помощью джойстика стадии. Щелкните Вид, Элементы управления приобретением, Приобретение ND. Появится новое окно.Задайте путь для сохранения файла и введите имя файла. Отметьте функцию «Большое изображение», установите «Область сканирования», например, 5 на 3. Проверьте функцию Время, установите интервал как пять минут, а продолжительность как 60 минут.Делайте покадровые снимки тканевого отсека, причем одно изображение делается каждые пять минут в течение следующего часа. Моделирование CFD показывает ламинарный рисунок потока в сосудистых каналах, за исключением областей бифуркации, где картина потока нарушена. После выполнения биомиметического микрофлюидного анализа фазово-контрастные изображения показали, что поверхности сосудистых каналов были покрыты эндотелиальными клетками и выровнены в направлении сдвигового потока после 48 часов культивирования.Флуоресцентную визуализацию проводили с помощью конфокальной микроскопии, указывающей на то, что эндотелиальные клетки образуют полный трехмерный просвет в bMFA Получена карта адгезии нейтрофилов, которая показала, что в bMFA наблюдается значительная адгезия нейтрофилов к эндотелиальным клеткам. Карта миграции нейтрофилов в bMFA показала, что при активации TNF-альфа происходит значительная миграция нейтрофилов внутри тканевого компартмента, в то время как без активации TNF-альфа такая миграция не наблюдалась. Карта адгезии, коррелирующая пространственное распределение нейтрофилов со скоростью сдвига, показала, что адгезия нейтрофилов происходила преимущественно в сосудах с низкой скоростью сдвига и вблизи бифуркационных областей.Кроме того, лечение TNF-альфа значительно увеличивает адгезию, которая ингибировалась ингибитором дельты PKC. Анализ изображений замедленной съемки показал, что активация TNF эндотелиальных клеток увеличивает миграцию нейтрофилов в ответ на fMLP, тогда как лечение ингибитором дельты PKC снижает миграцию по сравнению с клетками, обработанными TNF-альфа. Таким образом, bMFA может быть использован для проверки эффективности нового терапевтического средства для лечения воспалительных заболеваний.bMFA также может быть использован для изучения целостности эндотелия путем измерения таких переменных, как проницаемость и трансэндотелиальное электрическое сопротивление, то, что называется TEER, и экспрессия молекулы адгезии во время воспаления. Биомиметический микрофлюидный анализ может имитировать микроокружение различных органов и не ограничивается отдельными типами клеток или видами, а также может моделировать клеточную / клеточную связь, критическую для функции органов и моделирования различных заболеваний.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Дизайн Циклические биореактора давление для Ex Vivo Изучение аортального клапанов сердца

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Построение и недорогие лазерные Axotomy система по изучению Axon Регенерация в С. Элеганс</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Экспериментальная система по изучению механотрансдукции в эмбриональные клетки легких

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Микротехнологий нанопористого Шаблоны золото для сотового материала исследования взаимодействия

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Оценка лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействий в условиях протекают в<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Autoperfused Microflow палата Анализ

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Концентрические Гель Система по изучению биофизических роли матриксных микроокружения на 3D миграции клеток

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Живых изображений сотовый процессе механической Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Строительство Defined человека Engineered сердечной ткани для изучения механизмов сердечной терапии клеток

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

Микрожидком система с поверхности паттернирования для исследования кавитационного пузырька (ы) -клетка взаимодействия и результирующая биоэффектов на уровне одной клетки

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Нанотрубках ДНК как универсальный инструмент для изучения полугибких полимеров

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...