Name: a microphysiological system to study leukocyte-endothelial cell interaction during inflammation
Uploaded: 2021-12-09T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud, Número de subvención: GM114359 y GM134701 (M.F.K. y L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), y la Agencia de Reducción de Amenazas de Defensa, Número de subvención: HDTRA11910012 (M.F.K. y L.E.K.).

La sangre humana heparinizada se obtiene para el aislamiento de neutrófilos de donantes adultos sanos (hombres y mujeres, de entre 21 y 60 años de edad), previo consentimiento informado aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Temple (Filadelfia, PA, EE.
1. Imprimación y recubrimiento del dispositivo con fibronectina humana
NOTA: El bMFA tiene dos puertos de entrada y dos puertos de salida conectados al compartimento va...

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F., Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+interactions+in+inflammation.">Leukocyte-endothelial interactions in inflammation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).</li><li>Sadik, C. D., Luster, A. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+endothelial+protein+kinase+C-delta+(PKCd)+regulates+neutrophil+migration+in+acute+lung+inflammation.">Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation.</a> The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).</li><li>Kilpatrick, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+sepsis-induced+lung+injury+by+selective+inhibition+of+protein+kinase+C-d+(d-PKC).">Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC).</a> Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).</li><li>Mondrinos, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+and+efficacy+of+targeted+pulmonary+delivery+of+a+protein+kinase+C-d+inhibitory+peptide:+Impact+on+Indirect+lung+Injury.">Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).</li><li>Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. 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El bMFA reproduce la topografía y las condiciones de flujo de las redes microvasculares in vivo y se puede utilizar para estudiar la interacción leucocito-célula endotelial y la función endotelial in vitro en condiciones fisiológicamente realistas. En la microvasculatura de ratón o humano, la geometría de las redes microvasculares es autosimilar y fractal, y el número de Reynolds << 1, lo que indica que la geometría vascular no afecta significativamente los patrones de flujo. Por lo tanto, la b...

La inflamación es la respuesta del huésped a la infección y la lesión, y el endotelio juega un papel importante en la respuesta inflamatoria 1,2,3. La desregulación inflamatoria es la causa subyacente de una serie de patologías de enfermedades como la sepsis, las enfermedades cardiovasculares, el asma, la enfermedad inflamatoria intestinal, el cáncer y el COVID-19. Las interacciones leucocitarios-células endoteliales juegan un papel central en estas enfermedades inflamatorias. Durante la inflamación, la liberación de PAMPS (patrones moleculares asociados a patógenos) de patógenos o DAMPS (patrones moleculares asociados al daño) de los tejidos lesionados activa las células inmunes para liberar citoquinas / quimiocinas y otros mediadores proinflamatorios que conducen a la activación del endotelio, lo que resulta en alteraciones en la función de barrera del endotelio vascular y una mayor permeabilidad 3,4 . El aumento de la activación de las células endoteliales durante la inflamación da como resultado una mayor interacción entre leucocitos y células endoteliales, lo que lleva a una migración excesiva de leucocitos activados a través del endotelio vascular hacia órganos clave 1,5,6,7.
El reclutamiento de leucocitos es iniciado por quimioatrayentes químicamente diversos compuestos por lípidos bioactivos, citoquinas, quimiocinas y componentes del complemento 8,9. El reclutamiento de leucocitos es un proceso de varios pasos que incluye cinco pasos discretos: 1) marginación de leucocitos y captura/fijación, 2) rodaje, 3) arresto firme, 4) propagación y rastreo y 5) extravasación/migración (Figura 1). Cada paso de este proceso requiere diafonía entre leucocitos y células endoteliales para orquestar este fenómeno dinámico 1,9. En última instancia, los leucocitos detenidos extravasan a los tejidos inflamados a través del endotelio a través de un proceso de varios pasos controlado por señales concurrentes dependientes de quimioatrayentes, eventos adhesivos y fuerzas de cizallamiento hemodinámicas 1,9,10,11,12.
Dado el papel central del esfuerzo cortante en la regulación de la función de las células endoteliales y la importancia de las interacciones entre leucocitos y células endoteliales13, durante las últimas décadas se han desarrollado varios modelos in vitro para estudiar diversos aspectos de la cascada de migración de leucocitos en un entorno más controlado14. Los dispositivos fluídicos tradicionales para estudiar las interacciones entre leucocitos y células endoteliales se pueden clasificar en dos grandes categorías14: a) dispositivos para estudiar laminación de leucocitos, adhesión y expresión de moléculas de adhesión, como cámaras de flujo de placas paralelas y b) dispositivos para estudiar la migración de leucocitos en condiciones estáticas como las cámaras de transwell. Sistemas como las cámaras de flujo de placas paralelas se han utilizado para estudiar el papel de las moléculas de adhesión y sus ligandos en la cascada de adhesión bajo fuerzas de cizallamiento15. Sin embargo, un inconveniente significativo es que estos dispositivos simplistas e idealizados (por ejemplo, canal recto) no son capaces de reproducir la escala y la geometría de la microvasculatura in vivo (por ejemplo, bifurcaciones vasculares sucesivas, morfología vascular) y las condiciones de flujo resultantes (por ejemplo, flujos convergentes o divergentes en bifurcaciones). Como resultado, estos dispositivos solo pueden modelar la adhesión, pero no la transmigración. Las cámaras transwell solo pueden estudiar la transmigración en condiciones estáticas sin considerar las características geométricas in vivo y las condiciones de flujo. Por lo tanto, estos modelos tradicionales no imitan el microambiente de los tejidos vivos ni resuelven la adhesión y la cascada de migración en un solo ensayo6.
Para abordar esta limitación, hemos desarrollado y validado ampliamente un nuevo ensayo microfluídico biomimético 3D (bMFA) (Figura 2), que reproduce de manera realista las redes microvasculares in vivo en un chip16,17,18. El protocolo para la microfabricación de este dispositivo se ha publicado anteriormente17 y solo se describe brevemente aquí. La microvasculatura del músculo cremaster del ratón se digitalizó utilizando un enfoque modificado del Sistema de Información Geográfica (SIG)19. Luego, se generó la red microvascular sintética sobre polidimetilsiloxano (PDMS) utilizando procesos de litografía blanda basados en la red microvascular digitalizada 14,17,20,21,22. Brevemente, las imágenes de red digitalizadas se imprimieron en una película mylar, que luego se usó como máscara para modelar una fotorresistencia positiva SU-8 sobre una oblea de silicio para crear los maestros para la fabricación. Se utilizaron pilares microfabricados (10 μm de diámetro, 3 μm de altura) para crear los poros de 3 μm de alto y 100 μm de ancho, un tamaño óptimo para la migración de leucocitos 23,24,25, conectando los canales vasculares y los compartimentos tisulares. PDMS se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se vertió sobre los maestros desarrollados. Además, el PDMS se desgasificó y se dejó curar durante la noche en un horno (65 ° C) para crear microcanales complementarios en el PDMS. Posteriormente, el PDMS curado se peló del maestro SU-8, seguido de puertos de punzonado para entradas / salidas. Luego, el PMDS se unió con plasma a un portaobjetos de vidrio. La superficie del dispositivo microfluídico comprende vidrio nativo y PDMS. Para promover la unión, propagación y proliferación celular, se requiere un recubrimiento de matriz extracelular (ECM). El bMFA incluye una red microvascular y un compartimento de tejido conectado a través de poros de 3 μm de alto y 100 μm de ancho (Figura 2). Este sistema microfluídico reproduce toda la cascada de adhesión/migración de leucocitos en un entorno 3D fisiológicamente relevante de una red microvascular completa con vasos interconectados y bifurcaciones, incluyendo circulación, marginación, balanceo, adhesión y migración de leucocitos en el compartimento tisular extravascular en un solo sistema 14,16,17,21,26.
Cabe señalar que incluso cuando el caudal en la entrada de bMFA es fijo, las condiciones de flujo en la red varían en diferentes ubicaciones y no se pueden calcular mediante una fórmula matemática simple. Se desarrolló un modelo basado en dinámica de fluidos computacional (CFD) para calcular diferentes parámetros de flujo (por ejemplo, tensión de cizallamiento, velocidad de cizallamiento, velocidad) en diferentes ubicaciones de la red. Este modelo CFD se utilizó para simular los patrones de perfusión de tinte y los parámetros de flujo en el bMFA. La validación cruzada con resultados experimentales sugirió que las resistencias de flujo a través de la red están bien predichas por el modelo computacional (Figura 3)17. Este modelo CFD se utilizó para estimar la velocidad y el perfil de la velocidad de cizallamiento en cada recipiente de bMFA (Figura 4), lo que permitió analizar los efectos del flujo de cizallamiento y la geometría en el laminado, la adhesión y la migración de leucocitos16. Los leucocitos se adhieren preferentemente cerca de bifurcaciones y en regiones de bajo cizallamiento in vivo, y estos patrones espaciales de adhesión leucocitaria se demostraron con éxito en bMFA utilizando neutrófilos (Figura 5)16. Este artículo describe el protocolo para preparar bMFA para estudiar la interacción leucocitario-endotelial en condiciones inflamatorias utilizando células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HLMVEC) y neutrófilos humanos. Los sistemas microfisiológicos, como el bMFA, se pueden utilizar para estudiar las interacciones de las células endoteliales con diferentes tipos de células como neutrófilos, monocitos, linfocitos y células tumorales 18,27,28,29,30. El bMFA se puede sembrar con células endoteliales primarias de diferentes órganos (por ejemplo, pulmón vs. cerebro) y diferentes especies (por ejemplo, células endoteliales humanas vs. murinas), así como líneas celulares endoteliales 21,27,31,32. El bMFA se puede utilizar para estudiar múltiples respuestas celulares, interacciones célula-célula, función de barrera, administración de fármacos y toxicidad de fármacos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomimetic microfluidic assay (bMFA)</td>
			<td>SynVivo</td>
			<td>SMN1-C001</td>
			<td>Exclusive at SynVivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG24-0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C70-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFDA, SE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, 250,000, Powder</td>
			<td>Spectrum Chemical Mfg. Corp</td>
			<td>DE-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Premium</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>17-5442-02</td>
			<td>Leukocyte isolation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fMLP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1692630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>33-016-015</td>
			<td>use vendor recommended ECM for different cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3202</td>
			<td>Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lung microvascular endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-2527</td>
			<td>use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-elements, 5.20.01</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhD Ultra Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3007</td>
			<td>Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-003-763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide clamp</td>
			<td>SynVivo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S640-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synvivo Pneumatic Primer</td>
			<td>SynVivo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-5034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-206-8921</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microphysiological system to study leukocyte-endothelial cell interaction during inflammation

Las interacciones entre leucocitos y células endoteliales juegan un papel importante en enfermedades inflamatorias como la sepsis. Durante la inflamación, la migración excesiva de leucocitos activados a través del endotelio vascular hacia órganos clave puede conducir a la insuficiencia orgánica. Se ha desarrollado y validado un ensayo microfluídico biomimético fisiológicamente relevante (bMFA) utilizando varias técnicas experimentales y computacionales, que pueden reproducir toda la cascada de rodadura/adhesión/migración de leucocitos para estudiar las interacciones leucocitario-célula endotelial. Las redes microvasculares obtenidas a partir de imágenes in vivo en roedores se digitalizaron utilizando un enfoque de Sistema de Información Geográfica (SIG) y se microfabricaron con polidimetilsiloxano (PDMS) en un portaobjetos de microscopio. Para estudiar el efecto de la velocidad de cizallamiento y la topología vascular en las interacciones entre leucocitos y células endoteliales, se desarrolló un modelo de Dinámica de Fluidos Computacional (CFD) para generar un mapa correspondiente de las tasas de cizallamiento y las velocidades en toda la red. El bMFA permite cuantificar las interacciones entre leucocitos y células endoteliales, incluida la velocidad de rodadura, el número de leucocitos adheridos en respuesta a diferentes tasas de cizallamiento, el número de leucocitos migrados, la permeabilidad de las células endoteliales, la expresión de moléculas de adhesión y otras variables importantes. Además, mediante el uso de muestras relacionadas con humanos, como células endoteliales humanas y leucocitos, bMFA proporciona una herramienta para la detección rápida de posibles terapias para aumentar su traducibilidad clínica.

Después de 48 h de cultivo bajo flujo de cizallamiento en bMFA, las células endoteliales cubrieron la superficie de los canales vasculares en bMFA y se alinearon en la dirección del flujo (Figura 6). La microscopía confocal indicó que todas las superficies de los canales vasculares estaban cubiertas por células endoteliales, formando un lumen 3D completo en bMFA18.
Utilizando este protocolo, se puede adquirir un mapa de adhesión de n...

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A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

En este protocolo, se emplea un ensayo biomimético de microfluidos, que puede reproducir un entorno microvascular fisiológicamente relevante y reproducir toda la cascada de adhesión/migración de leucocitos, para estudiar las interacciones leucocitarios-células endoteliales en la enfermedad inflamatoria.

Un sistema microfisiológico para estudiar la interacción leucocitario-endotelial durante la inflamación

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

Las interacciones entre leucocitos y células endoteliales juegan un papel importante en enfermedades inflamatorias como la sepsis. La desregulación de la inflamación a menudo causa alteración de la función de barrera del endotelio vascular y tráfico excesivo de leucocitos, lo que puede provocar daños en los órganos. El ensayo microfluídico biomimético, lo que llamamos bMFA, reproduce la topografía y las condiciones de flujo de las redes microvasculares in vivo y permite la evaluación en tiempo real del laminado, la adhesión firme, la propagación y la migración de neutrófilos al compartimiento tisular.Una fortaleza del ensayo microfluídico biomimético es la capacidad de utilizar células humanas primarias y muestras de pacientes clínicamente relevantes para aumentar la traducción clínica y detectar rápidamente posibles terapias. Demostrando los procedimientos estará el Sr. Qingliang Yang, un asistente de investigación graduado de mi laboratorio. Comience a insertar el tubo de aproximadamente una pulgada de longitud dentro de los puertos utilizando fórceps finos, a excepción de un puerto de entrada.Usando abrazaderas de mandíbula, sujete los dos puertos de salida y el compartimiento de tejido juntos. Diluya la solución madre de fibronectina a 100 microgramos por mililitro con PBS. Cargue una jeringa de un mililitro conectada a una aguja roma de calibre 24 con la solución de fibronectina diluida y conecte la jeringa a un tubo de cuatro pulgadas de largo.Inserte el tubo en el puerto de entrada abierto, luego empuje el émbolo hasta que la fibronectina humana se libere de otro puerto de entrada y sujete. Repita el proceso para los puertos restantes hasta que todos los canales, el compartimento de tejido y el tubo se llenen con la solución de fibronectina humana. Retire la aguja, pero mantenga el tubo de cuatro pulgadas de largo insertado y sin enganchar.Para realizar la desgasificación, conecte el tubo sin enganchar al cebador neumático conectado a un tanque de nitrógeno comprimido con una presión de cinco libras por pulgada cuadrada durante 15 minutos. Bajo el microscopio, verifique que no haya burbujas de aire atrapadas dentro del canal o compartimiento de tejido y vuelva a conectar el dispositivo si las burbujas de aire están presentes. Retire el dispositivo de la imprimación neumática e incube a 37 grados centígrados durante una hora.Utilizando medios de cultivo de células endoteliales microvasculares de pulmón humano precalentados, enjuague todos los canales y el compartimiento de tejido. Después de cosechar las células endoteliales como se describe en el manuscrito de texto, peletizar las células por centrifugación durante cinco minutos a 150 veces G.In la bomba de jeringa programable, montar una jeringa de un mililitro y conectar el tubo a la aguja roma. Extraiga aproximadamente 20 microlitros de la suspensión celular en el tubo sin dejarla entrar en el barril de la jeringa.Retire la abrazadera del puerto de salida del dispositivo. Conecte el tubo al puerto de entrada sin introducir ninguna burbuja de aire en el canal. Detenga la bomba con un caudal de cuatro a ocho microlitros por minuto y observe bajo el microscopio.Detenga la bomba cuando los canales estén llenos de células. Sujete la salida y corte el tubo de entrada. Coloque el dispositivo en la incubadora durante cuatro horas al 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados.Después de cuatro horas de incubación, prepare otra jeringa y llénela con medios de cultivo celular frescos. Monte la jeringa en una bomba de jeringa y conéctela al puerto de entrada. Retire la abrazadera del puerto de salida.Pase los medios frescos a través del dispositivo durante unos cinco minutos a cuatro a ocho microlitros por minuto para eliminar las células flotantes o no unidas. Prepare una jeringa llenándola con medios de cultivo celular frescos. Monte la jeringa en una bomba de jeringa y conéctela a un puerto de entrada mientras mantiene abierto el puerto de salida.Coloque el dispositivo en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Programe la bomba de jeringa para el cultivo de células endoteliales bajo flujo como se describe en el manuscrito de texto. Con un microscopio, verifique el bMFA después de 48 horas de cultivo bajo flujo.La microscopía confocal indicó que todas las superficies de los canales vasculares estaban cubiertas por células endoteliales, formando un lumen 3D completo en bMFA. Después de preparar tres dispositivos bMFA diferentes, cargue tres jeringas de un mililitro con medios de cultivo celular o TNF-alfa o TNF-alfa combinados con inhibidor delta de PKC respectivamente, donde se utiliza TNF-alfa y citoquina inflamatoria para estimular las células endoteliales y los neutrófilos. El inhibidor delta de PKC es un nuevo inhibidor antiinflamatorio.Conecte las tres jeringas cargadas a tres dispositivos bMFA. Usando TNF-alfa tampón o TNF-alfa con inhibidor añadido, trate las células endoteliales microvasculares del pulmón humano durante cuatro horas a 0,1 microlitros por minuto. Después de aislar los neutrófilos humanos como se describe en el manuscrito de texto, resuspenda los neutrófilos en 999 microlitros de tampón HEPES y agregue un microlitro de solución madre de colorante CFDA SE 10 milimolar a la suspensión, lo que resulta en una solución de trabajo de 10 micromolares de CFDA SE e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.Lave las células dos veces con el tampón HEPES centrifugando la solución durante cinco minutos a 315 veces G.Después de contar las células, resuspenda a 2 millones de neutrófilos por mililitro en medios de cultivo celular o TNF-alfa o TNF-alfa agregado con inhibidor delta de PKC e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Llene la jeringa con un micromolar de un quimiotrato, fMLP, preparado en medios de cultivo celular. Abra un puerto de entrada y un puerto de salida del bMFA.Retire el tubo de puerto del compartimento de tejido e inserte el tubo fMLP. Inyectar aproximadamente 20 microlitros de fMLP en el compartimento tisular para todos los bMFA, dejando el tratado con medios de cultivo celular. Cortar el tubo y sujetarlo.Rellene la jeringa con aproximadamente 200 microlitros de suspensión de neutrófilos y monte la jeringa en la bomba de la jeringa. Después de colocar el dispositivo en un escenario de microscopio invertido, ajuste el caudal a un microlitro por minuto y encienda la bomba. Espere hasta que una pequeña gota de la suspensión de neutrófilos salga del tubo e inserte el tubo en el puerto de entrada.Los neutrófilos marcados fluorescentemente fluyen hacia los canales vasculares e interactúan con las células endoteliales y las condiciones de flujo fisiológicamente relevantes. Después de 10 minutos de comenzar el experimento, abra el software de análisis de imágenes, cambie la lente del objetivo a 10x y use el joystick del escenario para centrar el dispositivo debajo del microscopio. Para obtener el mapa de adhesión, vaya a Adquirir, haga clic en Escanear imagen grande.Aparecerá una nueva ventana. Elija la lente de objetivo 10x y configure la opción de campo, por ejemplo, 5 por 3. Haga clic en Escanear, haga clic en Archivo y guarde el mapa de adhesión.Para obtener el mapa de migración para el análisis de migración, centre el dispositivo bajo el microscopio utilizando el joystick de escenario. Haga clic en Ver, Controles de adquisición, Adquisición de ND. Aparecerá una nueva ventana.Establezca la ruta de acceso para guardar el archivo y escriba el nombre del archivo. Marque la función Imagen grande, configure Área de escaneo, por ejemplo, 5 por 3. Compruebe la función Tiempo, establezca el Intervalo como cinco minutos y la Duración como 60 minutos.Tome imágenes de lapso de tiempo del compartimiento de tejido, con una imagen tomada cada cinco minutos durante la siguiente hora. La simulación CFD muestra el patrón de flujo laminar en los canales vasculares, excepto en las áreas de bifurcación donde se altera el patrón de flujo. Después de realizar el ensayo biomimético de microfluidos, las imágenes de contraste de fase revelaron que las superficies de los canales vasculares estaban cubiertas con células endoteliales y alineadas en la dirección del flujo de cizallamiento después de 48 horas de cultivo.Se realizó una imagen de fluorescencia mediante microscopía confocal, indicando que las células endoteliales forman una luz tridimensional completa en bMFA Se obtuvo un mapa de adhesión de neutrófilos, que reveló que existe una adhesión significativa de neutrófilos a las células endoteliales en bMFA. El mapa de migración de neutrófilos en bMFA reveló que tras la activación de TNF-alfa, se produce una migración considerable de neutrófilos dentro del compartimento tisular, mientras que no se observó tal migración sin la activación de TNF-alfa. Un mapa de adhesión que correlaciona la distribución espacial de los neutrófilos con la tasa de cizallamiento demostró que la adhesión de neutrófilos se produjo preferentemente en vasos con baja tasa de cizallamiento y regiones cercanas a la bifurcación.Además, el tratamiento con TNF-alfa aumenta significativamente la adhesión, que se inhibió con el inhibidor delta de PKC. El análisis de imágenes de lapso de tiempo indicó que la activación del TNF de las células endoteliales aumenta la migración de neutrófilos en respuesta a fMLP, mientras que el tratamiento con el inhibidor delta de PKC redujo la migración en comparación con las células tratadas con TNF-alfa. Por lo tanto, bMFA se puede utilizar para probar la eficacia de una nueva terapéutica para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria.El bMFA también se puede utilizar para estudiar la integridad del endotelio midiendo variables como la permeabilidad y la resistencia eléctrica transendotelial, lo que se llama TEER y la expresión de la molécula de adhesión durante la inflamación. El ensayo microfluídico biomimético puede imitar el microambiente de diferentes órganos y no se limita a tipos o especies de células individuales, y también puede modelar la comunicación célula/célula crítica para la función de los órganos y el modelado de diferentes enfermedades.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

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Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

La evaluación de las interacciones leucocito-endotelio en condiciones de flujo en un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ensayo Autoperfused Cámara Microflow

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Gel System Concentric para estudiar el papel de Biofísica de Matrix Microambiente en la migración de células en 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

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Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

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In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

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Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...