Name: a microphysiological system to study leukocyte-endothelial cell interaction during inflammation
Uploaded: 2021-12-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health, grant number: GM114359 och GM134701 (M.F.K. och L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), och Defense Threat Reduction Agency, Grant Number: HDTRA11910012 (M.F.K. och L.E.K.).

Hepariniserat humant blod erhålls för neutrofilisolering från friska vuxna donatorer (män och kvinnor, mellan 21 och 60 år), efter informerat samtycke som godkänts av Institutional Review Board of Temple University (Philadelphia, PA, USA).
1. Grundning och beläggning av enheten med humant fibronektin
OBS: bMFA har två inloppsportar och två utloppsportar anslutna till kärlfacket. Den har också en port ansluten till vävnadsfacket (<strong cl...

<ol>
	<li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+approaches+to+understanding+microvascular+endothelial+heterogeneity:+A+roadmap+for+developing+anti-inflammatory+therapeutics.">Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).</li><li>Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+responses+in+sepsis.">Endothelial responses in sepsis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).</li><li>Ince, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelium+in+sepsis.">The endothelium in sepsis.</a> Shock. 45, 259-270 (2016).</li><li>Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+processes+in+cardiovascular+disease:+a+route+to+targeted+therapies.">Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).</li><li>Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+approaches+to+evaluate+leukocyte-endothelial+cell+interactions+in+sepsis+and+inflammation.">Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation.</a> Shock. 53, 585-595 (2020).</li><li>Langer, H. F., Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+interactions+in+inflammation.">Leukocyte-endothelial interactions in inflammation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).</li><li>Sadik, C. D., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-cytokine-chemokine+cascades+orchestrate+leukocyte+recruitment+in+inflammation.">Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).</li><li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neutrophil+in+vascular+inflammation.">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).</li><li>Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelium+in+acute+lung+injury/acute+respiratory+distress+syndrome.">The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome.</a> Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).</li><li>Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+leukocyte-tissue+interactions.">Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions.</a> Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).</li><li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+shear+stress+on+endothelial+cells:+go+with+the+flow.">Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow.</a> Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).</li><li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. -. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature.">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).</li><li>Zou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSGL-1+derived+from+human+neutrophils+is+a+high-efficiency+ligand+for+endothelium-expressed+E-selectin+under+flow.">PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).</li><li>Lamberti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+microfluidic+assay+for+in+vitro+modeling+of+leukocyte-endothelium+interactions.">Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions.</a> Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).</li><li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microvascular+networks+for+quantitative+analysis+of+particle+adhesion.">Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion.</a> Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).</li><li>Soroush, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+microfluidic+assay+reveals+a+key+role+for+protein+kinase+C+delta+in+regulating+human+neutrophil-endothelium+interaction.">A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).</li><li>Roth, N. M., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;geographic+information+systems&amp;#34;+based+technique+for+the+study+of+microvascular+networks.">A &amp;#34;geographic information systems&amp;#34; based technique for the study of microvascular networks.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).</li><li>Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifurcations:+Focal+points+of+particle+adhesion+in+microvascular+networks.">Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks.</a> Microcirculation. 18, 380-389 (2011).</li><li>Rosano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiologically+realistic+in+vitro+model+of+microvascular+networks.">A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).</li><li>Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+adhesion+of+leukocytes+near+bifurcations+is+endothelium+independent.">Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent.</a> Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).</li><li>Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+and+neutrophil+isolation+and+migration+assays.">Monocyte and neutrophil isolation and migration assays.</a> Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).</li><li>Entschladen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+methods+of+human+cell+migration.">Analysis methods of human cell migration.</a> Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).</li><li>Chen, H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.+Methods+in+Molecular+Biology.">Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology.</a> Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , (2005).</li><li>Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+dynamic+neonatal+blood-brain+barrier+on+a+chip.">A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip.</a> PloS one. 10, 142725 (2015).</li><li>Soroush, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-endothelial+interactions+of+murine+cells+is+not+a+good+predictor+of+their+interactions+in+human+cells.">Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells.</a> The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).</li><li>Soroush, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C-Delta+(PKC&#948;)+tyrosine+phosphorylation+is+a+critical+regulator+of+neutrophil-endothelial+cell+interaction+in+inflammation.">Protein Kinase C-Delta (PKC&#948;) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation.</a> Shock. 51 (5), 538-547 (2019).</li><li>Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#948;+inhibition+as+a+novel+medical+countermeasure+for+radiation-induced+vascular+damage.">PKC&#948; inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage.</a> The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).</li><li>Pradhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microvascularized+tumor-mimetic+platform+for+assessing+anti-cancer+drug+efficacy.">A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).</li><li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomimetic+microfluidic+tumor+microenvironment+platform+mimicking+the+EPR+effect+for+rapid+screening+of+drug+delivery+systems.">A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li><li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-delta+inhibition+protects+blood-brain+barrier+from+sepsis-induced+vascular+damage.">Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).</li><li>Mondrinos, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+endothelial+protein+kinase+C-delta+(PKCd)+regulates+neutrophil+migration+in+acute+lung+inflammation.">Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation.</a> The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).</li><li>Kilpatrick, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+sepsis-induced+lung+injury+by+selective+inhibition+of+protein+kinase+C-d+(d-PKC).">Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC).</a> Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).</li><li>Mondrinos, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+and+efficacy+of+targeted+pulmonary+delivery+of+a+protein+kinase+C-d+inhibitory+peptide:+Impact+on+Indirect+lung+Injury.">Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).</li><li>Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+protein+kinase+C-delta+in+regulating+platelet+activation+and+platelet-leukocyte+interaction+during+sepsis.">Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis.</a> PloS one. 13, 0195379 (2018).</li><li>Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+shear+adhesion+map+using+SynVivo+synthetic+microvascular+networks.">Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).</li></ol>

bMFA reproducerar topografin och flödesförhållandena för de mikrovaskulära nätverken in vivo och kan användas för att studera leukocyt-endotelcellinteraktion och endotelfunktion in vitro under fysiologiskt realistiska förhållanden. I mikrovaskulaturen hos antingen mus eller människa är geometrin hos de mikrovaskulära nätverken självliknande och fraktal, och Reynolds-talet << 1, vilket indikerar att vaskulär geometri inte signifikant påverkar flödesmönster. Därför kan bFMA användas ...

Inflammation är värdens svar på infektion och skada, och endotelet spelar en viktig roll i det inflammatoriska svaret 1,2,3. Inflammatorisk dysregulering är den bakomliggande orsaken till ett antal sjukdomspatologier som sepsis, hjärt-kärlsjukdomar, astma, inflammatorisk tarmsjukdom, cancer och COVID-19. Leukocyt-endotelcellinteraktioner spelar en central roll i dessa inflammatoriska sjukdomar. Under inflammation aktiverar frisättningen av PAMPS (patogenassocierade molekylära mönster) från patogener eller DAMPS (skadeassocierade molekylära mönster) från skadade vävnader immunceller för att frigöra cytokiner/kemokiner och andra proinflammatoriska mediatorer som leder till aktivering av endotel, vilket resulterar i förändringar i vaskulär endotelbarriärfunktion och ökad permeabilitet 3,4 . Ökad aktivering av endotelceller under inflammation resulterar i förbättrad leukocyt-endotelcellinteraktion som leder till överdriven migration av aktiverade leukocyter över det vaskulära endotelet till nyckelorgan 1,5,6,7.
Rekryteringen av leukocyter initieras av kemiskt olika kemoattractanter bestående av bioaktiva lipider, cytokiner, kemokiner och komplementkomponenter 8,9. Leukocytrekrytering är en flerstegsprocess som inkluderar fem diskreta steg: 1) leukocytmarginalering och fångst / fastsättning, 2) rullande, 3) fast arrestering, 4) spridning och krypning och 5) extravasering / migration (Figur 1). Varje steg i denna process kräver överhörning mellan leukocyter och endotelceller för att orkestrera detta dynamiska fenomen 1,9. I slutändan extravaserar arresterade leukocyter till inflammerade vävnader över endotelet via en flerstegsprocess som styrs av samtidiga kemoattractantberoende signaler, limhändelser och hemodynamiska skjuvkrafter 1,9,10,11,12.
Med tanke på skjuvspänningens centrala roll vid reglering av endotelcellfunktionen och betydelsen av leukocyt-endotelcellinteraktionerna13 har flera in vitro-modeller utvecklats under de senaste decennierna för att studera olika aspekter av leukocytmigrationskaskaden i en mer kontrollerad miljö14. Traditionella fluidiska anordningar för att studera leukocyt-endotelcellinteraktioner kan klassificeras i två breda kategorier14: a) anordningar för att studera leukocytvalsning, vidhäftning och vidhäftningsmolekyluttryck såsom parallella plattflödeskammare och b) anordningar för att studera leukocytmigration under statiska förhållanden såsom transbrunnskammare. System som parallella plattflödeskammare har använts för att studera vidhäftningsmolekylernas roller och deras ligander i vidhäftningskaskaden under skjuvkrafter15. En signifikant nackdel är emellertid att dessa förenklade, idealiserade anordningar (t.ex. rak kanal) inte kan reproducera skalan och geometrin hos in vivo-mikrovaskulaturen (t.ex. successiva vaskulära bifurkationer, vaskulär morfologi) och de resulterande flödesförhållandena (t.ex. konvergerande eller divergerande flöden vid bifurkationer). Som ett resultat kan dessa enheter endast modellera vidhäftning men inte transmigration. Transwellkammare kan endast studera transmigration under statiska förhållanden utan att ta hänsyn till in vivo geometriska egenskaper och flödesförhållanden. Således efterliknar dessa traditionella modeller inte mikromiljön hos levande vävnader eller löser vidhäftning och migrationskaskad i en enda analys6.
För att ta itu med denna begränsning har vi utvecklat och i stor utsträckning validerat en ny 3D-biomimetisk mikrofluidisk analys (bMFA) (Figur 2), som realistiskt reproducerar in vivo mikrovaskulära nätverk på ett chip 16,17,18. Protokollet för mikrotillverkning av denna enhet har publicerats tidigare17 och beskrivs bara kortfattat här. Mikrovaskulaturen av mus cremaster muskel digitaliserades med hjälp av ett modifierat geografiskt informationssystem (GIS) tillvägagångssätt19. Därefter genererades det syntetiska mikrovaskulära nätverket på polydimetylsiloxan (PDMS) med användning av mjuka litografiprocesser baserade på det digitaliserade mikrovaskulära nätverket 14,17,20,21,22. Kortfattat trycktes de digitaliserade nätverksbilderna på Mylar-film, som sedan användes som en mask för att mönstra en SU-8-positiv fotoresist ovanpå en kiselskiva för att skapa mästarna för tillverkning. Mikrofabricerade pelare (10 μm diameter, 3 μm långa) användes för att skapa de 3 μm höga och 100 μm breda porerna, en optimal storlek för leukocytmigration 23,24,25, som förbinder kärlkanalerna och vävnadsfacken. PDMS bereddes enligt tillverkarens instruktioner och hälldes över de utvecklade mästarna. Vidare avgasades PDMS och fick härda över natten i en ugn (65 ° C) för att skapa kompletterande mikrokanaler i PDMS. Därefter skalades den härdade PDMS från SU-8-befälhavaren, följt av stansportar för inlopp / utlopp. Sedan var PMDS plasmabunden till en glasskiva. Ytan på den mikrofluidiska anordningen består av inbyggt glas och PDMS. För att främja cellbindning, spridning och proliferation krävs extracelluar matrix (ECM) beläggning. bMFA innefattar ett mikrovaskulärt nätverk och ett vävnadsfack som är anslutet via 3 μm höga och 100 μm breda porer (figur 2). Detta mikrofluidiska system reproducerar hela leukocytvidhäftnings-/migrationskaskaden i en fysiologiskt relevant 3D-miljö i ett komplett mikrovaskulärt nätverk med sammankopplade kärl och bifurkationer, inklusive cirkulation, marginalisering, valsning, vidhäftning och migration av leukocyter till det extravaskulära vävnadsfacket i ett enda system 14,16,17,21,26.
Det bör noteras att även när flödeshastigheten vid inloppet av bMFA är fixerad varierar flödesförhållandena i nätverket på olika platser och kan inte beräknas med en enkel matematisk formel. En CFD-baserad modell (Computational Fluid Dynamics) utvecklades för att beräkna olika flödesparametrar (t.ex. skjuvspänning, skjuvhastighet, hastighet) på olika platser i nätverket. Denna CFD-modell användes för att simulera färgämnets perfusionsmönster och flödesparametrar i bMFA. Korsvalidering med experimentella resultat föreslog att flödesmotstånden över nätverket är väl förutsagda av beräkningsmodellen (figur 3)17. Denna CFD-modell användes sedan för att uppskatta hastighet och skjuvhastighetsprofil i varje kärl i bMFA (figur 4), vilket möjliggjorde analys av effekterna av skjuvflöde och geometri på leukocytrullning, vidhäftning och migration16. Leukocyter fäster företrädesvis nära bifurkationer och i regioner med låg skjuvning in vivo, och dessa rumsliga mönster av leukocytvidhäftning visades framgångsrikt i bMFA med neutrofiler (figur 5)16. Detta dokument beskriver protokollet för att förbereda bMFA för att studera leukocyt-endotelcellinteraktion under inflammatoriska förhållanden med användning av humana lungmikrovaskulära endotelceller (HLMVEC) och humana neutrofiler. Mikrofysiologiska system, såsom bMFA, kan användas för att studera endotelcellinteraktioner med olika typer av celler såsom neutrofiler, monocyter, lymfocyter och tumörceller 18,27,28,29,30. BMFA kan fröas med primära endotelceller från olika organ (t.ex. lunga kontra hjärna) och olika arter (t.ex. humana kontra murina endotelceller), liksom endotelcellinjer 21,27,31,32. BMFA kan användas för att studera flera cellulära svar, cell-cellinteraktioner, barriärfunktion, läkemedelsleverans och läkemedelstoxicitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomimetic microfluidic assay (bMFA)</td>
			<td>SynVivo</td>
			<td>SMN1-C001</td>
			<td>Exclusive at SynVivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG24-0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C70-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFDA, SE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, 250,000, Powder</td>
			<td>Spectrum Chemical Mfg. Corp</td>
			<td>DE-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Premium</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>17-5442-02</td>
			<td>Leukocyte isolation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fMLP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1692630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>33-016-015</td>
			<td>use vendor recommended ECM for different cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3202</td>
			<td>Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lung microvascular endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-2527</td>
			<td>use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-elements, 5.20.01</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhD Ultra Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3007</td>
			<td>Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-003-763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide clamp</td>
			<td>SynVivo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S640-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synvivo Pneumatic Primer</td>
			<td>SynVivo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-5034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-206-8921</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microphysiological system to study leukocyte-endothelial cell interaction during inflammation

Leukocyt-endotelcellinteraktioner spelar en viktig roll i inflammatoriska sjukdomar som sepsis. Under inflammation kan överdriven migration av aktiverade leukocyter över det vaskulära endotelet till nyckelorgan leda till organsvikt. En fysiologiskt relevant biomimetisk mikrofluidisk analys (bMFA) har utvecklats och validerats med hjälp av flera experimentella och beräkningstekniker, som kan reproducera hela leukocytrullningen / vidhäftningen / migrationskaskaden för att studera leukocyt-endotelcellinteraktioner. Mikrovaskulära nätverk erhållna från in vivo-bilder hos gnagare digitaliserades med hjälp av ett geografiskt informationssystem (GIS) -metod och mikrofabricerades med polydimetylsiloxan (PDMS) på en mikroskopbild. För att studera effekten av skjuvhastighet och vaskulär topologi på leukocyt-endotelcellinteraktioner utvecklades en CFD-modell (Computational Fluid Dynamics) för att generera en motsvarande karta över skjuvhastigheter och hastigheter i hela nätverket. bMFA möjliggör kvantifiering av interaktioner mellan leukocyt-endotelceller, inklusive rullande hastighet, antal vidhäftade leukocyter som svar på olika skjuvhastigheter, antal migrerade leukocyter, endotelcellpermeabilitet, vidhäftningsmolekyluttryck och andra viktiga variabler. Dessutom, genom att använda humanrelaterade prover, såsom humana endotelceller och leukocyter, ger bMFA ett verktyg för snabb screening av potentiella terapier för att öka deras kliniska översättningsbarhet.

Efter 48 timmars odling under skjuvflöde i bMFA täckte endotelceller ytan av kärlkanalerna i bMFA och inriktades i flödesriktningen (figur 6). Konfokalmikroskopi indikerade att alla ytor av kärlkanalerna täcktes av endotelceller och bildade en komplett 3D-lumen i bMFA18.
Med hjälp av detta protokoll kan en neutrofil vidhäftningskarta förvärvas, vilket visar att det finns signifikant vidhäftning av neutrofiler till endotelceller i...

Watch this Scientific Journal Video about A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation at JoVE.com

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

I detta protokoll används en biomimetisk mikrofluidanalys, som kan reproducera en fysiologiskt relevant mikrovaskulär miljö och reproducera hela leukocytvidhäftningen / migrationskaskaden, för att studera leukocyt-endotelcellinteraktioner vid inflammatorisk sjukdom.

Ett mikrofysiologiskt system för att studera leukocyt-endotelcellinteraktion under inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

Leukocyt-endotelcellinteraktioner spelar en viktig roll i inflammatoriska sjukdomar som sepsis. Inflammationsdysregulering orsakar ofta förändrad vaskulär endotelbarriärfunktion och överdriven leukocythandel, vilket kan leda till organskador. Den biomimetiska mikrofluidiska analysen, det vi kallar bMFA, reproducerar topografi och flödesförhållanden för mikrovaskulära nätverk in vivo och möjliggör realtidsbedömning av rullande, fast vidhäftning, spridning och migration av neutrofiler till vävnadsfacket.En styrka med den biomimetiska mikrofluidiska analysen är förmågan att använda primära mänskliga celler och kliniskt relevanta patientprover för att öka klinisk översättning och snabbt screena potentiella terapier. Demonstrera procedurerna kommer att vara Mr.Qingliang Yang, en forskarassistent från mitt laboratorium. Börja sätta in röret på cirka en tum i längd i portarna med fina pincett, förutom en inloppsport.Kläm fast de två utloppsportarna och vävnadsfacket med hjälp av käftklämmor. Späd fibronektinsallösningen till 100 mikrogram per milliliter med PBS. Ladda en en milliliter spruta ansluten till en 24-gauge trubbig nål med den utspädda fibronektinlösningen och anslut sprutan till en fyra tum lång slang.Sätt i slangen i den öppna inloppsporten, tryck sedan på kolven tills humant fibronektin frigörs från en annan inloppsport och kläm fast den. Upprepa processen för de återstående portarna tills alla kanaler, vävnadsfack och slangar är fyllda med den humana fibronektinlösningen. Ta bort nålen men håll den fyra tum långa slangen insatt och oansenlig.För att utföra avgasning, anslut den oanslutna slangen till den pneumatiska primern ansluten till en komprimerad kvävetank med ett tryck på fem pund per kvadrattum i 15 minuter. Kontrollera under mikroskopet att det inte finns några luftbubblor fångade i kanalen eller vävnadsfacket och anslut enheten igen om luftbubblorna är närvarande. Ta bort enheten från den pneumatiska primern och inkubera den vid 37 grader Celsius i en timme.Använd förvärmda humana lungmikrovaskulära endotelcellodlingsmedier, spola alla kanaler och vävnadsfack. Efter skörd av endotelcellerna som beskrivs i textmanuskriptet, pelletera cellerna genom centrifugering i fem minuter vid 150 gånger G.In den programmerbara sprutpumpen, montera en en milliliter spruta och fäst slangen på den trubbiga nålen. Dra cirka 20 mikroliter av cellsuspensionen i slangen utan att släppa in den i sprutröret.Ta bort klämman från enhetens utloppsport. Anslut slangen till inloppsporten utan att införa någon luftbubbla i kanalen. Stoppa pumpen med en flödeshastighet på fyra till åtta mikroliter per minut och observera under mikroskopet.Stoppa pumpen när kanalerna är fyllda med celler. Kläm fast utloppet och skär inloppsslangen. Placera enheten i inkubatorn i fyra timmar vid 5% koldioxid och 37 grader Celsius.Efter fyra timmars inkubation, förbered en annan spruta och fyll den med färska cellodlingsmedier. Montera sprutan i en sprutpump och anslut den till inloppsporten. Ta bort klämman från utloppsporten.För det färska mediet genom enheten i cirka fem minuter vid fyra till åtta mikroliter per minut för att ta bort de flytande eller obundna cellerna. Förbered en spruta genom att fylla den med färska cellodlingsmedier. Montera sprutan i en sprutpump och anslut den till en inloppsport samtidigt som utloppsporten hålls öppen.Placera enheten i en inkubator vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Programmera sprutpumpen för odling av endotelceller under flöde enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Kontrollera bMFA med hjälp av ett mikroskop efter 48 timmars odling under flöde.Konfokalmikroskopi indikerade att alla ytor av kärlkanalerna täcktes av endotelceller och bildade en komplett 3D-lumen i bMFA. Efter beredning av tre olika bMFA-enheter, ladda tre en-milliliter sprutor med cellodlingsmedia eller TNF-alfa eller TNF-alfa i kombination med PKC-deltahämmare, där TNF-alfa och inflammatoriskt cytokin används för att stimulera endotelceller och neutrofiler. PKC deltahämmare är en ny antiinflammatorisk hämmare.Anslut de tre laddade sprutorna till tre bMFA-enheter. Använd buffert TNF-alfa eller TNF-alfa med tillsatt hämmare, behandla humana lungmikrovaskulära endotelceller i fyra timmar med 0,1 mikroliter per minut. Efter att ha isolerat de humana neutrofilerna enligt beskrivningen i textmanuskriptet, återsuspendera neutrofilerna i 999 mikroliter HEPES-buffert och tillsätt en mikroliter 10-millimolär CFDA SE-färgämneslösning till suspensionen, vilket resulterar i en 10-mikromolär arbetslösning av CFDA SE och inkuberar den i 10 minuter vid rumstemperatur.Tvätta cellerna två gånger med HEPES-buffert genom att centrifugera lösningen i fem minuter vid 315 gånger G.Efter att ha räknat cellerna, resuspendera vid 2 miljoner neutrofiler per milliliter i cellodlingsmedier eller TNF-alfa eller TNF-alfa tillsatt med PKC-deltahämmare och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter. Fyll sprutan med en mikromolär av ett kemo-lockande medel, fMLP, framställt i cellodlingsmedier. Öppna ett inlopp och en utloppsport på bMFA.Ta bort portslangen från vävnadsfacket och sätt i fMLP-slangen. Injicera cirka 20 mikroliter fMLP i vävnadsfacket för all bMFA, vilket lämnar den som behandlas med cellodlingsmedier. Klipp av slangen och kläm fast den.Fyll sprutan med cirka 200 mikroliter neutrofil suspension och montera sprutan på sprutpumpen. När du har placerat enheten på ett inverterat mikroskopsteg, ställ in flödeshastigheten till en mikroliter per minut och starta pumpen. Vänta tills en liten droppe av neutrofila suspensionen kommer ut ur slangen och sätt in slangen i inloppsporten.Fluorescerande märkta neutrofiler strömmar in i de vaskulära kanalerna och interagerar med endotelceller och de fysiologiskt relevanta flödesförhållandena. Efter 10 minuter från att ha startat experimentet öppnar du bildanalysprogramvaran, byter objektivlinsen till 10x och använder scenjoysticken för att centrera enheten under mikroskopet. För att få vidhäftningskartan, gå till Hämta, klicka på Skanna stor bild.Ett nytt fönster dyker upp. Välj 10x Objektivlins och ställ in fältalternativet, till exempel 5 till 3. Klicka på Skanna, klicka på Arkiv och spara vidhäftningskartan.Om du vill hämta migreringskartan för migreringsanalys centrerar du enheten under mikroskopet med hjälp av scenjoysticken. Klicka på Visa, Förvärvskontroller, ND-förvärv. Ett nytt fönster dyker upp.Ställ in sökvägen för att spara filen och skriv filnamnet. Kontrollera funktionen Stor bild, ställ in Skanningsområde, till exempel 5 till 3. Kontrollera tidsfunktionen, ställ in intervallet som fem minuter och varaktighet som 60 minuter.Ta tidsfördröjningsbilder av vävnadsfacket, med en bild som tas var femte minut under nästa timme. CFD-simulering visar det laminära flödesmönstret i vaskulära kanaler, med undantag för bifurkationsområden där flödesmönstret störs. Efter att ha utfört den biomimetiska mikrofluidanalysen avslöjade faskontrastbilder att ytorna på de vaskulära kanalerna var täckta med endotelceller och inriktade i riktning mot skjuvflödet efter 48 timmars odling.Fluorescensavbildning utfördes med användning av konfokalmikroskopi, vilket indikerar att endotelcellerna bildar en komplett tredimensionell lumen i bMFA En neutrofil vidhäftningskarta erhölls, vilket avslöjade att det finns signifikant vidhäftning av neutrofiler till endotelceller i bMFA. Neutrofil migrationskarta i bMFA avslöjade att vid TNF-alfa-aktivering sker betydande migration av neutrofiler inuti vävnadsfacket, medan ingen sådan migration observerades utan TNF-alfa-aktivering. En vidhäftningskarta som korrelerade den rumsliga fördelningen av neutrofiler med skjuvhastigheten visade att neutrofil vidhäftning företrädesvis inträffade i kärl med låg skjuvhastighet och nära bifurkationsregioner.Vidare ökar TNF-alfa-behandling signifikant vidhäftningen, vilket hämmades med PKC-deltahämmaren. Analys av tidsfördröjningsbilder indikerade att TNF-aktivering av endotelceller ökar neutrofilmigrationen som svar på fMLP, medan behandling med PKC-deltahämmaren minskade migrationen jämfört med TNF-alfa-behandlade celler. Således kan bMFA användas för att testa effekten av en ny terapeutisk för behandling av inflammatorisk sjukdom.BMFA kan också användas för att studera endotelintegriteten genom att mäta variabler som permeabilitet och transendotelial elektrisk resistans, det som kallas TEER och vidhäftningsmolekyluttryck under inflammation. Den biomimetiska mikrofluidiska analysen kan efterlikna mikromiljön hos olika organ och är inte begränsad till enskilda celltyper eller arter, och kan också modellera cell/ cellkommunikation som är kritisk för organfunktion och modellering av olika sjukdomar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design av en cyklisk tryck Bioreaktor för Ex vivo Studie av Aorta hjärtklaffar

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Konstruera en låg budget Laser Axotomy systemet studerar Axon Regeneration i C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Ett experimentellt system för att studera Mechanotransduction i fetal lunga Celler

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Microfabrication av nanoporösa Guld Mönster för Cell-material interaktionsstudier

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Bedöma leukocytbindande endotel interaktioner Under flödesförhållandena i ett<em&gt; Ex vivo</em&gt; Autoperfused mikroflödes Chamber analys

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Concentric Gel system att studera den Biofysikalisk roll Matrix mikromiljö på 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Levande cell imaging under mekanisk Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion av definierade mänskliga Engineered hjärtvävnader att studera mekanismer för Cardiac Cellterapi

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

En mikroflödessystem med Surface Mönstring för utredning Kavitation Bubble (s) -cell Interaktion och den resulterande bioeffekter vid encelliga nivå

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

DNA nanorör som ett mångsidigt verktyg för att studera Semiflexible polymerer

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...