Name: analyzing the parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human &#945;-synuclein
Uploaded: 2022-07-29T13:00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human ÃŽÂ±-Synuclein at JoVE.com

Vi takker Dr. Sebastián Valenzuela og Dr. Micaela Ricca for deres værdifulde veterinære bistand i vores dyreanlæg. Dette arbejde blev støttet af "Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID" Centro Ciencia & Vida, FB210008 (til Fundación Ciencia & Vida) og Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, FONDAP-15150012. Dette arbejde blev også finansieret af tilskud FONDECYT-1210013 (til R.P.) og FONDECYT-1150766 (til F.C.) fra "Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID)" og MJFF-10332.01 (til R.P.) og MJFF-17303 (til F.C.) fra Michael J Fox Foundation for Parkinson's Research.

Alle undersøgelser blev udført under den 8. udgave af Vejledningen for Pleje og Anvendelse af Forsøgsdyr. Eksperimentelle protokoller blev godkendt af IACUC ved Fundación Ciencia & Vida (Science for Life Foundation), herunder dem, der involverer anæstesi, smerte, nød og eutanasi (tilladelsesnummer P-035/2022).
1. Den stereotaksiske kirurgi
<ol><li>Forberedelse til operationen (ca. 1 time)<ol>
<li>For at opretholde et aseptisk miljø skal du bære passende kirurgisk tøj under hele operationen, herunder skoomslag, en kirurgisk maske, en sanitær barriere, handsker og en kirurgisk hætte.</li>
		<li>Sprøjt 70% ethanol på musen og alt det kirurgiske materiale for at opretholde et aseptisk miljø.</li>
		<li>For at fremkalde analgesi skal musen injiceres med carprofen 5 mg/kg subkutant (s.c.) hver 12. time21 startende 1 time før operationen og fortsætter indtil 3 dage efter operationen.</li>
		<li>For at anæstesiere musen skal du placere dyret i et induktionskammer. Åbn isofluranstrømmen med en hastighed på 0,5%, og øg den derefter langsomt op til 5% over ca. 5 minutter, indtil musen har mistet sinretterefleks 22.</li>
		<li>Fjern dyret fra induktionskammeret. Overfør straks dyret til et ikke-rebreathing kredsløb med en passende størrelse næsekegle. Oprethold museanæstesien med isofluran 1% gennem hele operationens tid.</li>
		<li>Bekræft, at musen er helt aetiseret ved at klemme halen og poterne. Når musen ikke reagerer på at klemme halen og poterne, betyder det, at musen er fuldstændigt anæstesi.</li>
		<li>Barber musens hoved ved hjælp af en saks. Rengør musens hud ved hjælp af en vatpind med chlorhexidin 2% og fjern alt håret.</li>
		<li>Fastgør musens hoved i den stereotaksiske ramme.</li>
		<li>Placer et hornhindebeskyttelsesmiddel i begge museøjne ved hjælp af en vatpind. For at forhindre stressinduktion hos andre gnavere skal du undgå tilstedeværelsen af enhver anden mus i operationsstuen23.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Operationen (ca. 30 min)<ol>
<li>Rengør musens hoved med tre runder 2% chlorhexidin efterfulgt af 70% ethanol. Udsæt kraniet ved hjælp af kirurgisk materiale og lav et tyndt hul med en boremaskine på følgende koordinater: anteroposterior -2,8 mm og mediolateral 1,4 mm i forhold til den mediale linje.</li>
		<li>Sæt nålen på en 10 μL sprøjte i hullet og bevæg nålen inde i hjernen langsomt, indtil den ankommer til -7,2 mm dorsoventral i forhold til dura24.</li>
		<li>Lad nålen stå i slutposition i 2 minutter for at lade vævet sætte sig lidt, og injicer derefter 1 μL AAV5-CBA-hαSyn (AAV-hαSyn), AAV5-CBA-eGFP (AAV-GFP) eller køretøj (PBS ved pH 7,4; sham kirurgi) i højre substantia nigra med en hastighed på 0,2 μL/ 30 s.</li>
		<li>Lad nålen stå i samme position i 5 minutter efter levering af virale vektorer, og træk den derefter langsomt ud.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Efter operationen (ca. 5 min)<ol>
<li>Luk såret ved hjælp af en steril silkeflettet ikke-absorberbar sutur.</li>
		<li>Sæt musen i hjemmeburet forvarmet ved at placere den over en elektrisk opvarmet madras (25 °C). BEMÆRK: Musen skal holdes alene i hjemmeburet, indtil den er i stand til at gå uden problemer, og såret er helet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bestemmelse af motorens ydeevne ved hjælp af stråleprøvningen
<ol><li>Træning (ca. 15 min pr. mus)<ol>
<li>Tolv uger efter stereotaksisk kirurgi vurderes motorens ydeevne ved hjælp af en forenklet version af stråletesten beskrevet før25. Til dette formål skal du bruge en vandret bjælke på 25 cm i længden og 3 cm i bredden. Bjælkeoverfladen skal være dækket af et metallisk gitter med firkanter på 1 cm og forhøjet 1 cm over strålen.</li>
		<li>Tag en video af musen, der krydser gitteroverfladestrålen fra den ene ende til den modsatte ende af strålen, hvor hjemmeburet er placeret. Træn musen i 2 dage før bestemmelse af motorens ydeevne.</li>
		<li>På den første dag skal du træne musen til at gå gennem strålen fem gange uden gitteret.</li>
		<li>På den anden dag skal du træne musen til at gå gennem strålen i nærværelse af gitteret fem gange.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Testen (ca. 5 min pr. mus)<ol>
<li>På den tredje dag skal du evaluere motorens ydeevne. For at gøre dette skal du kvantificere antallet af fejl, der udføres af venstre poter eller af de højre poter separat ved at se videoerne i slowmotion-tilstand. BEMÆRK: En fejl defineres som når en pote ikke træder korrekt på gitteret og derfor bliver synlig på siden af gitteret eller mellem gitteret og stråleoverfladen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vævsbehandling
<ol><li>Transkardial perfusion (ca. 15 min pr. mus)<ol>
<li>For at bistøble musen skal du injicere en blanding af ketamin (80 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) intraperitonealt (i.p.) ved hjælp af en 1 ml sprøjte og 27 G nål26.</li>
		<li>Når musen er fuldstændigt anæstesi (bekræftet som i trin 1.1.6.), skal du åbne brystkassen med kirurgisk materiale og udsætte hjertet.</li>
		<li>Indsæt derefter en 21 G nål (gør spidsen flad ved hjælp af en boremaskine) i hjertets venstre ventrikel.</li>
		<li>Ved at koble nålen til et rør perfuseres 50 ml PBS (pH 7,4) med en hastighed på 9,5 ml/min ved hjælp af en peristaltisk pumpe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fiksering og kryobeskyttelse af hjernen (ca. 10 min pr. hjerne)<ol>
<li>Fjern hjernen ved hjælp af en saks og pincet, og fastgør den derefter ved nedsænkning i 5 ml 4% paraformaldehyd i PBS (pH 7,4) ved 4 ° C i 24 timer.</li>
		<li>Derefter sættes den faste hjerne i 15 ml 30% saccharose ved 4 ° C i 48 timer.</li>
		<li>Sæt derefter hjernen i 4 ml kryobeskyttelsesopløsning (20% glycerin og 2% DMSO i PBS) og spar hjernen ved -80 ° C eller brug den straks i næste trin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opnåelse af hjerneskiver (ca. 20 min pr. Hjerne). BEMÆRK: Sørg for, at hjernen er placeret i en kryostat i en ordentlig position for at foretage koronale nedskæringer.<ol>
<li>For at opnå SN-skiver skal du skære hjernen i 40 μm tykke sektioner, der starter ved -2,92 mm og slutter ved -3,64 mm24.</li>
		<li>Hver skive høstes i en brønd (indeholdende 1 ml kryobeskyttelsesopløsning) af en plade med 24 brønde efter en anteroposterior rækkefølge som beskrevet før 25,27,28.</li>
		<li>For at udføre immunohistokemiske (punkt 4.) og immunofluorescensanalyser (punkt 5.) i SN skal du vælge seks koronale SN-sektioner taget med ensartede intervaller (120 μm), der dækker hele kernens rostrocaudale udstrækning (720 μm i alt) som beskrevet før 25,27,28.</li>
		<li>For at opnå striatale skiver skal du skære hjernen i 40 μm tykke sektioner, der starter ved +1,34 mm og slutter ved -0,26 mm24.</li>
		<li>Høst hver skive i en 2 ml kryotube (indeholdende 1 ml kryobeskyttelsesopløsning) efter en anteroposterior rækkefølge.</li>
		<li>For at udføre immunohistokemiske (punkt 4.) og immunofluorescensanalyser (punkt 5.) i striatum skal du vælge fem koronale striatale sektioner taget med ensartede intervaller (320 μm), der dækker hele kernens rostrocaudale udstrækning (1600 μm i alt).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Immunohistokemisk analyse for at kvantificere dopaminerge neuroner og mikrogliose (ca. 2 dage)
<ol><li>Til immunohistokemisk analyse af striatale eller nigrale skiver skal du placere sættet med fem (striatum) eller seks (SN) skiver fra samme hjerne i en brønd på en 24-brønds plade.</li>
	<li>Sektionerne vaskes 3x med 1 ml PBS og inkuberes derefter med 0,5 ml 0,03 %H202i methanol ved stuetemperatur og med omrøring i 30 minutter for at inaktivere endogen peroxidaseaktivitet.</li>
	<li>Vask sektionerne 3x med 1 ml PBS og inkuber med 0,5 ml blokerende opløsning (4% gedeserum, 0,05% Triton X-100 og 4% BSA i PBS) ved stuetemperatur og med omrøring i 40 minutter.</li>
	<li>Derefter inkuberes med 0,5 ml blokerende opløsning indeholdende det primære antistof (kaninanti-tyrosinhydroxylase [TH] pAb fortyndet 1:1000 [se tabel 1]; eller kaninanti-Iba1-antistof fortyndet 1:1000) ved stuetemperatur og med omrøring natten over.</li>
	<li>Sektionerne vaskes 3x med 1 ml PBS og inkuberes med 0,5 ml blokerende opløsning indeholdende biotinyleret gede-antikanin pAb (1:500, se tabel 1) ved stuetemperatur og med omrøring i 2 timer.</li>
	<li>Derefter vaskes sektionerne 3x med 1 ml PBS og inkuberes med 0,5 ml peroxidasekonjugeret avidin (1:5000, se tabel 1) i blokerende opløsning ved stuetemperatur og med omrøring i 90 minutter.</li>
	<li>Sektionerne vaskes 3x med 1 ml PBS og inkuberes med 0,5 ml substratopløsning (0,05 % diaminobenzidin i 0,03 %H202/Trizma-HCl-buffer ved pH 7,6). Brug handsker og en laboratoriefrakke til dette trin, da diaminobenzidin er et potentielt kræftfremkaldende stof.</li>
	<li>Når den specifikke farvning er tydelig (typisk 30 sek. for TH og 5 min for Iba1), skal du tage substratopløsningen ud og vaske sektionerne 3x med 1 ml PBS ved stuetemperatur og med omrøring. Udfør altid immunstaining af skiver af alle de hjerner, der indgår i det samme eksperiment samtidigt. BEMÆRK: Den specifikke farvning af TH er tydelig, når TH-immunfarvning forekommer i SN-området, som viser en karakteristisk form i hjernen. Det specifikke mærke af Iba1 bestemmes, når Iba1-immunstaining vises på kontrolhjerneskiver med typiske mikrogliale former, som bekræftes ved mikroskopobservation. På denne måde bestemmes det nøjagtige tidspunkt for substrateksponering for IHC-analyse for hvert enkelt eksperiment.</li>
	<li>Monter hjernesektionerne på glasrutschebaner ved hjælp af en opløsning af 0,2% gelatine i 0,05 M Tris (pH 7,6). Placer hvert sæt af fem (striatum) eller seks (SN) skiver opnået fra den samme hjerne i rostrocaudal rækkefølge på det samme glas dias.</li>
	<li>Kvantificer antallet af TH + neuroner i SN.<ol>
<li>For at kvantificere TH + neuroner i SN skal du erhverve fotos af de seks skiver ved 20x forstørrelse ved hjælp af et lysfeltmikroskop, som beskrevet før 25,27,28. Brug følgende farvejustering: farvetemperatur 3200 K, cyanrød 40%, magentagrøn 39%, gulblå 54%, gamma 0,5, kontrast 37, lysstyrke 13, mætning 5.</li>
		<li>Brug Image J-softwaren til at vælge omkredsen af SN pars compacta på den analyserede halvkugle. Undgå udvælgelse af TH + neuroner fra det ventrale tegmentale område (VTA).</li>
		<li>Bed derefter softwaren om at beregne det valgte område (typisk 0,04-0,07 mm2 / halvkugle, afhængigt af den rostrocaudale position). Brug derefter multipunktværktøjet til at mærke hver enkelt TH + neuron med en prikke.</li>
		<li>Brug punktværktøjet til at bede softwaren om at tælle det samlede antal prikker. Med antallet af samlede prikker (TH + neuroner) og arealet af SNpc beregnes densiteten af TH + neuroner / mm2.</li>
		<li>Gentag den samme beregning i begge halvkugler på de seks SN-skiver og beregn derefter gennemsnittet af TH+ neuroner/mm2 på de ipsilaterale og de kontralaterale sider.</li>
	</ol></li>
	<li>Kvantificering af antallet af aktiverede mikroglia i striatum<ol>
<li>For at kvantificere aktiveret mikroglia i striatum skal du erhverve to fotos på hver halvkugle for alle fem striatale skiver ved 20x forstørrelse ved hjælp af et lysfeltmikroskop og de samme indstillinger angivet i trin 4.10.1. Ved hjælp af Image J-softwaren skal du i hvert enkelt foto (der viser et område på 660 μm x 877 μm) mærke med en prik hver enkelt celle, der udtrykker høj Iba1-intensitet og ameboidform ved hjælp af multipunktværktøjet. Brug punktværktøjet til at bede softwaren om at tælle det samlede antal prikker.</li>
		<li>Med antallet af samlede prikker og fotoets areal beregnes densiteten af aktiveret microglia (Iba1høje celler /mm2) som udført før29.</li>
	</ol></li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Mål antigen</td>
			<td>Koblet til</td>
			<td>Klonalitet</td>
			<td>Vært specie</td>
			<td>Specie reaktivitet*</td>
			<td>Fortynding**</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tyrosinhydroxylase</td>
			<td>Nielsen</td>
			<td>Polyklonal</td>
			<td>Kanin</td>
			<td>Mus, Rotte, Menneske</td>
			<td>1/200 - 1/1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iba1</td>
			<td>Nielsen</td>
			<td>Monoklonalt</td>
			<td>Kanin</td>
			<td>Mus, Rotte, Menneske</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>alpha-Synuclein</td>
			<td>Nielsen</td>
			<td>Monoklonalt</td>
			<td>Kanin</td>
			<td>Menneskelig</td>
			<td>1/150</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>Nielsen</td>
			<td>Monoklonalt</td>
			<td>Rotte</td>
			<td>Mus</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG (H+L)</td>
			<td>Biotinileret</td>
			<td>Polyklonal</td>
			<td>Ged</td>
			<td>Kanin</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG (H+L)</td>
			<td>AlexaFluor 546</td>
			<td>Polyklonal</td>
			<td>Ged</td>
			<td>Kanin</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG (H+L)</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>Polyklonal</td>
			<td>Ged</td>
			<td>Kanin</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG (H+L)</td>
			<td>AlexaFluor 546</td>
			<td>Polyklonal</td>
			<td>Ged</td>
			<td>Rotte</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Antistoffortyndinger. N/A, ikke relevant. *, Det er kun specificeret, hvis der er genaktiviteter med mus, rotte og mennesker, uanset reaktiviteten med andre arter. **, Der er angivet et enkelt fortyndings- eller fortyndingsområde.
5. Immunofluorescensanalyse til evaluering af T-celleinfiltration i nigrostriatalvejen (ca. 2 dage)
<ol><li>Til immunofluorescensanalyse af hαSyn eller TH / GFP på striatale eller nigrale skiver skal du sammensætte sættet med fem (striatum) eller seks (SN) skiver fra samme hjerne i en brønd i en 24-brønds plade.<ol>
<li>Vask sektionerne 3x med 1 ml PBS og inkuber derefter med 0,5 ml blokerende opløsning (0,3% Triton X-100, 0,05% tween20 og 5% BSA i PBS) ved stuetemperatur og med omrøring i 40 minutter.</li>
		<li>Derefter inkuberes med 0,5 ml blokerende opløsning indeholdende det primære antistof (kaninanti-TH pAb fortyndet 1:500; eller kaninanti-hαSyn-antistof fortyndet 1:150, se tabel 1) ved stuetemperatur og med omrøring natten over.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sektionerne vaskes 3x med 1 ml PBS og inkuberes med 0,5 ml blokerende opløsning indeholdende AlexaFluor546-koblet antikanin sekundært antistof (1:500, se tabel 1) og 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI; 1:1000) ved stuetemperatur og med omrøring i 2 timer. Vask derefter sektionerne 3x med 1 ml PBS.</li>
	<li>Monter hjernesektionerne på glasrutsjebaner som beskrevet ovenfor (trin 4.9.). Billeder blev erhvervet med et omvendt fluorescensmikroskop koblet til en strømforsyningsenhed.</li>
	<li>Til immunofluorescensanalyse af TH / CD4 / GFP (Foxp3) på nigralskiver skal du placere sættet med seks (SN) skiver fra den samme hjerne i en brønd i en 24-brønds plade. Vask sektionerne 3x med 1 ml PBS og inkuber derefter med 0,5 ml blokerende opløsning (0,5% Triton X-100, 0,5% fiskeskindgelatine i PBS) ved stuetemperatur og med omrøring i 2 timer.</li>
	<li>Inkuber med 0,5 ml blokerende opløsning indeholdende de primære antistoffer kanin anti-TH pAb (1:200, se tabel 1) og rotte anti-CD4 (1:250) ved 4 °C og med omrøring natten over.</li>
	<li>Sektionerne vaskes 3x med 1 ml PBS og inkuberes med 0,5 ml blokerende opløsning indeholdende antikanin koblet til AlexaFluor 647 (1:500, se tabel 1) og anti-rotte koblet til AlexaFluor 546 (1:500) ved stuetemperatur og med omrøring i 2 timer. Vask derefter sektionerne 3x med 1 ml PBS.</li>
	<li>Sæt hvert sæt af seks (SN) skiver fra den samme hjerne i rostrocaudal rækkefølge på det samme glasglas, og monter dem ved hjælp af Fluoromount G. Hent billeder ved hjælp af et Leica DMi8-mikroskop. Brug de konfokale mikroskopindstillinger, der er angivet i tabel 2 , til at hente billeder fra immunofluorescensanalyse.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Chanel navn</td>
			<td>Terning</td>
			<td>Emission Wavelenght</td>
			<td>Navn på opslagstabel</td>
			<td>Eksponeringstid</td>
			<td>Vinde</td>
			<td>Opløsning XY</td>
			<td>Opløsning Z</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanal 1</td>
			<td>Y5</td>
			<td>700nm</td>
			<td>Grå</td>
			<td>1.011.727 ms</td>
			<td>høj brøndkapacitet</td>
			<td>2.237 Umm</td>
			<td>24.444 Umm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanal 2</td>
			<td>GFP</td>
			<td>525nm</td>
			<td>Grøn</td>
			<td>326.851 ms</td>
			<td>høj brøndkapacitet</td>
			<td>2.237 Umm</td>
			<td>24.444 Umm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanal 3</td>
			<td>TXR</td>
			<td>630nm</td>
			<td>Rød</td>
			<td>406.344 ms</td>
			<td>høj brøndkapacitet</td>
			<td>2.237 Umm</td>
			<td>24.444 Umm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanal 4</td>
			<td>Dapi</td>
			<td>460nm</td>
			<td>Blå</td>
			<td>91.501 ms</td>
			<td>høj brøndkapacitet</td>
			<td>2.237 Umm</td>
			<td>24.444 Umm</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Konfokale mikroskopindstillinger, der anvendes til erhvervelse af billeder fra immunofluorescensanalyse.
6. Statistisk analyse
<ol><li>For at sammenligne data opnået fra de ipsilaterale og de kontralaterale sider skal du bruge en parret to-halet studerendes t-test.</li>
	<li>For at sammenligne data opnået fra mus, der modtager AAV-hαSyn, og fra mus, der modtager AAV-GFP eller sham-kirurgi, skal du bruge en uparret to-halet studerendes t-test. Overvej betydelige forskelle, når P-værdier < 0,05.</li>
</ol>

Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af økonomiske eller ikke-finansielle konkurrerende interesser.

Musemodellen for neurodegeneration, der analyseres her, kan hjælpe med at studere mange kritiske aspekter involveret i patofysiologien af Parkinsons sygdom, herunder de mekanismer, der er involveret i αSynpatologi og mikroglial aktivering, inddragelsen af det perifere immunsystem i reguleringen af neuroinflammation og mekanismerne for neurodegeneration. Blandt de mekanismer, der er involveret i αSyn-patologi, er de subcellulære mekanismer forbundet med mitokondriel, lysosomal eller proteasomal dysfunktion i nærvær af en overdreven belastning af αSyn i de dopaminerge neuroner i SN2. Det er vigtigt at overveje, at ud over hαSyn-ekspressionen induceret af AAV-medieret transduktion bidrager den endogene mus αSyn også til belastningen af det samlede αSyn-udtryk. Transgene mus, der overudtrykker mus αSyn, udvikler lignende synucleinpatologi, neuropatologi og motorisk svækkelse som disse musemodeller baseret på overekspression af hαSyn32. Med hensyn til mikroglial aktivering kan den nuværende musemodel bruges til at undersøge, hvordan forskellige molekylære og cellulære aktører såsom cytokiner, neurotransmittere, astrocytter, neuroner, blod-hjerne-barrieren og T-celler kan regulere erhvervelsen af proinflammatoriske eller antiinflammatoriske funktionelle fænotyper 8,10,11 . Denne model udgør også et vigtigt redskab til at studere det perifere immunsystems rolle, herunder ikke kun T-celler, men også makrofager, monocytter og neutrofiler, på processerne for neuroinflammation og neurodegeneration af nigrale neuroner 11,33,34. Endelig repræsenterer denne musemodel også et værdifuldt system til at studere de cellulære og molekylære mekanismer for neurodegeneration in vivo, herunder dem, der induceres af interne cellulære processer, såsom oxidativ stress, energiunderskud og beskadigede organeller 2, eller dem, der udøves af eksterne aktører, såsom neurotoksiske faktorer produceret af mikrogliaceller, astrocytter og cytotoksiske T-celler8, 28,29,35.
En begrænsning af denne musemodel er undersøgelsen af, hvordan den patologiske aggregering af αSyn på ekstra-cerebrale steder kan udgøre de indledende faser i udviklingen af Parkinsons sygdom36. I denne henseende er der voksende beviser, der tyder på, at før neurodegenerationen af nigralneuroner og motorisk svækkelse begynder αSynpatologi i tarmslimhinden og det olfaktoriske epitel36 og sandsynligvis også det αSyn-specifikke T-cellerespons12. Bagefter ville αSyn-aggregater migrere gennem vagusnerven til hjernestammen, hvilket udløste neuroinflammation og neurodegeneration af dopaminerge neuroner12. Selvom AAV-hαSyn-modellen rekapitulerer de fleste aspekter af Parkinsons sygdom, er der ingen tydelig involvering af den patologiske aggregering af αSyn på ekstra-cerebrale steder i denne model. En alternativ model, der involverer hαSyn-patologi, der er egnet til at studere disse aspekter af Parkinsons sygdom, kan være transgene mus, der overudtrykker hαSyn under kontrol af Thy1-promotoren, Thy1-SNCA-modellen 37, hvor sygdomsudvikling er afhængig af tarmmikrobiotaen og involverer en tydelig gastrointestinal svækkelse38.
Selvom det er nyttigt til undersøgelsen af de forskellige processer, der er forbundet med patofysiologien af Parkinsons sygdom, involverer den nuværende musemodel kritiske trin, der skal kontrolleres minutiøst, herunder korrekt levering af de virale vektorer i de tilsvarende rumlige koordinater, den selektive ekspression af hαSyn i neuroner (hvilket afhænger af AAV-serotypen og vektorkonstruktionen), og den korrekte AAV-dosis og timing, før du analyserer Parkinsons fænotype. Analysen af den korrekte levering af de virale vektorer i SN er nødvendig, da brugen af de korrekte rumlige koordinater for SN muligvis ikke er nok, når nålen ikke er helt lige, hvilket undertiden er umærkeligt for det menneskelige øje. Desuden afhænger diffusionen af AAV-vektorerne af AAV-serotype39. Af disse grunde er det nødvendigt at udføre periodiske kvalitetskontroller, der kontrollerer den korrekte levering og diffusion af de injicerede AAV-GFP-vektorer efter observation af GFP i hjerneskiver, der indeholder SN-området.
Med hensyn til den selektive ekspression af hαSyn i neuroner kunne ekspressionen af hαSyn i princippet konstrueres til at blive kontrolleret af en promotor, der er selektiv for neuroner eller, endnu mere præcis, selektiv for dopaminerge neuroner, såsom brugen af TH-promotoren i AAV-vektorer til at inducere den selektive ekspression af gener i dopaminerge neuroner40 . Denne strategi virker imidlertid ikke, når det, der søges, er overekspression af genet af interesse. Af denne grund er det i den nuværende model vigtigt at anvende en stærk promotor (en promotor, der inducerer høj ekspression af downstream-genet) og AAV-serotyper med neuronal tropisme. I denne undersøgelse blev CBA-promotoren brugt som en stærk promotor til at inducere overekspression af hαSyn, og AAV5-serotypen blev anvendt til den virale vektor. Denne serotype er tidligere blevet brugt til at transducere muse- ogrotteneuroner 41,42. Her viste resultaterne, at 12 uger efter leveringen af AAV5-GFP i musens SN var den grønne fluorescens selektivt til stede på den ipsilaterale side af både SN og striatum (figur 1), hvilket indikerer den effektive transduktion af neuroner i den nigrostriatale vej.
Et andet kritisk aspekt af denne musemodel af Parkinsons sygdom er det tidspunkt, der kræves for at analysere en bestemt proces efter operationen. I denne henseende viser dette arbejde en kinetisk undersøgelse af forskellige processer involveret i patologien. Da vigtige tidspunkter ændrer sig med den dosis af virale genomer, der gives pr. mus, blev serotypen af AAV anvendt, eller endda med det anvendte parti AAV, først udført en dosis-respons-analyse af mængden af AAV-αSyn, der kræves for at inducere et signifikant tab af TH + neuroner og motorisk svækkelse. Tidligere undersøgelser har vist signifikant motorisk svækkelse og et tab af TH+ neuroner i den nigrostriatale vej efter 12 ugers AAV-αSyn-injektioner i mus i doser fra 6 x 108-3 x 1010 virale genomer pr. mus 16,17,30,31. Følgelig varierede dosis af AAV-hαSyn, der blev anvendt til at inducere hαSyn-ekspressionen i den nigrostriatale vej, tabet af TH+ neuroner og motorisk svækkelse hos mus fra 1 x 108-1 x 1010 virale genomer pr. Mus. For at kontrollere, at tabet af TH + neuroner og motorisk svækkelse blev induceret af overekspression af hαSyn i SN og ikke ved AAV-infektion af neuroner i SN, blev kontrolgrupper inkluderet, hvor AAV-kodning for et reportergen (AAV-eGFP) blev leveret ensidigt i SN af mus, og neurodegeneration og motorisk svækkelse blev bestemt. Resultaterne viste, at 1 x 1010 virale genomer pr. mus 12 uger efter stereotaksisk kirurgi var en korrekt dosis AAV5-hαSyn, da mus, der modtog denne virale belastning, viste signifikant hαSyn i den nigrostriatale vej (figur 2 og figur 3), tab af TH + neuroner (figur 4) og motorisk svækkelse (figur 5). I modsætning hertil var lavere doser af AAV5-hαSyn (1 x 108 virale genomer pr. mus og 1 x 109 virale genomer pr. mus) ikke stærke nok til at nå signifikante ændringer i alle disse parametre tilsammen (figur 2-4). Bemærk, at administrationen af AAV-GFP ved 1 x 1010 virale genomer pr. Mus inducerede en lav (~ 20%), men signifikant grad af tab af TH + neuroner af nigral dopaminerge neuroner (figur 4A, B). Dette resultat stemmer overens med tidligere observationer ved hjælp af denne model41 og er sandsynligvis konsekvensen af et lavt niveau af neuroinflammation induceret af administrationen af AAV-vektorer i SN. Ikke desto mindre var omfanget af tab af TH+-neuroner signifikant højere hos mus, der fik AAV5-hαSyn sammenlignet med dem, der fik samme dosis AAV-GFP (figur 4C). Det bemærkes, at kinetikken af hαSyn-ekspression ikke kun afhænger af effektiviteten af transduktion, men også af omfanget af AAV-diffusion39. Da AAV-diffusion afhænger af AAV-serotypen, kan de præcise nøgletidspunkter i denne dyremodel variere, når der anvendes en anden AAV-serotype, der er forskellig fra AAV5.
Derefter blev der udført en kinetisk analyse ved hjælp af 1 x 1010 virale genomer pr. Mus for at bestemme vigtige tidspunkter i denne musemodel. Da de nuværende beviser har vist nogle tidlige symptomer, der vises før motorisk svækkelse, hvilket ville muliggøre tidlig diagnose af Parkinsons sygdom43,44, forsøgte disse eksperimenter at finde det tidspunkt, hvor hαSyn-ekspression allerede var tydelig, men i mangel af motorisk svækkelse. Resultaterne viser, at starten på hαSyn-ekspression i SN var 5 uger efter den stereotaksiske levering af AAV-hαSyn (figur 6). Dette tidspunkt udgør et interessant tidsmæssigt punkt at begynde at administrere terapier, der er skræddersyet til at stoppe de neuroinflammatoriske og neurodegenerative processer. Andre vigtige tidspunkter, der blev bestemt her, var spidsbelastningstiderne for to kritiske hændelser forbundet med neuroinflammationsprocessen: det tidspunkt, hvor mikroglia når den maksimale grad af aktivering og tidspunktet for maksimal T-celleinfiltration i SN. Resultaterne viste en kurve med en tendens, der nåede to bølger af maksimal mikroglial aktivering, den første 10 uger efter operationen og den anden 15 uger efter operationen (figur 7). Den kinetiske analyse af T-celleinfiltration viste spidsbelastningstiden for Treg-infiltration i SN 11 uger efter stereotaksisk kirurgi (figur 8). Overraskende nok blev der ikke påvist nogen effektor T-celler (CD4 + Foxp3-), der infiltrerede SN i løbet af den analyserede tidsramme (uge 8-13 efter operationen). Alt i alt tyder disse resultater på en passende tidsramme for at begynde at administrere terapier rettet mod at stoppe processen med neuroinflammation og dæmpe T-celleinfiltration i SN ved hjælp af denne prækliniske model, som varierer mellem uge 5 efter operationen (begyndelsen af hαSyn overekspression) og uge 10 efter operationen (den første bølge af neuroinflammation og T-celleinfiltration) (figur 9).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig09.jpg"> Figur 9: Oversigt over de vigtigste tidspunkter, der er fundet for denne dyremodel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig09large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Efter Alzheimers sygdom er Parkinsons sygdom den næstmest udbredte neurodegenerative sygdom på verdensplan. De primære neuroner, der er berørt af Parkinsons sygdom, er dem i den nigrostriatale vej, som producerer dopamin og styrer frivillig bevægelse. Som følge heraf er det mest karakteristiske symptom forbundet med denne lidelse motorisk svækkelse. Denne patologi involverer også aflejring af proteinaggregater i hjernen, som hovedsageligt består af α-synuclein (αSyn)1, et cytosolisk protein forbundet med præsynaptiske terminaler. Beviser har vist, at dannelsen af patogene indeslutninger af αSyn udløses af fejlfoldning eller af nogle posttranslationelle modifikationer af dette protein2.
Især er der etableret et tæt forhold mellem αSyn-patologi og tabet af dopaminerge neuroner i den nigrostriatale vej i human Parkinsons sygdom og dyremodeller 3,4. At forstå, hvordan αSyn-aggregater genereres, og hvordan de inducerer neuronal død, repræsenterer en betydelig udfordring på området. En voksende gruppe undersøgelser har vist, at mitokondriel dysfunktion ved at øge oxidativt stress er en af de vigtigste årsager til dannelsen af αSyn-aggregater2. Faktisk risikerer flere gener forbundet med Parkinsons sygdom proteiner involveret i mitokondriefunktion, morfologi og dynamik 5,6. Derudover udgør lysosomal dysfunktion, som resulterer i akkumulering af dysfunktionelle mitokondrier og forkert foldet αSyn, en anden vigtig begivenhed, der fremmer dannelsen af αSyn-aggregater7.
Nye beviser har vist, at når αSyn-aggregater er deponeret i hjernen, stimulerer disse patogene proteiner vejafgiftslignende receptorer (TLR'er) på mikrogliaen, hvilket udløser mikroglial aktivering og et indledende inflammatorisk miljø i substantia nigra (SN) 8,9. Desuden indikerer beviserne, at αSyn-aggregater fanges og præsenteres af antigenpræsenterende celler til T-celler, hvilket inducerer et adaptivt immunrespons, der er specifikt for αSyn10,11. Disse αSyn-specifikke T-celler infiltrerer efterfølgende hjernen og genformuleres af aktiveret mikroglia, hvilket fremmer udskillelsen af neurotoksiske faktorer, der fremkalder neuronal død 9,10. Interessant nok har flere bevislinjer antydet, at αSyn-aggregater genereres først i det enteriske nervesystem og derefter transporteres gennem vagusnerven til hjernestammen12.
Flere dyremodeller af Parkinsons sygdom er blevet anvendt i mange år, herunder dem, der er induceret ved administration af neurotoksiske stoffer (dvs. 6-hydroxydopamin, paraquat, rotenon, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin) og dem, der involverer genetiske tilstande (dvs. mutant α-synuclein, mutant leucinrig gentagelseskinase 2)13 . På trods af modeller, der involverer neurotoksinduceret neurodegeneration, der replikerer nogle aspekter af Parkinsons sygdom, rekapitulerer ingen af dem alle de væsentlige aspekter af sygdommen eller er ikke progressive13. På den anden side, selv om genetiske musemodeller, der involverer ekspression af mutante versioner af leucinrig gentagelseskinase 2, mutante versioner af α-synuclein eller overekspression af human vildtype α-synuclein resulterer i motorisk svækkelse og i nogle tilfælde også udvikling af synukleinopati, reproducerer de ikke fremtrædende neurodegeneration af de nigrale dopaminerge neuroner, hvilket er et væsentligt aspekt af Parkinsons sygdom13, 14. En tredje slags dyremodel for neurodegeneration har formået at opfylde de fleste af de væsentlige aspekter af Parkinsons sygdom, den stereotaksiske levering af adeno-associerede virale vektorer (AAV'er), der koder for den humane α-synuclein (AAV-hαSyn)14,15. Det er vigtigt, at AAV'er tillader transduktion af neuroner med høj effektivitet og på lang sigt i pattedyrs voksne hjerne. Desuden har den stereotaksiske levering af AAV-hαSyn i SN vist sig at reproducere mange af de væsentlige aspekter af sygdommen, herunder αSyn-patologi, mikroglial aktivering, neurodegeneration og motorisk svækkelse 16,17,18,19,20. Denne undersøgelse præsenterer en analyse af, hvordan dosis af viral vektor og tiden efter viral vektorlevering påvirker omfanget af hαSyn-ekspression, neurodegeneration og neuroinflammation i den nigrostriatale vej samt graden af motorisk svækkelse i musemodellen for ensidig stereotaksisk levering af hαSyn i SN.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANIMALS AND ANIMAL FOOD</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3-GFP C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td>
			<td>Stock No:&#160;023800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Rodent Diet</td>
			<td>LabDiet</td>
			<td>Rodent Diet 5001</td>
			<td>Standard Rodent diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td>
			<td>Stock No: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIRAL VECTORS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CBA-&#945;Syn</td>
			<td>University of Iowa Viral Vector Core Facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stock concentration at 10E13 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CBA-eGFP</td>
			<td>University of Iowa Viral Vector Core Facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stock concentration at 9.5 x 10E12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANESTHETICS AND ANALGESICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>218082</td>
			<td>1% for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Drag Pharma</td>
			<td>CHE30</td>
			<td>70 mg/Kg&#160; for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>VE2L9117</td>
			<td>For before transcardial perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tramadol</td>
			<td>Drag Pharma</td>
			<td>DPH134</td>
			<td>30 mg/Kg every 24 h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Centrovet</td>
			<td>EHL40</td>
			<td>9 mg/kg for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam test</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>horizontal beam 25 cm length and 3 cm width. The beam surface was covered by a metallic grid (1 cm2).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostate</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>S2800 Coolpix</td>
			<td>For recording the beam test performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Used for IHC analysis (section 4.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI8</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Standard Stereotaxic, mouse</td>
			<td>Stoelting, Wood Dale, IL, USA</td>
			<td>51500</td>
			<td>stereotaxic frame for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>C-flex L/S16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply unit</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-RFL-T</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suture</td>
			<td>Sylkam&#174;, B Braun</td>
			<td>C0760171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 100 U</td>
			<td>BD</td>
			<td>324918</td>
			<td>For anesthesia before transcardial perfusion, 29G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe RN 5uL SYR W/O NEEDLE</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>HA-7641-01</td>
			<td>For viral vector innoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUFFERS AND REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aviden, Peroxidase Conjugate</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>189728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotrotection buffer</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20% glycerine and 2% DMSO in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount -G T</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>104078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>5000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>104005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.125 M, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase inactivating buffer</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.03% H2O2 in methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Hydrochloride</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>822184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>111065003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-alpha-Synuclein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-Iba-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR16588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Prism</td>
			<td>6.0</td>
			<td>Fos stats analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image capture with Leica microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProgRes Capture Pro</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image capture with Olympus microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VLC media player</td>
			<td>VideoLAN Organization</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For analysis of behavioural tests</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human &#945;-synuclein

Parkinsons sygdom er en neurodegenerativ lidelse, der involverer døden af de dopaminerge neuroner i den nigrostriatale vej og følgelig det progressive tab af kontrol over frivillige bevægelser. Denne neurodegenerative proces udløses af aflejring af proteinaggregater i hjernen, som hovedsageligt består af α-synuclein. Flere undersøgelser har vist, at neuroinflammation er nødvendig for at udvikle neurodegeneration forbundet med Parkinsons sygdom. Især involverer den neuroinflammatoriske proces mikroglial aktivering såvel som infiltration af perifere T-celler i substantia nigra (SN). Dette arbejde analyserer en musemodel af Parkinsons sygdom, der rekapitulerer mikroglial aktivering, T-celleinfiltration i SN, neurodegeneration af nigrale dopaminerge neuroner og motorisk svækkelse. Denne musemodel af Parkinsons sygdom induceres af stereotaxisk levering af adeno-associerede virale vektorer, der koder for den humane vildtype α-synuclein (AAV-hαSyn) i SN. Den korrekte levering af virale vektorer i SN blev bekræftet ved hjælp af kontrolvektorer, der koder for grønt fluorescerende protein (GFP). Derefter blev det evalueret, hvordan dosis af AAV-hαSyn administreret i SN påvirkede omfanget af hαSyn-ekspression, tabet af nigrale dopaminerge neuroner og motorisk svækkelse. Desuden blev dynamikken i hαSyn-ekspression, mikroglial aktivering og T-celleinfiltration bestemt i hele sygdomsudviklingens forløb. Således giver denne undersøgelse kritiske tidspunkter, der kan være nyttige til at målrette synucleinpatologi og neuroinflammation i denne prækliniske model af Parkinsons sygdom.

Validering af korrekt levering af AAV-vektorer i de dopaminerge neuroner i den nigrostriatale vej For at studere processerne for neuroinflammation, neurodegeneration og motorisk svækkelse fremmet af synucleinpatologi blev der anvendt en musemodel af Parkinsons sygdom induceret af den ensidige stereotaksiske levering af AAV-kodning af hαSyn i SN 16,17,30,31 (se det eksperimentelle design i supplerende figur 1 ). For at validere den korrekte levering af AAV-vektorer i de dopaminerge neuroner i den nigrostriatale vej blev AAV-kodende GFP (AAV-GFP) injiceret i SN, og 12 uger senere blev GFP-fluorescens og tyrosinhydroxylase (TH) immunoreaktivitet analyseret i SN og striatum ved immunofluorescens. Den GFP-associerede fluorescens blev udelukkende observeret på den ipsilaterale side, og der var signifikant colokalisering med TH-immunreaktivitet i både SN og striatum, hvilket indikerer den korrekte levering af AAV-vektorer i de dopaminerge neuroner i nigrostriatalvejen (figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig01.jpg"> Figur 1: Analyse af leveringen af AAV-GFP i den nigrostriatale vej. Mus modtog AAV-GFP (1 x 1010 vg/mus) og blev 12 uger senere ofret, og TH blev immunplettet i (A) SN (skalastænger er 118 μm) og (B) striatum (skalastænger er 100 μm). TH- og GFP-associeret fluorescens blev analyseret ved epifluorescensmikroskopi. Kerner blev farvet med DAPI. Repræsentative billeder af flettet eller enkelt farvning af TH (rød), GFP (grøn) og DAPI (blå) vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Opsætning af dosis af viral vektor administreret for at inducere neurodegeneration og motorisk svækkelse i musemodellen af Parkinsons sygdom induceret af AAV-hαSyn For at teste den dosis AAV-hαSyn, der kræves for at fremkalde en signifikant overekspression af hαSyn, der fremmer neurodegeneration af de nigrale dopaminerge neuroner, blev forskellige doser (1 x 108 virale genomer [vg]/mus, 1 x 109 vg/mus eller 1 x10 10 vg/mus) af AAV-hαSyn injiceret, og 12 uger senere blev hαSyn-immunreaktivitet og omfanget af TH-immunreaktivitet evalueret i den nigrostriatale vej. Selv om hαSyn-immunreaktiviteten var tydelig med alle doser, der blev testet i SN (figur 2), var det kun mus, der fik 1 x10 10 vg/mus, der viste tydelig hαSyn-immunreaktivitet i striatum (figur 3). Desuden viste mus, der modtog 1 x10 10 vg / mus af AAV-hαSyn, et signifikant tab af dopaminerge neuroner i SN (figur 4A, B). Selvom mus, der fik 1 x10 10 vg/mus af AAV-GFP, udviste en lav grad (~20%) af neuronalt tab (figur 4A,B), viste mus, der fik samme dosis AAV-hαSyn, en signifikant højere grad af neurodegeneration af nigrale dopaminerge neuroner (figur 4C). Følgelig blev yderligere eksperimenter udført under anvendelse af 1 x 1010 vg / mus af AAV-hαSyn. Desuden blev omfanget af motorisk svækkelse bestemt hos mus, der fik forskellige doser AAV-hαSyn ved hjælp af stråletesten (figur 5A), som beskrevet før25. En signifikant reduktion i motorens ydeevne blev udelukkende påvist med 1 x 1010 vg/mus af AAV-hαSyn i stråletesten, både ved sammenligning af antallet af fejl begået af højre og venstre pads (figur 5B) og ved sammenligning af det samlede antal fejl hos mus, der modtog AAV-hαSyn sammenlignet med mus, der modtog kontrolvektoren AAV-GFP (figur 5C). Følgelig blev yderligere eksperimenter udført under anvendelse af 1 x 1010 vg / mus af AAV-hαSyn.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig02.jpg"> Figur 2: Analyse af human α-synucleinekspression i SN hos mus behandlet med forskellige doser AAV-hαSyn. Mus fik AAV-hαSyn ved (A) 1 x 1010 vg/mus, (B) 1 x 109 vg/mus eller (C) 1 x 108 vg/mus og 12 uger senere blev ofret, og hαSyn-ekspressionen blev analyseret ved immunofluorescens i SN ved hjælp af epifluorescensmikroskopi. Kerner blev farvet med DAPI. Repræsentative billeder af flettet eller enkelt farvning af hαSyn (rød) eller DAPI (blå) vises. Skalabjælker er 118 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig03.jpg"> Figur 3: Analyse af human α-synucleinekspression i striatum hos mus behandlet med forskellige doser AAV-hαSyn. Mus fik AAV-hαSyn ved (A) 1 x 1010 vg/mus, (B) 1 x 109 vg/mus eller (C) 1 x 108 vg/mus) og 12 uger senere blev ofret, og hαSyn-ekspressionen blev analyseret ved immunofluorescens i striatum ved hjælp af epifluorescensmikroskopi. Kerner blev farvet med DAPI. Repræsentative billeder af flettet eller enkelt farvning af hαSyn (rød) eller DAPI (blå) vises. Vægtstænger er 100 μm. Indsatsen i øverste højre hjørne af de flettede billeder viser et område af interesse for højere forstørrelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig04.jpg"> Figur 4: Tab af dopaminerge neuroner i SN hos mus behandlet med forskellige doser AAV-hαSyn eller kontrolvektor. Mus modtog AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mus, 1 x 109 vg/mus eller 1 x 108 vg/mus) eller AAV-GFP (1 x 1010 vg/mus) og blev 12 uger senere ofret, og TH blev analyseret i SNpc ved immunhistokemi. (A) Repræsentative billeder. Skalastænger, 100 μm. (B,C) Tætheden af neuroner blev kvantificeret som antallet af TH+ neuroner/mm2. Data repræsenterer gennemsnitlige ± SEM. n = 3-8 mus pr. Gruppe. (B) En sammenligning af ipsilaterale med kontralaterale sider blev udført ved hjælp af den to-halede parrede elevs t-test. (C) Der blev foretaget en sammenligning af ipsilaterale sider fra mus, der fik 1 x10 10 vg/mus af AAV-hαSyn eller AAV-GFP. (B,C) Mens hvide bjælker indikerer kvantificeringen af TH + neuroner på den ipsilaterale side af mus, der modtager AAV-hαSyn, indikerer grønne søjler kvantificeringen af TH + neuroner på den ipsilaterale side af mus, der modtager AAV-GFP. Grå søjler indikerer kvantificeringen af TH + neuroner på den kontralaterale side af den tilsvarende gruppe. Sammenligninger blev udført af en to-halet uparret studerendes t-test. *p < 0,05; **p < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig05.jpg"> Figur 5: Analyse af den motoriske ydeevne hos mus behandlet med forskellige doser AAV-hαSyn. Mus modtog forskellige doser (1 x 1010 vg/mus, 1 x 109 vg/mus eller 1 x 108 vg/mus) af AAV-hαSyn eller AAV-GFP, og 12 uger senere blev motorens ydeevne evalueret ved stråletesten. (A) Billede af en mus, der går på strålen. (B) Antallet af fejl udført af venstre lemmer (kontralateral) versus højre lemmer (ipsilateral) blev kvantificeret i grupperne af mus, der fik AAV-hαSyn. (C) Det samlede antal fejl blev sammenlignet mellem forskellige eksperimentelle grupper, der fik samme dosis AAV-hαSyn eller AAV-GFP. Data repræsenterer gennemsnitlige ± SEM. n = 3-5 mus pr. Gruppe. Sammenligninger blev udført af (B) en parret to-halet elevs t-test eller af (C) en uparret to-halet studerendes t-test. *p < 0,05; **p < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Opsætning af kinetikken i Parkinsons sygdomsmodel induceret af AAV-αSyn Efter bestemmelse af den korrekte AAV-hαSyn-dosis, der blev anvendt til at inducere et signifikant niveau af neurodegeneration og motorisk svækkelse, blev der udført eksperimenter til at definere begyndelsen af hαSyn-overekspression. Til dette formål blev mus behandlet med 1 x 1010 vg/mus af AAV-hαSyn eller sham kirurgi. Omfanget af hαSyn-ekspression blev analyseret i SN en gang om ugen i uge 2-5 efter stereotaksisk kirurgi (se det eksperimentelle design i supplerende figur 2). Resultaterne viser, at på trods af at hαSyn-ekspression blev påvist på lave niveauer allerede 2 uger efter operationen, optrådte hαSyn-klynger i uge 5 efter stereotaksisk kirurgi (figur 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig06.jpg"> Figur 6: Analyse af tidsforløbet for human α-synucleinekspression i SN hos mus behandlet med AAV-hαSyn. Mus modtog AAV-hαSyn (1 x 1010 vg / mus) eller bare den falske stereotaksiske kirurgi, og ekspressionen af hαSyn i SN blev analyseret (A) 2 uger, (B) 3 uger, (C) 4 uger eller (D) 5 uger senere ved immunofluorescens ved hjælp af epifluorescensmikroskopi. Kerner blev farvet med DAPI. Repræsentative billeder af flettet eller enkelt farvning af hαSyn (rød) eller DAPI (blå) vises. Vægtstænger, 100 μm. Indsatsen i øverste højre hjørne af de flettede billeder viser et område af interesse for højere forstørrelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Derefter blev der udført eksperimenter for at bestemme de passende tidspunkter til analyse af neuroinflammation og T-celleinfiltration i centralnervesystemet (CNS) efter stereotaksisk levering af AAV-hαSyn. For at bestemme toppen af mikroglial aktivering efter behandling af mus med AAV-hαSyn blev omfanget af celler, der udtrykte høje niveauer af Iba1 i striatum, evalueret en gang om ugen i uge 2-15 efter stereotaksisk kirurgi. Resultaterne viser en signifikant stigning i mikroglial aktivering af den ipsilaterale side sammenlignet med den kontralaterale side af mus 15 uger efter AAV-hαSyn-behandlingen (figur 7). Antallet af Treg (CD4+ Foxp3+) celler infiltreret i SNpc blev også evalueret på forskellige tidspunkter efter stereotaksisk levering af AAV-hαSyn ved immunofluorescens efterfulgt af konfokal mikroskopi observation. Resultaterne viser, at toppen af Treg-infiltration i SNpc var 11 uger efter operationen, mens omfanget af Treg, der infiltrerede dette område af hjernen, var lavere i uge 8 eller uge 13 efter operationen (figur 8). Der blev ikke påvist CD4+ T-celler, der infiltrerede striatum (data ikke vist). Alt i alt indikerer disse resultater, at ved hjælp af 1 x10 10 vg / mus af AAV-hαSyn er det mest egnede tidspunkt til at analysere neuroinflammation uge 15 efter stereotaksisk kirurgi, mens et korrekt tidspunkt for analyse af T-celleinfiltration i CNS synes at være uge 11 efter AAV-hαSyn-behandling.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig07.jpg"> Figur 7: Analyse af tidsforløbet for mikroglial aktivering hos mus podet med AAV-hαSyn. Mus fik AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mus), og mikroglial aktivering blev evalueret ved immunohistokemisk analyse af Iba1 i striatum på forskellige tidspunkter efter operationen. (A) Repræsentative oversigtsbilleder af immunohistokemisk analyse af Iba1 fra mus ofret 5 uger, 10 uger eller 15 uger efter podning med AAV-hαSyn vises. Skalastænger, 110 μm. (B) Tætheden af aktiveret mikroglia blev kvantificeret som antallet af celler, der udtrykker høje niveauer af Iba1 og ameboidform pr. Område. Data repræsenterer gennemsnitlig ± SEM. n = 3 mus pr. Gruppe. En to-halet parret Student's t-test blev brugt til at bestemme statistiske forskelle mellem ipsilateral og kontralateral Iba1 i hver gruppe. *p < 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig08.jpg"> Figur 8: Analyse af tidsforløbet for CD4+ T-celleinfiltration i SN hos mus podet med AAV-hαSyn. Foxp3gfp reportermus modtog AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mus). Tilstedeværelsen af CD4+ T-celler, der udtrykker Foxp3 og tilstedeværelsen af TH+ neuroner, blev analyseret på forskellige tidspunkter (uge 8, uge 11 og uge 13 efter operationen) i SN ved immunofluorescens. (A) Repræsentative billeder for enkelt immunstaining eller fusionen vises. Skalastænger, 100 μm. (B) Antallet af CD4+ Foxp3+ T-celler pr. område i SN blev kvantificeret. Data repræsenterer gennemsnitlig ± SEM fra 3 mus pr. Gruppe. *p<0,05, ipsilateral versus kontralateral CD4+ Foxp3+ T-celler ved to-halet Studerendes t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig08large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende figur 1: Eksperimentelt design til evaluering af effekten af forskellige doser AAV-vektorer på synucleinpatologi, neurodegeneration og motorisk svækkelse. Vildtypehaner C57BL/6-mus blev bedøvet og fik stereotaksisk podning af forskellige doser (1 x 1010 vg/mus, 1 x 109 vg/mus eller 1 x 108 vg/mus) af AAV, der koder for human α-synuclein (AAV-hαSyn) eller eGFP (AAV-GFP) under kontrol af CBA-promotoren i højre substantia nigra (SN). Efter 12 uger blev ekspressionen af GFP og hαSyn i SN og striatum (Str) evalueret ved immunofluorescens (IF), tyrosinhydroxylasepositive (TH+) celler blev kvantificeret ved immunohistokemi (IHC) i SN, og motorisk ydeevne blev evalueret ved stråletesten. Antallet af mus i hver eksperimentel gruppe er angivet i parentes. * angiver grupper, hvor en mus døde før analyserne. Hver analyse angiver i parentes nummeret på figuren fra papirets krop, hvor de tilsvarende resultater vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 2: Eksperimentelt design til bestemmelse af kinetikken af T-celleinfiltration, neuroinflammation og hαSyn-ekspression. Foxp3gfp reportermus blev bedøvet og modtog stereotaksisk podning af AAV (1 x 1010 vg / mus), der koder for human α-synuclein (AAV-hαSyn) under kontrol af CBA-promotoren i højre substantia nigra (SN) eller sham kirurgi (PBS). Mus blev ofret på forskellige tidspunkter, og ekspressionen af hαSyn i SN og striatum blev evalueret ved immunofluorescens (IF), GFP (Foxp3), CD4 og tyrosinhydroxylase positive (TH+) celler blev kvantificeret af IF i SN, og Iba1-ekspression blev analyseret ved immunohistokemi (IHC) i striatum (Str). Antallet af mus i hver forsøgsgruppe er angivet. Intervallet af tidspunkter, der indgår i hver analyse, er angivet. Hver analyse angiver i parentes nummeret på figuren fra papirets krop, hvor de tilsvarende resultater vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human ÃŽÂ±-Synuclein at JoVE.com

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein

Dette arbejde analyserer vektordosis og eksponeringstid, der kræves for at inducere neuroinflammation, neurodegeneration og motorisk svækkelse i denne prækliniske model af Parkinsons sygdom. Disse vektorer, der koder for den humane α-synuclein, leveres i substantia nigra for at rekapitulere synucleinpatologien forbundet med Parkinsons sygdom.

Analyse af Parkinsons sygdom musemodel induceret af Adeno-associerede virale vektorer, der koder for humane α-synuclein

Parkinson&#39;s disease is a neurodegenerative disorder that involves the death of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway and, ...

Det overordnede mål med denne procedure er at reproducere de fleste af de væsentlige aspekter af Parkinsons sygdom i en dyremodel. Den stereotaksiske levering af adeno-associerede virale vektorer, der koder for det humane synuclein i substantia nigra. Parkinsons sygdom er en neurodegenerativ lidelse, der involverer dopaminerg neurons død i den nigrostriatale vej og følgelig progressionen af tab af kontrol over frivillig bevægelse.Denne neurodegenerative proces ledsages af aflejring af proteinaggregat i hjernen, som hovedsageligt udgøres af synuclein. Nye beviser har indikeret, synucleinaggregater kan stimulere vejafgiftslignende receptorer på mikrogliaen og dermed udløse neural inflammation i substantia nigra. Desuden tyder beviser på, at synucleinaggregater kan fanges og præsenteres ved antigenpræsenterende celler til T-celler, hvilket inducerer et adaptivt immunrespons, der er specifikt for synuclein.Den stereotaksiske levering af adeno-associerede virale vektorer, der koder for det humane synuclein i substantia nigra, har vist sig at reproducere mange væsentlige aspekter af sygdommen, herunder synucleinpatologi, mikroglial aktivering, T-celleaktivering, neurodegeneration og motorisk svækkelse. Denne undersøgelse præsenterer en analyse af, hvordan en viral vektor og tiden efter viral vektorlevering påvirker omfanget af human synucleinikspression, neurodegeneration og neuroinflammation i den nigrostriatale vej samt graden af motorisk svækkelse i en musemodel af ensidig stereotaksisk levering af humant synuclein i substantia nigra. For at opretholde et aseptisk miljø skal du bære passende kirurgisk tøj under hele operationen, herunder skoomslag, kirurgimaske, sanitetsbarriere, handsker og operationshætte.Sprøjt ethanol på musen og alt kirurgisk materiale for at opretholde det aseptiske miljø. For at fremkalde analgesi skal du injicere carprofen subkutant hver 12. time, starte en time før operationen og fortsætte indtil tre dage efter operationen. For at anæstesiere musen skal du placere dyret i et induktionskammer.Åbn isofluranstrømmen med en hastighed på 0,5%, og øg den derefter langsomt op til 5% over cirka fem minutter, indtil musen har mistet sin retterefleks. Fjern dyret fra induktionskammeret. Overfør straks dyret til et ikke-rebreathing kredsløb med en passende størrelse næsekegle.Oprethold museanæstesien med isofluran 1% gennem hele operationens tid. Bekræft, at musen er helt aetiseret ved at klemme haler og poter. Når musen ikke reagerer, når den klemmer halen og poterne, betyder det, at musen er fuldstændigt anæstesi.Barber musehovedet ved hjælp af en saks. Rengør musehuden med en vatpind med chlorhexidin 2% og fjern alt håret. Fastgør musehovedet i den stereotaksiske ramme.Placer et hornhindebeskyttelsesmiddel i begge museøjne ved hjælp af en vatpind. For at forhindre stressinduktion hos andre gnavere skal du undgå tilstedeværelsen af enhver anden mus i operationsstuen. Rengør musehovedet med tre runder chlorhexidin 2% efterfulgt af ethanol 70% Udsæt kraniet ved hjælp af kirurgisk materiale, og lav et tyndt hul med en boremaskine ved koordinater anteroposterior 2,8 mm og mediolateral 1,4 mm med hensyn til medial linje.Sæt nålen på en 10 mikroliter sprøjte i hullet, og flyt nålen inde i hjernen langsomt, indtil den ankommer til 7,2 mm dorsoventral, respekt for dura. Lad nålen stå i den endelige position i to minutter, for at lade vævet sætte sig lidt, og injicer derefter en mikroliter virale vektorer i den rigtige substantia nigra med en hastighed på 0,2 mikroliter hvert 30. sekund. Lad nålen stå i samme position i fem minutter efter levering af virale vektorer, og træk den derefter langsomt tilbage.Luk såret ved hjælp af en steril silkesutur. Sæt musen i hjemmeburet, forvarmet ved at placere den over en elektrisk varm madras. 12 uger efter stereotaksisk kirurgi vurderes den motoriske ydeevne ved hjælp af en forenklet version af stråletesten, der er beskrevet før.Til dette formål skal du bruge en vandret bjælke på 25 cm i længden og 3 cm i bredden. Stråleoverfladen skal være dækket af et metallisk gitter med firkanter på en centimeter og hævet en centimeter over strålen. Lav en video af musen, mens du krydser gitteroverfladestrålen, fra den ene ende til den modsatte ende af strålen, hvor hjemmeburet er placeret.Træn musen i to dage, før bestemmelsen af motorens ydeevne. På den første dag skal du træne musen til at gå gennem strålen fem gange uden gitteret. På den anden dag skal du træne musen til at gå gennem strålen i nærværelse af gitter fem gange.På den tredje dag skal du evaluere motorens ydeevne. For at gøre dette skal du kvantificere antallet af fejl, der udføres af venstre poter eller af de højre poter separat, ved at se videoerne i slowmotion-tilstand. For at bistøble musen skal du injicere en blanding af ketamin og xylazin intraperitonealt.Når musen er fuldstændigt anæstesi, skal du åbne brystkassen med kirurgisk materiale og udsætte hjertet. Indsæt derefter en flad spidsnål i hjertets venstre ventrikel. Ved at koble nålen til et rør perfuseres 50 ml fosfatbuffer saltvand med en hastighed på 9,5 ml pr. Minut ved hjælp af en peristaltisk pumpe.Fjern hjernen ved hjælp af en saks og pincet, og fastgør den derefter ved nedsænkning i fem milliliter 4% paraformaldehyd i fosfatbuffer saltvand. Derefter sættes den faste hjerne i 15 ml 30% saccharose i 48 timer. Sæt derefter hjernen i fire milliliter kryobeskyttelsesopløsning, og red hjernen ved 80 grader, eller brug den straks i næste trin.For at opnå striatale skiver skal du skære hjernen i 40 mikrometer tykke sektioner, der starter ved 1,34 mm og slutter ved 0,26 mm. Høst hver skive i en to milliliter kryotube, efter anteroposterior ordre. For at udføre immunohistokemisk og immunofluorescerende analyse i striatum skal du vælge fem koronale striatale sektioner taget med ensartede intervaller, der dækker hele kernens rostrocaudale udstrækning.For at validere den korrekte levering af virale vektorer i de dopaminerge neuroner i den nigrostriatale vej blev vektorer, der koder for GFP, injiceret i substantia nigra, og 12 uger senere blev GFP-fluorescensen og tyrosinhydroxylaseimmunreaktiviteten analyseret i substantia nigra og striatum ved immunofluorescens. Den GFP-associerede fluorescens var udelukkende placeret på det ipsilaterale sted, og en signifikant colokalisering med tyrosinhydroxylaseimmunreaktivitet blev observeret i både substantia nigra og striatum, hvilket indikerer korrekt levering af virale vektorer i de dopaminerge neuroner i nigrostriatalvejen. For at teste dosis af vektorer, der koder for synuclein, kræves, for at inducere en signifikant overekspression af humant synuclein, der fremmer neurodegeneration af de nigrale dopaminerge neuroner, blev forskellige doser af vektorerne injiceret.Og 12 uger senere blev den humane synucleinimmunreaktivitet og omfanget af tyrosinhydroxylaseimmunreaktivitet testet i den nigrostriatale vej. Human synuclein immunreaktivitet var tydelig, med alle doser testet i substantia nigra. Imidlertid præsenterede kun mus, der modtog 10 til de 10 virale genomer pr. Mus, tydelig human synucleinimmunreaktivitet i striatum.Mus, der modtog 10 til de 10 virale genomer pr. Mus af vektorer, der koder for humant synuclein, viste et signifikant tab af dopaminerge neuroner i substantia nigra. Selvom mus, der modtog den samme dosis vektorer, der koder for GFP, viste en lav grad af neuronalt tab, præsenterede disse mus signifikant lavere grad af neurodegeneration sammenlignet med de mus, der modtog vektorer, der koder for humant synuclein. Ved hjælp af stråletesten blev der udelukkende påvist en signifikant reduktion i motorisk ydeevne hos de mus, der modtog 10 til 10 virale genomer pr. mus af vektorer, der koder for humant synuclein, ved sammenligning af antallet af fejl begået af højre og venstre pote eller ved sammenligning af det samlede antal fejl hos mus, der modtager vektorer, der koder for humant synuclein med de mus, der modtager kontrolvektoren.For at definere begyndelsen af human synucleinekspression blev mus behandlet med 10 til de 10 virale genomer pr. Mus, af vektorer, der koder for humant synuclein eller sham-kirurgi, og omfanget af human synucleinekspression blev analyseret i substantia nigra en gang om ugen i uge to til fem efter stereotaksisk kirurgi. Resultaterne viser, at human synucleinekspression begyndte at være tydelig i uge fem efter stereotaksisk kirurgi. For at bestemme toppen af mikroglial aktivering blev omfanget af celler, der udtrykker høje niveauer af Iba1, kvantificeret i musens striatum i uge 2-15 efter operationen.Resultaterne viser en signifikant stigning i mikroglial aktivering af den ipsilaterale side sammenlignet med den kontralaterale side af mus 15 uger efter den virale podning. Antallet af regulatoriske T-celler infiltreret i den betydelige nigra blev analyseret på forskellige tidspunkter efter stereotaksisk kirurgi ved immunofluorescens efterfulgt af konfokal mikroskopiobservation. Toppen af regulatorisk T-celleinfiltration i substantia nigra blev observeret i uge 11 efter operationen.Musemodellen for neurodegeneration, der analyseres her, repræsenterer en nyttig model til at studere antallet af nøgleaspektinddragelse i patofysiologi af Parkinsons sygdom. Involveringsmekanismer involveret i synucleinpatologi, mikroglial aktivering, inddragelse af det perifere immunsystem, i neuroinflammation og mekanismerne for neurodegeneration En korrekt dosis af adeno-associeret viral vektor, subtype fem, der koder for humant synuclein for at inducere neurodegeneration, neuroinflammation, T-celleinfiltration og motorisk svækkelse, er 10 til de 10 virale genomer pr. Mus. Denne undersøgelse viser, at fem uger efter stereotaksisk kirurgi udgør et centralt tidspunkt, hvor humant synucleinudtryk allerede var tydeligt, men i mangel af motorisk svækkelse i denne dyremodel.Derved repræsenterer dette tidspunkt et interessant tidsmæssigt punkt, at starte administrationen af eksperimentelle terapier, der er skræddersyet til at stoppe udviklingen af neuroinflammation og neurodegeneration. Det mest passende tidspunkt for at analysere neuroinflammation i denne dyremodel er i uge 15 efter en stereotaksisk operation. Mens et korrekt tidspunkt at analysere T-celleinfiltration i centralnervesystemet.ser ud til at være i uge 11 efter viral vektorpodning.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human &#945;-Synuclein

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

Metoder til karakterisering Spontan og overraske-induceret Locomotion i en Rotenon-induceret Parkinsons sygdom Model<em&gt; Drosophila</em

Parkinson&#8217;s disease is a neurodegenerative disorder that results from the degeneration of dopaminergic neurons in the central nervous system, ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventrikulær Viral Injektion af Neonatal Mouse Hjerne for Vedvarende og Udbredt Neuronal transduktion

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produktion, oprensning og kvalitetskontrol for Adeno-associeret Virus-baseret vektorer

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Konvektion forbedret levering af Optogenetic adeno-associeret viral vektor til cortex af rhesus Macaque under vejledning af online MRI-billeder

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

In vivo direkte omprogrammering af residente Gliale celler til Interneuroner ved intracerebral injektion af virale vektorer

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Cochlear-overflade forberedelse i voksen musen

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Applying the RatWalker System for Gait Analysis in a Genetic Rat Model of Parkinson's Disease

Anvendelse af RatWalker-systemet til ganganalyse i en genetisk rottemodel af Parkinsons sygdom

Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder caused by the loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars ...

The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease

Den 6-hydroxydopamin rotte model af Parkinsons sygdom

Motor symptoms of Parkinson's disease (PD)-bradykinesia, akinesia, and tremor at rest-are consequences of the neurodegeneration of dopaminergic neurons in ...