Name: analyzing the parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human &#945;-synuclein
Uploaded: 2022-07-29T13:00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human ÃŽÂ±-Synuclein at JoVE.com

We bedanken Dr. Sebastián Valenzuela en Dr. Micaela Ricca voor hun waardevolle veterinaire hulp in onze dierenfaciliteit. Dit werk werd ondersteund door "Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID" Centro Ciencia & Vida, FB210008 (aan Fundación Ciencia & Vida), en het Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, FONDAP-15150012. Dit werk werd ook gefinancierd door subsidies FONDECYT-1210013 (aan R.P.) en FONDECYT-1150766 (aan F.C.) van "Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID)" en MJFF-10332.01 (aan R.P.) en MJFF-17303 (aan F.C.) van de Michael J Fox Foundation for Parkinson's Research.

Alle onderzoeken werden uitgevoerd onder de 8e editie van de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Experimentele protocollen werden goedgekeurd door de IACUC van de Fundación Ciencia & Vida (Science for Life Foundation), inclusief die met betrekking tot anesthesie, pijn, angst en euthanasie (vergunningsnummer P-035/2022).
1. De stereotaxische chirurgie
<ol><li>Voorbereiding op de operatie (ongeveer 1 uur)<ol>
<li>Om een aseptische omgeving te behouden, draagt u tijdens de hele operatie geschikte chirurgische kleding, inclusief schoenovertrekken, een chirurgisch masker, een sanitaire barrière, handschoenen en een chirurgische pet.</li>
		<li>Spuit 70% ethanol op de muis en al het chirurgische materiaal om een aseptische omgeving te behouden.</li>
		<li>Om analgesie te induceren, injecteert u de muis met carprofen 5 mg/kg subcutaan (s.c.) om de 12 hen 21 vanaf 1 uur voor de operatie en tot 3 dagen na de operatie.</li>
		<li>Om de muis te verdoven, plaatst u het dier in een inductiekamer. Open de isofluraanstroom met een snelheid van 0,5% en verhoog deze vervolgens langzaam tot 5% gedurende ongeveer 5 minuten totdat de muis zijn rechtreflex heeft verloren22.</li>
		<li>Verwijder het dier uit de inductiekamer. Breng het dier onmiddellijk over naar een niet-rebreathing circuit met een neuskegel van de juiste grootte. Handhaaf de muisanesthesie met isofluraan 1% gedurende de hele tijd van de operatie.</li>
		<li>Bevestig dat de muis volledig is verdoofd door in zijn staart en poten te knijpen. Wanneer de muis niet reageert op het knijpen van de staart en poten, betekent dit dat de muis volledig is verdoofd.</li>
		<li>Scheer het hoofd van de muis met een schaar. Reinig de huid van de muis met een wattenstaafje met chloorhexidine 2% en verwijder al het haar.</li>
		<li>Bevestig het hoofd van de muis in het stereotaxische frame.</li>
		<li>Plaats een hoornvliesbeschermer in beide muizenogen met behulp van een wattenstaafje. Om stressinductie bij andere knaagdieren te voorkomen, vermijdt u de aanwezigheid van een andere muis in de operatiekamer23.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De operatie (ongeveer 30 min)<ol>
<li>Reinig de kop van de muis met drie rondes van 2% chloorhexidine gevolgd door 70% ethanol. Stel de schedel bloot met chirurgisch materiaal en maak een dun gaatje met een boor op de volgende coördinaten: anteroposterior −2,8 mm en mediolateraal 1,4 mm ten opzichte van de mediale lijn.</li>
		<li>Steek de naald van een spuit van 10 μL in het gat en beweeg de naald langzaam in de hersenen totdat deze op −7,2 mm dorsoventral ten opzichte van de dura24 is aangekomen.</li>
		<li>Laat de naald gedurende 2 minuten in de eindpositie om het weefsel een beetje te laten bezinken en injecteer vervolgens 1 μL AAV5-CBA-hαSyn (AAV-hαSyn), AAV5-CBA-eGFP (AAV-GFP) of voertuig (PBS bij pH 7,4; schijnchirurgie) in de juiste substantia nigra met een snelheid van 0,2 μL/30 s.</li>
		<li>Laat de naald na de toediening van virale vectoren gedurende 5 minuten in dezelfde positie staan en trek hem vervolgens langzaam terug.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na de operatie (ongeveer 5 min)<ol>
<li>Sluit de wond met een steriele zijde gevlochten niet-absorbeerbare hechtdraad.</li>
		<li>Plaats de muis in de huiskooi voorverwarmd door hem over een elektrisch verwarmd matras (25 °C) te leggen. OPMERKING: De muis moet alleen in de thuiskooi worden gehouden totdat hij zonder problemen kan lopen en de wond is genezen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bepaling van de motorprestaties met behulp van de bundeltest
<ol><li>Training (ongeveer 15 min per muis)<ol>
<li>Beoordeel twaalf weken na de stereotaxische operatie de motorische prestaties met behulp van een vereenvoudigde versie van de straaltest die vóór25 uur is beschreven. Gebruik hiervoor een horizontale balk van 25 cm lang en 3 cm breed. Het balkoppervlak moet worden bedekt met een metalen rooster met vierkanten van 1 cm en 1 cm boven de balk worden verhoogd.</li>
		<li>Maak een video van de muis die de rasteroppervlakstraal van het ene uiteinde naar het andere uiteinde van de balk doorkruist, waar de thuiskooi zich bevindt. Train de muis gedurende 2 dagen vóór de bepaling van de motorische prestaties.</li>
		<li>Train de muis op de eerste dag om vijf keer door de balk te lopen zonder het raster.</li>
		<li>Train op de tweede dag de muis om vijf keer door de balk te lopen in aanwezigheid van het raster.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De test (ongeveer 5 min per muis)<ol>
<li>Evalueer op de derde dag de motorprestaties. Om dit te doen, kwantificeert u het aantal fouten dat door de linkerpoten of door de rechterpoten afzonderlijk wordt uitgevoerd door de video's in slow-motionmodus te bekijken. OPMERKING: Een fout wordt gedefinieerd als wanneer een poot niet correct op het rooster stapt en daarom zichtbaar wordt aan de zijkant van het raster of tussen het raster en het balkoppervlak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Weefselbewerking
<ol><li>Transcardiale perfusie (ongeveer 15 min per muis)<ol>
<li>Om de muis te verdoven, injecteert u een mengsel van ketamine (80 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) intraperitoneaal (i.p.) met een spuit van 1 ml en 27 g naald26.</li>
		<li>Zodra de muis volledig is verdoofd (bevestigd zoals in stap 1.1.6.), opent u de thorax met chirurgisch materiaal en stelt u het hart bloot.</li>
		<li>Steek vervolgens een naald van 21 G (maak de punt plat met behulp van een boor) in de linker hartkamer.</li>
		<li>Door de naald aan een pijp te koppelen, perfundeer 50 ml PBS (pH 7,4) met een snelheid van 9,5 ml / min met behulp van een peristaltische pomp.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixatie en cryoprotecting van de hersenen (ongeveer 10 min per brein)<ol>
<li>Verwijder de hersenen met een schaar en pincet en fixeer het vervolgens door onderdompeling in 5 ml 4% paraformaldehyde in PBS (pH 7,4) bij 4 °C gedurende 24 uur.</li>
		<li>Zet daarna de vaste hersenen in 15 ml 30% sucrose bij 4 °C gedurende 48 uur.</li>
		<li>Plaats vervolgens de hersenen in 4 ml cryoprotectie-oplossing (20% glycerine en 2% DMSO in PBS) en bewaar de hersenen bij −80 °C of gebruik het onmiddellijk in de volgende stap.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het verkrijgen van hersenplakken (ongeveer 20 min per hersenen). OPMERKING: Zorg ervoor dat de hersenen in een cryostaat in een juiste positie worden geplaatst om coronale sneden te maken.<ol>
<li>Om SN-plakjes te verkrijgen, snijdt u de hersenen in 40 μm dikke secties beginnend bij −2,92 mm en eindigend bij −3,64 mm24.</li>
		<li>Oogst elke plak in een put (met 1 ml cryoprotectie-oplossing) van een 24-well plaat volgens een anteroposteriorvolgorde zoals beschreven vóór 25,27,28.</li>
		<li>Om immunohistochemische (rubriek 4.) en immunofluorescentieanalyses (rubriek 5.) in het SN uit te voeren, kiest u zes coronale SN-secties met uniforme intervallen (120 μm) die de gehele rostrocaudale omvang van de kern bestrijken (720 μm in totaal), zoals beschreven vóór 25,27,28.</li>
		<li>Om striatale plakjes te verkrijgen, snijdt u de hersenen in 40 μm dikke secties beginnend bij +1,34 mm en eindigend bij −0,26 mm24.</li>
		<li>Oogst elke plak in een cryobuis van 2 ml (met 1 ml cryoprotectie-oplossing) volgens een anteroposteriorbestelling.</li>
		<li>Om immunohistochemische (rubriek 4.) en immunofluorescentieanalyses (rubriek 5.) in het striatum uit te voeren, kiest u vijf coronale striatale secties met uniforme intervallen (320 μm) die de gehele rostrocaudale omvang van de kern bestrijken (1600 μm in totaal).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Immunohistochemische analyse om dopaminerge neuronen en microgliose te kwantificeren (ongeveer 2 dagen)
<ol><li>Voor immunohistochemische analyse van striatale of nigral plakjes, plaats de set van vijf (striatum) of zes (SN) plakjes uit dezelfde hersenen in één put van een 24-well plaat.</li>
	<li>Was de secties 3x met 1 ml PBS en incubeer vervolgens met 0,5 ml 0,03% H2O2 in methanol bij kamertemperatuur en met agitatie gedurende 30 minuten om de endogene peroxidase-activiteit te inactiveren.</li>
	<li>Was de secties 3x met 1 ml PBS en incubeer met 0,5 ml blokkerende oplossing (4% geitenserum, 0,05% Triton X-100 en 4% BSA in PBS) bij kamertemperatuur en met roeren gedurende 40 minuten.</li>
	<li>Incubeer daarna met 0,5 ml blokkerende oplossing die het primaire antilichaam bevat (konijn anti-tyrosinehydroxylase [TH] pAb verdund 1:1000 [zie tabel 1]; of konijn anti-Iba1 antilichaam verdund 1:1000) bij kamertemperatuur en met agitatie 's nachts.</li>
	<li>Was de secties 3x met 1 ml PBS en incubeer met 0,5 ml blokkerende oplossing die gebiotinyleerde geiten-anti-konijn pAb (1:500, zie tabel 1) bevat bij kamertemperatuur en met roeren gedurende 2 uur.</li>
	<li>Was vervolgens de secties 3x met 1 ml PBS en incubeer met 0,5 ml peroxidase-geconjugeerde avidine (1:5000, zie tabel 1) in blokkerende oplossing bij kamertemperatuur en met roeren gedurende 90 minuten.</li>
	<li>Was de secties 3x met 1 ml PBS en incubeer met 0,5 ml substraatoplossing (0,05% diaminobenzidine in 0,03% H2O2/Trizma-HCl-buffer bij pH 7,6). Draag handschoenen en een laboratoriumjas voor deze stap, omdat diaminobenzidine een potentieel carcinogeen is.</li>
	<li>Wanneer de specifieke kleuring duidelijk is (meestal 30 sec voor TH en 5 min voor Iba1), haalt u de substraatoplossing eruit en wast u de secties 3x met 1 ml PBS bij kamertemperatuur en met roeren. Voer altijd de immunostaining uit van plakjes van alle hersenen die tegelijkertijd in hetzelfde experiment zijn opgenomen. OPMERKING: De specifieke kleuring van TH is duidelijk wanneer TH-immunostaining verschijnt in het gebied van het SN, dat een karakteristieke vorm in de hersenen vertoont. Het specifieke merkteken van Iba1 wordt bepaald wanneer Iba1-immunostaining verschijnt op gecontroleerde hersenplakken met typische microgliale vormen, die worden bevestigd na microscoopobservatie. Op deze manier wordt voor elk afzonderlijk experiment de exacte tijd van substraatexpositie voor IHC-analyse bepaald.</li>
	<li>Monteer de hersensecties op glazen dia's met een oplossing van 0,2% gelatine in 0,05 M Tris (pH 7,6). Plaats elke set van vijf (striatum) of zes (SN) plakjes verkregen uit dezelfde hersenen in rostrocaudale volgorde op dezelfde glazen dia.</li>
	<li>Kwantificeer het aantal TH+ neuronen in het SN.<ol>
<li>Om TH + neuronen in het SN te kwantificeren, verwerft u foto's van de zes plakjes met 20x vergroting met behulp van een helderveldmicroscoop, zoals beschreven vóór 25,27,28. Gebruik de volgende aanpassing van de kleur: kleurtemperatuur 3200 K, cyaan-rood 40%, magenta-groen 39%, geelblauw 54%, gamma 0,5, contrast 37, helderheid 13, verzadiging 5.</li>
		<li>Selecteer met behulp van de Image J-software de omtrek van de SN pars compacta in het geanalyseerde halfrond. Vermijd de selectie van TH+ neuronen uit het ventrale tegmentale gebied (VTA).</li>
		<li>Vraag de software vervolgens om het geselecteerde gebied te berekenen (meestal 0,04-0,07 mm2 / halfrond, afhankelijk van de rostrocaudale positie). Tag vervolgens met behulp van de multipoint-tool elk TH + - neuron met een stip.</li>
		<li>Vraag de software met behulp van de punttool om het totale aantal punten te tellen. Bereken met het aantal totale stippen (TH+ neuronen) en het gebied van de SNpc de dichtheid van TH+ neuronen/mm2.</li>
		<li>Herhaal dezelfde berekening in beide hemisferen op de zes SN-plakjes en bereken vervolgens het gemiddelde van TH+ neuronen/mm2 aan de ipsilaterale en de contralaterale zijden.</li>
	</ol></li>
	<li>Kwantificeer het aantal geactiveerde microglia in het striatum<ol>
<li>Om geactiveerde microglia in het striatum te kwantificeren, verwerft u twee foto's in elke hemisfeer voor alle vijf striatale plakjes met een vergroting van 20x met behulp van een helderveldmicroscoop en dezelfde instellingen aangegeven in stap 4.10.1. Met behulp van de Image J-software tagt u in elke foto (met een oppervlakte van 660 μm x 877 μm) met een stip elke cel die een hoge Iba1-intensiteit en ameboïde vorm uitdrukt met behulp van het multipoint-gereedschap. Vraag de software met behulp van de punttool om het totale aantal punten te tellen.</li>
		<li>Bereken met het aantal totale stippen en de oppervlakte van de foto de dichtheid van geactiveerde microglia (Iba1hoge cellen / mm2) zoals uitgevoerd vóór29.</li>
	</ol></li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Doelantigeen</td>
			<td>Gekoppeld aan</td>
			<td>Klonaliteit</td>
			<td>Gastheer specie</td>
			<td>Soortreactiviteit*</td>
			<td>Verdunning**</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>N.v.t</td>
			<td>Polyklonaal</td>
			<td>Konijn</td>
			<td>Muis, Rat, Mens</td>
			<td>1/200 - 1/1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iba1</td>
			<td>N.v.t</td>
			<td>Monoclonal</td>
			<td>Konijn</td>
			<td>Muis, Rat, Mens</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>alfa-synucleïne</td>
			<td>N.v.t</td>
			<td>Monoclonal</td>
			<td>Konijn</td>
			<td>Menselijk</td>
			<td>1/150</td>
		</tr>
<tr>
<td>cd4</td>
			<td>N.v.t</td>
			<td>Monoclonal</td>
			<td>Rat</td>
			<td>Muis</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG (H + L)</td>
			<td>Gebiotineerd</td>
			<td>Polyklonaal</td>
			<td>Geit</td>
			<td>Konijn</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG (H + L)</td>
			<td>AlexaFluor 546</td>
			<td>Polyklonaal</td>
			<td>Geit</td>
			<td>Konijn</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG (H + L)</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>Polyklonaal</td>
			<td>Geit</td>
			<td>Konijn</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG (H + L)</td>
			<td>AlexaFluor 546</td>
			<td>Polyklonaal</td>
			<td>Geit</td>
			<td>Rat</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Antilichaamverdunningen. N.v.t., niet van toepassing. *, Het wordt alleen gespecificeerd als er reactiveringen zijn met muis, rat en mens, ongeacht de reactiviteit met andere soorten. **, wordt een enkele verdunning of een verdunningsbereik gespecificeerd.
5. Immunofluorescentieanalyse om T-celinfiltratie in de nigrostriatale route te evalueren (ongeveer 2 dagen)
<ol><li>Voor immunofluorescentieanalyse van hαSyn of TH/GFP op striatale of nigrale plakjes, stel je de set van vijf (striatum) of zes (SN) plakjes uit dezelfde hersenen samen in één put van een 24-putplaat.<ol>
<li>Was de secties 3x met 1 ml PBS en incubeer vervolgens met 0,5 ml blokkerende oplossing (0,3% Triton X-100, 0,05% tween20 en 5% BSA in PBS) bij kamertemperatuur en met roeren gedurende 40 minuten.</li>
		<li>Incubateer daarna met 0,5 ml blokkerende oplossing die het primaire antilichaam bevat (konijn anti-TH pAb verdund 1:500; of konijn anti-hαSyn-antilichaam verdund 1:150, zie tabel 1) bij kamertemperatuur en met agitatie 's nachts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Was de secties 3x met 1 ml PBS en incubeer met 0,5 ml blokkerende oplossing met AlexaFluor546-gekoppeld anti-konijn secundair antilichaam (1:500, zie tabel 1) en 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI; 1:1000) bij kamertemperatuur en met agitatie gedurende 2 uur. Was vervolgens de secties 3x met 1 ml PBS.</li>
	<li>Monteer de hersensecties op glazen dia's zoals hierboven beschreven (stap 4.9.). Beelden werden verkregen met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop gekoppeld aan een voedingseenheid.</li>
	<li>Voor immunofluorescentieanalyse van TH/CD4/GFP(Foxp3) op nigral slices, plaats je de set van zes (SN) slices uit dezelfde hersenen in één put van een 24-well plaat. Was de secties 3x met 1 ml PBS en incubeer vervolgens met 0,5 ml blokkerende oplossing (0,5% Triton X-100, 0,5% gelatine van de vishuid in PBS) bij kamertemperatuur en met roeren gedurende 2 uur.</li>
	<li>Incubeer met 0,5 ml blokkerende oplossing die de primaire antilichamen konijn anti-TH pAb (1:200, zie tabel 1) en rat anti-CD4 (1:250) bevat bij 4 °C en met agitatie gedurende de nacht.</li>
	<li>Was de secties 3x met 1 ml PBS en incubeer met 0,5 ml blokkerende oplossing met anti-konijn gekoppeld aan AlexaFluor 647 (1:500, zie tabel 1) en anti-rat gekoppeld aan AlexaFluor 546 (1:500) bij kamertemperatuur en met roeren gedurende 2 uur. Was vervolgens de secties 3x met 1 ml PBS.</li>
	<li>Plaats elke set van zes (SN) plakjes verkregen uit dezelfde hersenen in rostrocaudale volgorde op dezelfde glazen dia en monteer ze met Fluoromount G. Verkrijg beelden met behulp van een Leica DMi8-microscoop. Gebruik de confocale microscoopinstellingen in tabel 2 om beelden te verkrijgen van immunofluorescentieanalyse.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Chanel Naam</td>
			<td>Kubus</td>
			<td>Emissie Wavelenght</td>
			<td>Naam van opzoektabel</td>
			<td>Belichtingstijd</td>
			<td>Behalen</td>
			<td>Resolutie XY</td>
			<td>Resolutie Z</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanaal 1</td>
			<td>Y5</td>
			<td>700 nm</td>
			<td>Grijs</td>
			<td>1.011,727 ms</td>
			<td>hoge putcapaciteit</td>
			<td>2.237 Umm</td>
			<td>24.444 Umm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanaal 2</td>
			<td>GFP</td>
			<td>525m</td>
			<td>Groen</td>
			<td>326.851 ms</td>
			<td>hoge putcapaciteit</td>
			<td>2.237 Umm</td>
			<td>24.444 Umm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanaal 3</td>
			<td>Txr</td>
			<td>630m</td>
			<td>Rood</td>
			<td>406.344 ms</td>
			<td>hoge putcapaciteit</td>
			<td>2.237 Umm</td>
			<td>24.444 Umm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanaal 4</td>
			<td>Dapi ·</td>
			<td>460 nm</td>
			<td>Blauw</td>
			<td>91.501 ms</td>
			<td>hoge putcapaciteit</td>
			<td>2.237 Umm</td>
			<td>24.444 Umm</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Confocale microscoopinstellingen die worden gebruikt voor het verkrijgen van beelden van immunofluorescentieanalyse.
6. Statistische analyse
<ol><li>Om gegevens verkregen van de ipsilaterale en de contralaterale zijden te vergelijken, gebruikt u een gepaarde tweezijdige Student's t-test.</li>
	<li>Om gegevens te vergelijken die zijn verkregen van muizen die AAV-hαSyn krijgen en van muizen die AAV-GFP of schijnchirurgie krijgen, gebruikt u een ongepaarde tweezijdige Student's t-test. Houd rekening met significante verschillen wanneer P-waarden < 0,05.</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder financiële of niet-financiële concurrerende belangen.

Het muismodel van neurodegeneratie dat hier wordt geanalyseerd, kan helpen bij het bestuderen van vele kritieke aspecten die betrokken zijn bij de pathofysiologie van de ziekte van Parkinson, waaronder de mechanismen die betrokken zijn bij αSyn-pathologie en microgliale activering, de betrokkenheid van het perifere immuunsysteem bij de regulatie van neuro-inflammatie en de mechanismen van neurodegeneratie. Onder de mechanismen die betrokken zijn bij αSyn-pathologie zijn die subcellulaire mechanismen die geassocieerd zijn met mitochondriale, lysosomale of proteasomale disfunctie in de aanwezigheid van een overmatige belasting van αSyn in de dopaminerge neuronen van de SN2. Het is belangrijk om te bedenken dat, naast de hαSyn-expressie geïnduceerd door AAV-gemedieerde transductie, de endogene muis-αSyn ook bijdraagt aan de belasting van de totale αSyn-expressie. Transgene muizen die muis-αSyn overexpressie geven, ontwikkelen vergelijkbare synucleïnepathologie, neuropathologie en motorische stoornissen als die muismodellen op basis van de overexpressie van hαSyn32. Met betrekking tot microgliale activering kan het huidige muismodel worden gebruikt om te bestuderen hoe verschillende moleculaire en cellulaire spelers zoals cytokines, neurotransmitters, astrocyten, neuronen, de bloed-hersenbarrière en T-cellen de verwerving van pro-inflammatoire of ontstekingsremmende functionele fenotypen kunnen reguleren 8,10,11 . Dit model vormt ook een belangrijk hulpmiddel voor het bestuderen van de rol van het perifere immuunsysteem, waaronder niet alleen T-cellen, maar ook macrofagen, monocyten en neutrofielen, op de processen van neuro-inflammatie en neurodegeneratie van nigrale neuronen 11,33,34. Ten slotte vertegenwoordigt dit muismodel ook een waardevol systeem om de cellulaire en moleculaire mechanismen van neurodegeneratie in vivo te bestuderen, inclusief die geïnduceerd door interne cellulaire processen, zoals oxidatieve stress, energietekorten en beschadigde organellen 2, of die worden uitgeoefend door externe spelers, zoals neurotoxische factoren geproduceerd door microgliale cellen, astrocyten en cytotoxische T-cellen8, 28,29,35.
Een beperking van dit muismodel is de studie van hoe de pathologische aggregatie van αSyn op extra cerebrale locaties de beginstadia in de ontwikkeling van de ziekte van Parkinson zou kunnen vormen36. In dit opzicht zijn er steeds meer aanwijzingen dat, vóór de neurodegeneratie van ninigrale neuronen en motorische stoornissen, αSyn-pathologie begint in het darmslijmvlies en het reukepitheel36 en, waarschijnlijk, de αSyn-specifieke T-celrespons ook12. Daarna zouden αSyn-aggregaten door de nervus vagus naar de hersenstam migreren, waardoor de neuro-inflammatie en neurodegeneratie van dopaminerge neuronen12. Hoewel het AAV-hαSyn-model de meeste aspecten van de ziekte van Parkinson samenvat, is er geen duidelijke betrokkenheid van de pathologische aggregatie van αSyn op extra-cerebrale locaties in dit model. Een alternatief model met hαSyn-pathologie dat geschikt is voor het bestuderen van deze aspecten van de ziekte van Parkinson, zou transgene muizen kunnen zijn die hαSyn overexpresseren onder controle van de Thy1-promotor, het Thy1-SNCA-model 37, waarbij de ontwikkeling van de ziekte afhankelijk is van de darmmicrobiota en een duidelijke gastro-intestinale stoornis met zich meebrengt38.
Hoewel het nuttig is voor de studie van de diverse processen die verband houden met de pathofysiologie van de ziekte van Parkinson, omvat het huidige muismodel kritieke stappen die minutieus moeten worden gecontroleerd, waaronder de juiste afgifte van de virale vectoren in de overeenkomstige ruimtelijke coördinaten, de selectieve expressie van hαSyn in neuronen (die afhankelijk is van het AAV-serotype en het vectorconstruct), en de juiste AAV-dosis en timing voordat het Parkinson-fenotype wordt geanalyseerd. De analyse van de juiste afgifte van de virale vectoren in het SN is noodzakelijk, omdat het gebruik van de juiste ruimtelijke coördinaten van het SN mogelijk niet voldoende is wanneer de naald niet helemaal recht is, wat soms onmerkbaar is voor het menselijk oog. Bovendien is de diffusie van de AAV-vectoren afhankelijk van het AAV-serotype39. Om deze redenen is het noodzakelijk om periodieke kwaliteitscontroles uit te voeren om de juiste afgifte en diffusie van de geïnjecteerde AAV-GFP-vectoren te controleren na de observatie van GFP in hersensegmenten die het gebied van het SN bevatten.
Wat de selectieve expressie van hαSyn in neuronen betreft, zou de expressie van hαSyn in principe kunnen worden ontworpen om te worden gecontroleerd door een promotor die selectief is voor neuronen of, nog preciezer, selectief voor dopaminerge neuronen, zoals het gebruik van de TH-promotor in AAV-vectoren om de selectieve expressie van genen in dopaminerge neuronen te induceren40 . Deze strategie werkt echter niet wanneer wordt gezocht naar overexpressie van het gen van belang. Om deze reden is het in het huidige model essentieel om een sterke promotor (een promotor die een hoge expressie van het downstream-gen induceert) en AAV-serotypen met neuronaal tropisme te gebruiken. In deze studie werd de CBA-promotor gebruikt als een sterke promotor om de overexpressie van hαSyn te induceren, en het AAV5-serotype werd gebruikt voor de virale vector. Dit serotype is eerder gebruikt om muizen- en rattenneuronen te transduceren41,42. Hier toonden de resultaten aan dat, 12 weken na de levering van AAV5-GFP in het SN van muizen, de groene fluorescentie selectief aanwezig was aan de ipsilaterale kant van zowel het SN als het striatum (figuur 1), wat wijst op de efficiënte transductie van neuronen van de nigrostriatale route.
Een ander cruciaal aspect van dit muismodel van de ziekte van Parkinson is het tijdspunt dat nodig is om een bepaald proces na de operatie te analyseren. In dit opzicht toont dit werk een kinetische studie van verschillende processen die betrokken zijn bij de pathologie. Aangezien belangrijke tijdspunten veranderen met de dosis virale genomen die per muis wordt gegeven, het gebruikte serotype van AAV, of zelfs met de gebruikte partij AAV, werd eerst een dosis-responsanalyse uitgevoerd van de hoeveelheid AAV-αSyn die nodig is om een significant verlies van TH + neuronen en motorische stoornissen te induceren. Eerdere studies hebben significante motorische stoornissen en een verlies van TH + neuronen van de nigrostriatale route aangetoond na 12 weken AAV-αSyn-injecties bij muizen in doses variërend van 6 x 108-3 x 1010 virale genomen per muis 16,17,30,31. Dienovereenkomstig varieerde de dosis AAV-hαSyn die werd gebruikt om de hαSyn-expressie in de nigrostriatale route, het verlies van TH + neuronen en motorische stoornissen bij muizen te induceren van 1 x 108-1 x10 10 virale genomen per muis. Bovendien, om te controleren dat het verlies van TH + neuronen en motorische stoornissen werden geïnduceerd door de overexpressie van hαSyn in het SN en niet door AAV-infectie van neuronen van het SN, werden controlegroepen opgenomen waarin AAV-codering voor een reporter-gen (AAV-eGFP) eenzijdig werd afgeleverd in het SN van muizen en neurodegeneratie en motorische stoornissen werden bepaald. De resultaten toonden aan dat, 12 weken na de stereotaxische operatie, 1 x 1010 virale genomen per muis een juiste dosis AAV5-hαSyn was, omdat muizen die deze virale lading ontvingen significante hαSyn vertoonden in de nigrostriatale route (figuur 2 en figuur 3), verlies van TH + neuronen (figuur 4) en motorische stoornissen (figuur 5). Daarentegen waren lagere doses AAV5-hαSyn (1 x 108 virale genomen per muis en 1 x 109 virale genomen per muis) niet sterk genoeg om significante veranderingen in al deze parameters samen te bereiken (figuren 2-4). Van belang is dat de toediening van AAV-GFP bij 1 x 1010 virale genomen per muis een lage (~ 20%), maar significante mate van verlies van TH + neuronen van nigral dopaminerge neuronen veroorzaakte (figuur 4A, B). Dit resultaat komt overeen met eerdere waarnemingen met behulp van dit model41 en is waarschijnlijk het gevolg van een laag niveau van neuro-inflammatie geïnduceerd door de toediening van AAV-vectoren in het SN. Niettemin was de mate van verlies van TH+ neuronen significant hoger bij muizen die AAV5-hαSyn kregen in vergelijking met muizen die dezelfde dosis AAV-GFP kregen (figuur 4C). Van belang is dat de kinetiek van hαSyn-expressie niet alleen afhangt van de efficiëntie van transductie, maar ook van de mate van AAV-diffusie39. Aangezien AAV-diffusie afhankelijk is van het AAV-serotype, kunnen de precieze belangrijke tijdstippen in dit diermodel variëren bij gebruik van een ander AAV-serotype dat verschilt van AAV5.
Daarna werd een kinetische analyse uitgevoerd met behulp van 1 x 1010 virale genomen per muis om belangrijke tijdspunten in dit muismodel te bepalen. Aangezien het huidige bewijs enkele vroege symptomen heeft aangetoond die vóór motorische stoornissen verschijnen, wat de vroege diagnose van de ziekte van Parkinson 43,44 mogelijk zou maken, probeerden deze experimenten het tijdstip te vinden waarop hαSyn-expressie al duidelijk was, maar in afwezigheid van motorische stoornissen. De resultaten tonen aan dat het begin van hαSyn-expressie in het SN 5 weken na de stereotaxische toediening van AAV-hαSyn was (figuur 6). Dit tijdstip vormt een interessant temporeel punt om te beginnen met het toedienen van therapieën op maat om de neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve processen te stoppen. Andere belangrijke tijdspunten die hier werden bepaald, waren de piektijden voor twee kritieke gebeurtenissen die verband houden met het neuro-inflammatieproces: het tijdstip waarop microglia de maximale mate van activering bereiken en het tijdstip van maximale T-celinfiltratie in het SN. De resultaten toonden een curve met een trend die twee golven van maximale microgliale activering bereikte, de eerste 10 weken na de operatie en de tweede 15 weken na de operatie (figuur 7). De kinetische analyse van T-celinfiltratie toonde de piektijd van Treg-infiltratie in het SN 11 weken na de stereotaxische operatie (figuur 8). Verrassend genoeg werden er geen effector T-cellen (CD4+ Foxp3-) gedetecteerd die het SN infiltreerden tijdens het geanalyseerde tijdsbestek (weken 8-13 na de operatie). Al met al suggereren deze resultaten een goed tijdsbestek om te beginnen met het toedienen van therapieën gericht op het stoppen van het proces van neuro-inflammatie en het verzwakken van T-celinfiltratie in het SN met behulp van dit preklinische model, dat varieert tussen week 5 na de operatie (het begin van hαSyn-overexpressie) en week 10 na de operatie (de eerste golf van neuro-inflammatie en T-celinfiltratie) (figuur 9).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig09.jpg"> Figuur 9: Samenvatting van de belangrijkste tijdspunten voor dit diermodel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Na de ziekte van Alzheimer is de ziekte van Parkinson wereldwijd de op één na meest voorkomende neurodegeneratieve ziekte. De primaire neuronen die worden aangetast bij de ziekte van Parkinson zijn die van de nigrostriatale route, die dopamine produceren en vrijwillige beweging regelen. Als gevolg hiervan is het meest kenmerkende symptoom geassocieerd met deze aandoening motorische stoornissen. Deze pathologie omvat ook de afzetting van eiwitaggregaten in de hersenen, die voornamelijk bestaan uit α-synucleïne (αSyn)1, een cytosolisch eiwit geassocieerd met presynaptische terminals. Er zijn aanwijzingen dat het genereren van pathogene insluitsels van αSyn wordt veroorzaakt door verkeerd vouwen of door enkele posttranslationele modificaties van dit eiwit2.
Met name is er een nauw verband vastgesteld tussen αSyn-pathologie en het verlies van dopaminerge neuronen van de nigrostriatale route bij de ziekte van Parkinson bij de mens en diermodellen 3,4. Begrijpen hoe αSyn-aggregaten worden gegenereerd en hoe ze neuronale dood veroorzaken, vormt een belangrijke uitdaging in het veld. Een groeiende groep studies heeft aangetoond dat, door het verhogen van oxidatieve stress, mitochondriale disfunctie een van de belangrijkste oorzaken is voor het genereren van αSyn-aggregaten2. Inderdaad, verschillende genen geassocieerd met het risico op de ziekte van Parkinson coderen voor eiwitten die betrokken zijn bij mitochondriale functie, morfologie en dynamiek 5,6. Bovendien vormt lysosomale disfunctie, die resulteert in de accumulatie van disfunctionele mitochondriën en verkeerd gevouwen αSyn, een andere belangrijke gebeurtenis die de generatie van αSyn-aggregaten bevordert7.
Opkomend bewijs heeft aangetoond dat, zodra αSyn-aggregaten in de hersenen worden afgezet, deze pathogene eiwitten toll-like receptoren (TLRs) op de microglia stimuleren, waardoor microgliale activering en een initiële inflammatoire omgeving in de substantia nigra (SN)8,9 worden geactiveerd. Bovendien geeft het bewijs aan dat αSyn-aggregaten worden gevangen en gepresenteerd door antigeen-presenterende cellen aan T-cellen, waardoor een adaptieve immuunrespons wordt geïnduceerd die specifiek is voor αSyn10,11. Deze αSyn-specifieke T-cellen infiltreren vervolgens de hersenen en worden geherimuleerd door geactiveerde microglia, waardoor de secretie van neurotoxische factoren die neuronale dood oproepen 9,10 wordt bevorderd. Interessant is dat verschillende bewijslijnen hebben gesuggereerd dat αSyn-aggregaten eerst in het enterische zenuwstelsel worden gegenereerd en vervolgens door de nervus vagus naar de hersenstamworden getransporteerd 12.
Verschillende diermodellen van de ziekte van Parkinson worden al vele jaren gebruikt, waaronder die geïnduceerd door de toediening van neurotoxische stoffen (d.w.z. 6-hydroxydopamine, paraquat, rotenon, 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) en die met genetische aandoeningen (d.w.z. mutant α-synucleïne, mutant leucine-rijk repeatkinase 2)13 . Ondanks modellen met neurotoxine-geïnduceerde neurodegeneratie die sommige aspecten van de ziekte van Parkinson repliceren, vat geen van hen alle essentiële aspecten van de ziekte samen of zijn ze niet progressief13. Aan de andere kant, hoewel genetische muismodellen met betrekking tot de expressie van mutante versies van leucine-rijke repeat kinase 2, mutante versies van α-synucleïne, of de overexpressie van menselijke wild-type α-synucleïne resulteren in motorische stoornissen en, in sommige gevallen, ook de ontwikkeling van synucleinopathie, reproduceren ze geen prominente neurodegeneratie van de nigral dopaminerge neuronen, wat een essentieel aspect is van de ziekte van Parkinson13, 14. Een derde soort diermodel van neurodegeneratie is erin geslaagd om aan de meeste essentiële aspecten van de ziekte van Parkinson te voldoen, de stereotaxische levering van adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV's) die coderen voor de menselijke α-synucleïne (AAV-hαSyn)14,15. Belangrijk is dat AAV's de transductie van neuronen met een hoge werkzaamheid en op de lange termijn in de volwassen hersenen van zoogdieren mogelijk maken. Bovendien is aangetoond dat de stereotaxische toediening van AAV-hαSyn in het SN veel van de essentiële aspecten van de ziekte reproduceert, waaronder αSyn-pathologie, microgliale activering, neurodegeneratie en motorische stoornissen 16,17,18,19,20. Deze studie presenteert een analyse van hoe de dosis virale vector en de tijd na virale vectorafgifte de mate van hαSyn-expressie, neurodegeneratie en neuro-inflammatie in de nigrostriatale route beïnvloedt, evenals de mate van motorische stoornissen in het muismodel van unilaterale stereotaxische toediening van hαSyn in het SN.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANIMALS AND ANIMAL FOOD</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3-GFP C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td>
			<td>Stock No:&#160;023800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Rodent Diet</td>
			<td>LabDiet</td>
			<td>Rodent Diet 5001</td>
			<td>Standard Rodent diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td>
			<td>Stock No: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIRAL VECTORS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CBA-&#945;Syn</td>
			<td>University of Iowa Viral Vector Core Facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stock concentration at 10E13 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CBA-eGFP</td>
			<td>University of Iowa Viral Vector Core Facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stock concentration at 9.5 x 10E12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANESTHETICS AND ANALGESICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>218082</td>
			<td>1% for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Drag Pharma</td>
			<td>CHE30</td>
			<td>70 mg/Kg&#160; for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>VE2L9117</td>
			<td>For before transcardial perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tramadol</td>
			<td>Drag Pharma</td>
			<td>DPH134</td>
			<td>30 mg/Kg every 24 h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Centrovet</td>
			<td>EHL40</td>
			<td>9 mg/kg for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam test</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>horizontal beam 25 cm length and 3 cm width. The beam surface was covered by a metallic grid (1 cm2).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostate</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>S2800 Coolpix</td>
			<td>For recording the beam test performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Used for IHC analysis (section 4.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI8</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Standard Stereotaxic, mouse</td>
			<td>Stoelting, Wood Dale, IL, USA</td>
			<td>51500</td>
			<td>stereotaxic frame for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>C-flex L/S16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply unit</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-RFL-T</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suture</td>
			<td>Sylkam&#174;, B Braun</td>
			<td>C0760171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 100 U</td>
			<td>BD</td>
			<td>324918</td>
			<td>For anesthesia before transcardial perfusion, 29G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe RN 5uL SYR W/O NEEDLE</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>HA-7641-01</td>
			<td>For viral vector innoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUFFERS AND REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aviden, Peroxidase Conjugate</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>189728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotrotection buffer</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20% glycerine and 2% DMSO in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount -G T</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>104078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>5000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>104005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.125 M, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase inactivating buffer</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.03% H2O2 in methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Hydrochloride</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>822184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>111065003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-alpha-Synuclein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-Iba-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR16588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Prism</td>
			<td>6.0</td>
			<td>Fos stats analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image capture with Leica microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProgRes Capture Pro</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image capture with Olympus microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VLC media player</td>
			<td>VideoLAN Organization</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For analysis of behavioural tests</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human &#945;-synuclein

De ziekte van Parkinson is een neurodegeneratieve aandoening die de dood van de dopaminerge neuronen van de nigrostriatale route en bijgevolg het progressieve verlies van controle over vrijwillige bewegingen met zich meebrengt. Dit neurodegeneratieve proces wordt veroorzaakt door de afzetting van eiwitaggregaten in de hersenen, die voornamelijk bestaan uit α-synucleïne. Verschillende studies hebben aangetoond dat neuro-inflammatie nodig is om de neurodegeneratie geassocieerd met de ziekte van Parkinson te ontwikkelen. Met name het neuro-inflammatoire proces omvat microgliale activering en de infiltratie van perifere T-cellen in de substantia nigra (SN). Dit werk analyseert een muismodel van de ziekte van Parkinson dat microgliale activering, T-celinfiltratie in het SN, de neurodegeneratie van nigral dopaminerge neuronen en motorische stoornissen samenvat. Dit muismodel van de ziekte van Parkinson wordt geïnduceerd door de stereotaxische afgifte van adeno-geassocieerde virale vectoren die coderen voor het menselijke wildtype α-synucleïne (AAV-hαSyn) in het SN. De juiste afgifte van virale vectoren in het SN werd bevestigd met behulp van controlevectoren die coderen voor groen fluorescerend eiwit (GFP). Daarna werd geëvalueerd hoe de dosis AAV-hαSyn toegediend in het SN de mate van hαSyn-expressie, het verlies van nibrale dopaminerge neuronen en motorische stoornissen beïnvloedde. Bovendien werd de dynamiek van hαSyn-expressie, microgliale activering en T-celinfiltratie bepaald gedurende het tijdsverloop van de ontwikkeling van de ziekte. Deze studie biedt dus kritieke tijdspunten die nuttig kunnen zijn voor het richten op synucleïnepathologie en neuro-inflammatie in dit preklinische model van de ziekte van Parkinson.

Valideren van de juiste afgifte van AAV-vectoren in de dopaminerge neuronen van de nigrostriatale route Om de processen van neuro-inflammatie, neurodegeneratie en motorische stoornissen te bestuderen die worden bevorderd door synucleïnepathologie, werd een muismodel van de ziekte van Parkinson gebruikt dat werd geïnduceerd door de unilaterale stereotaxische toediening van AAV-codering hαSyn in de SN 16,17,30,31 (zie het experimentele ontwerp in aanvullende figuur 1 ). Om de juiste afgifte van AAV-vectoren in de dopaminerge neuronen van de nigrostriatale route te valideren, werd AAV-codering GFP (AAV-GFP) geïnjecteerd in het SN en 12 weken later werden GFP-fluorescentie en tyrosinehydroxylase (TH) immunoreactiviteit geanalyseerd in het SN en striatum door immunofluorescentie. De GFP-geassocieerde fluorescentie werd uitsluitend aan de ipsilaterale kant waargenomen en er was significante colocalisatie met TH-immunoreactiviteit in zowel het SN als het striatum, wat wijst op de juiste afgifte van AAV-vectoren in de dopaminerge neuronen van de nigrostriatale route (figuur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig01.jpg"> Figuur 1: Analyse van de toediening van AAV-GFP in de nigrostriatale route. Muizen kregen AAV-GFP (1 x 1010 vg/muis) en 12 weken later werden ze opgeofferd, en TH werd immunostained in (A) de SN (schaalstaven zijn 118 μm) en (B) het striatum (schaalstaven zijn 100 μm). TH- en GFP-geassocieerde fluorescentie werden geanalyseerd door epifluorescentiemicroscopie. Kernen werden bevlekt met DAPI. Representatieve afbeeldingen van samengevoegde of enkele kleuring van TH (rood), GFP (groen) en DAPI (blauw) worden weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Het instellen van de dosis virale vector toegediend om neurodegeneratie en motorische stoornissen te induceren in het muismodel van de ziekte van Parkinson geïnduceerd door AAV-hαSyn Om de dosis AAV-hαSyn te testen die nodig is om een significante overexpressie van hαSyn te induceren die neurodegeneratie van de nizige dopaminerge neuronen bevordert, werden verschillende doses (1 x 108 virale genomen [vg]/muis, 1 x 109 vg/muis, of 1 x10 10 vg/muis) van AAV-hαSyn geïnjecteerd, en 12 weken later werden hαSyn immunoreactiviteit en de mate van TH immunoreactiviteit geëvalueerd in de nigrostriatale route. Hoewel hαSyn immunoreactiviteit duidelijk was bij alle doses die in het SN werden getest (figuur 2), vertoonden alleen muizen die 1 x 1010 vg/muis kregen een duidelijke hαSyn immunoreactiviteit in het striatum (figuur 3). Bovendien vertoonden muizen die 1 x 1010 vg/muis AAV-hαSyn kregen een significant verlies van dopaminerge neuronen in het SN (figuur 4A,B). Hoewel muizen die 1 x 1010 vg/muis AAV-GFP kregen een lage mate (~20%) neuronaal verlies vertoonden (figuur 4A,B), vertoonden muizen die dezelfde dosis AAV-hαSyn kregen een significant hogere mate van neurodegeneratie van nizige dopaminerge neuronen (figuur 4C). Dienovereenkomstig werden verdere experimenten uitgevoerd met 1 x 1010 vg/muis van AAV-hαSyn. Bovendien werd de mate van motorische stoornissen bepaald bij muizen die verschillende doses AAV-hαSyn kregen met behulp van de bundeltest (figuur 5A), zoals beschreven vóór25. Een significante vermindering van de motorprestaties werd uitsluitend gedetecteerd met 1 x 1010 vg/muis van AAV-hαSyn in de bundeltest, zowel bij het vergelijken van het aantal fouten van de rechter- en linkerpads (figuur 5B) als bij het vergelijken van het totale aantal fouten van muizen die AAV-hαSyn kregen in vergelijking met muizen die de controlevector AAV-GFP ontvingen (figuur 5C). Dienovereenkomstig werden verdere experimenten uitgevoerd met 1 x 1010 vg/muis van AAV-hαSyn.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig02.jpg"> Figuur 2: Analyse van humane α-synucleïneexpressie in het SN van muizen behandeld met verschillende doses AAV-hαSyn. Muizen kregen AAV-hαSyn bij (A) 1 x 1010 vg/muis, (B) 1 x 109 vg/muis, of (C) 1 x 108 vg/muis en 12 weken later werden opgeofferd, en de hαSyn-expressie werd geanalyseerd door immunofluorescentie in het SN met behulp van epifluorescentiemicroscopie. Kernen werden bevlekt met DAPI. Representatieve afbeeldingen van samengevoegde of enkele kleuring van hαSyn (rood) of DAPI (blauw) worden getoond. Schaalbalken zijn 118 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig03.jpg"> Figuur 3: Analyse van de menselijke α-synucleïneexpressie in het striatum van muizen behandeld met verschillende doses AAV-hαSyn. Muizen kregen AAV-hαSyn bij (A) 1 x 1010 vg/muis, (B) 1 x 109 vg/muis, of (C) 1 x 108 vg/muis) en 12 weken later werden opgeofferd, en de hαSyn-expressie werd geanalyseerd door immunofluorescentie in het striatum met behulp van epifluorescentiemicroscopie. Kernen werden bevlekt met DAPI. Representatieve afbeeldingen van samengevoegde of enkele kleuring van hαSyn (rood) of DAPI (blauw) worden getoond. Schaalbalken zijn 100 μm. De invoegsel in de rechterbovenhoek van de samengevoegde afbeeldingen toont een interessegebied voor een hogere vergroting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig04.jpg"> Figuur 4: Verlies van dopaminerge neuronen van het SN bij muizen behandeld met verschillende doses AAV-hαSyn of controlevector. Muizen kregen AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/muis, 1 x 109 vg/muis, of 1 x 108 vg/muis) of AAV-GFP (1 x 1010 vg/muis) en 12 weken later werden opgeofferd, en TH werd geanalyseerd in de SNpc door immunohistochemie. (A) Representatieve afbeeldingen. Schaalstaven, 100 μm. (B,C) De dichtheid van neuronen werd gekwantificeerd als het aantal TH+ neuronen/mm2. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. n = 3-8 muizen per groep. (B) Een vergelijking van ipsilaterale met contralaterale zijden werd uitgevoerd met behulp van de tweezijdige gepaarde Student's t-test. (C) Er werd een vergelijking uitgevoerd van ipsilaterale zijden van muizen die 1 x10 10 vg/muis AAV-hαSyn of AAV-GFP kregen. (B,C) Terwijl witte balken de kwantificering van TH + neuronen aan de ipsilaterale kant van muizen die AAV-hαSyn ontvangen aangeven, geven groene balken de kwantificering aan van TH + neuronen aan de ipsilaterale kant van muizen die AAV-GFP ontvangen. Grijze balken geven de kwantificering van TH+ neuronen aan de contralaterale kant van de overeenkomstige groep aan. Vergelijkingen werden uitgevoerd door een tweezijdige ongepaarde Student's t-test. *p < 0,05; **p < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig05.jpg"> Figuur 5: Analyse van de motorische prestaties bij muizen die werden behandeld met verschillende doses AAV-hαSyn. Muizen kregen verschillende doses (1 x 1010 vg/muis, 1 x 109 vg/muis, of 1 x 108 vg/muis) AAV-hαSyn of AAV-GFP, en 12 weken later werden de motorische prestaties geëvalueerd door de bundeltest. (A) Afbeelding van een muis die op de balk loopt. (B) Het aantal fouten uitgevoerd door linker ledematen (contralateraal) versus rechter ledematen (ipsilateraal) werd gekwantificeerd in de groepen muizen die AAV-hαSyn kregen. (C) Het totale aantal fouten werd vergeleken tussen verschillende experimentele groepen die dezelfde dosis AAV-hαSyn of AAV-GFP kregen. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. n = 3-5 muizen per groep. Vergelijkingen werden uitgevoerd door (B) een gepaarde tweezijdige Student's t-test of door (C) een ongepaarde twee-tailed Student's t-test. *p < 0,05; **p < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Opzetten van de kinetiek van het Parkinson-ziektemodel geïnduceerd door AAV-αSyn Na het bepalen van de juiste dosis AAV-hαSyn die werd gebruikt om een significant niveau van neurodegeneratie en motorische stoornissen te induceren, werden experimenten uitgevoerd om het begin van hαSyn-overexpressie te definiëren. Voor dit doel werden muizen behandeld met 1 x 1010 vg/muis van AAV-hαSyn of schijnchirurgie. De mate van hαSyn-expressie werd eenmaal per week in het SN geanalyseerd gedurende week 2-5 na de stereotaxische operatie (zie het experimentele ontwerp in aanvullende figuur 2). De resultaten tonen aan dat, ondanks dat hαSyn-expressie al 2 weken na de operatie op lage niveaus werd gedetecteerd, hαSyn-clusters verschenen in week 5 na de stereotaxische operatie (figuur 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig06.jpg"> Figuur 6: Analyse van het tijdsverloop van menselijke α-synucleïne-expressie in het SN van muizen behandeld met AAV-hαSyn. Muizen kregen AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/muis) of alleen de schijn stereotaxische chirurgie, en de expressie van hαSyn in de SN werd geanalyseerd (A) 2 weken, (B) 3 weken, (C) 4 weken of (D) 5 weken later door immunofluorescentie met behulp van epifluorescentiemicroscopie. Kernen werden bevlekt met DAPI. Representatieve afbeeldingen van samengevoegde of enkele kleuring van hαSyn (rood) of DAPI (blauw) worden getoond. Schaalstaven, 100 μm. De invoegsel in de rechterbovenhoek van de samengevoegde afbeeldingen toont een interessegebied voor een hogere vergroting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Daarna werden experimenten uitgevoerd om de geschikte tijdspunten te bepalen om neuro-inflammatie en T-celinfiltratie in het centrale zenuwstelsel (CZS) te analyseren na de stereotaxische levering van AAV-hαSyn. Om de piek van microgliale activering na de behandeling van muizen met AAV-hαSyn te bepalen, werd de mate van cellen met hoge niveaus van Iba1 in het striatum eenmaal per week geëvalueerd gedurende week 2-15 na de stereotaxische operatie. De resultaten tonen een significante toename van de microgliale activering van de ipsilaterale zijde in vergelijking met de contralaterale zijde van muizen 15 weken na de behandeling met AAV-hαSyn (figuur 7). Het aantal Treg (CD4+ Foxp3+) cellen geïnfiltreerd in de SNpc werd ook geëvalueerd op verschillende tijdstippen na de stereotaxische levering van AAV-hαSyn door immunofluorescentie na confocale microscopie-observatie. De resultaten laten zien dat de piek van Treg-infiltratie in de SNpc 11 weken na de operatie was, terwijl de mate waarin Treg dit deel van de hersenen infiltreerde lager was in week 8 of week 13 na de operatie (figuur 8). Er werden geen CD4+ T-cellen gedetecteerd die het striatum infiltreerden (gegevens niet getoond). Al met al geven deze resultaten aan dat, met behulp van 1 x10 10 vg /muis van AAV-hαSyn, het meest geschikte tijdstip om neuro-inflammatie te analyseren week 15 na de stereotaxische operatie is, terwijl een geschikt tijdstip om T-celinfiltratie in het CZS te analyseren week 11 na AAV-hαSyn-behandeling lijkt te zijn.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig07.jpg"> Figuur 7: Analyse van het tijdsverloop van microgliale activatie bij muizen die zijn geënt met AAV-hαSyn. Muizen kregen AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/muis) en microgliale activering werd geëvalueerd door immunohistochemische analyse van Iba1 in het striatum op verschillende tijdstippen na de operatie. (A) Representatieve overzichtsbeelden van immunohistochemische analyse van Iba1 van muizen die 5 weken, 10 weken of 15 weken na inenting met AAV-hαSyn zijn opgeofferd, worden getoond. Schaalstaven, 110 μm. (B) De dichtheid van geactiveerde microglia werd gekwantificeerd als het aantal cellen dat hoge niveaus van Iba1 en ameboïde vorm per gebied tot expressie brengt. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. n = 3 muizen per groep. Een tweezijdig gepaarde Student's t-test werd gebruikt om statistische verschillen tussen ipsilaterale en contralaterale Iba1 in elke groep te bepalen. *p < 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig08.jpg"> Figuur 8: Analyse van het tijdsverloop van CD4+ T-celinfiltratie in het SN van muizen die zijn ingeënt met AAV-hαSyn. Foxp3gfp reporter muizen kregen AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/muis). De aanwezigheid van CD4+ T-cellen die Foxp3 tot expressie brengen en de aanwezigheid van TH+ neuronen werden geanalyseerd op verschillende tijdstippen (week 8, week 11 en week 13 na de operatie) in het SN door immunofluorescentie. (A) Representatieve beelden voor enkelvoudige immunostaining of de samenvoeging worden getoond. Schaalbalken, 100 μm. (B) Het aantal CD4+ Foxp3+ T-cellen per gebied in het SN werd gekwantificeerd. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM van 3 muizen per groep. *p<0,05, ipsilaterale versus contralaterale CD4+ Foxp3+ T-cellen door tweezijdige Student's t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur 1: Experimenteel ontwerp voor het evalueren van het effect van verschillende doses AAV-vectoren op synucleïnepathologie, neurodegeneratie en motorische stoornissen. Wild-type mannelijke C57BL/6 muizen werden verdoofd en kregen stereotaxische inenting van verschillende doses (1 x 1010 vg/muis, 1 x 109 vg/muis, of 1 x 108 vg/muis) van AAV die codeert voor menselijk α-synucleïne (AAV-hαSyn) of eGFP (AAV-GFP) onder controle van de CBA promotor in de juiste substantia nigra (SN). Na 12 weken werden de expressie van GFP en hαSyn in het SN en striatum (Str) geëvalueerd door immunofluorescentie (IF), tyrosinehydroxylasepositieve (TH+) cellen werden gekwantificeerd door immunohistochemie (IHC) in het SN en werden de motorische prestaties geëvalueerd door de bundeltest. Het aantal muizen in elke experimentele groep wordt tussen haakjes aangegeven. * geeft groepen aan waar één muis stierf vóór de analyses. Elke analyse geeft tussen haakjes het nummer aan van de figuur uit de hoofdtekst van het papier waar de overeenkomstige resultaten worden weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 2: Experimenteel ontwerp voor het bepalen van de kinetiek van T-celinfiltratie, neuro-inflammatie en hαSyn-expressie. Foxp3gfp reporter muizen werden verdoofd en kregen stereotaxische inenting van AAV (1 x 1010 vg/muis) die codeert voor menselijk α-synucleïne (AAV-hαSyn) onder controle van de CBA promotor in de juiste substantia nigra (SN) of schijnchirurgie (PBS). Muizen werden op verschillende tijdstippen geofferd en de expressie van hαSyn in het SN en striatum werd geëvalueerd door immunofluorescentie (IF), GFP (Foxp3), CD4 en tyrosinehydroxylasepositieve (TH +) cellen werden gekwantificeerd door IF in de SN, en Iba1-expressie werd geanalyseerd door immunohistochemie (IHC) in het striatum (Str). Het aantal muizen in elke experimentele groep wordt aangegeven. Het bereik van de tijdspunten die in elke analyse zijn opgenomen, wordt aangegeven. Elke analyse geeft tussen haakjes het nummer aan van de figuur uit de hoofdtekst van het papier waar de overeenkomstige resultaten worden weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human ÃŽÂ±-Synuclein at JoVE.com

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein

Dit werk analyseert de vectordosis en blootstellingstijd die nodig is om neuro-inflammatie, neurodegeneratie en motorische stoornissen te induceren in dit preklinische model van de ziekte van Parkinson. Deze vectoren die coderen voor de menselijke α-synucleïne worden afgeleverd in de substantia nigra om de synucleïnepathologie geassocieerd met de ziekte van Parkinson samen te vatten.

Analyse van het muismodel van de ziekte van Parkinson geïnduceerd door Adeno-geassocieerde virale vectoren die coderen voor menselijk α-synucleïne

Parkinson&#39;s disease is a neurodegenerative disorder that involves the death of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway and, ...

Het algemene doel van deze procedure is om de meeste essentiële aspecten van de ziekte van Parkinson te reproduceren in een diermodel. De stereotaxische afgifte van adeno-geassocieerde virale vectoren, coderend voor het menselijke synucleïne in de substantia nigra. De ziekte van Parkinson is een neurodegeneratieve aandoening die de dood van dopaminerge neuronen met zich meebrengt, in de nigrostriatale route, en bijgevolg de progressie van verlies van controle over vrijwillige beweging.Dit neurodegeneratieve proces gaat gepaard met afzetting van eiwitaggregatie in de hersenen, die voornamelijk worden gevormd door synucleïne. Opkomend bewijs heeft aangetoond dat synucleïneaggregaten toll-like receptoren op de microglia kunnen stimuleren, waardoor neurale ontsteking in de substantia nigra wordt veroorzaakt. Bovendien zijn er aanwijzingen dat synucleïneaggregaten kunnen worden gevangen en gepresenteerd, door antigeen-presenterende cellen aan T-cellen, waardoor een adaptieve immuunrespons wordt geïnduceerd die specifiek is voor synucleïne.De stereotaxische levering van adeno-geassocieerde virale vectoren die coderen voor het menselijke synucleïne in de substantia nigra, heeft aangetoond dat het vele essentiële aspecten van de ziekte reproduceert, waaronder synucleïnepathologie, microgliale activering, T-celactivatie, neurodegeneratie en motorische stoornissen. Deze studie presenteert een analyse van hoe een virale vector en de tijd na virale vectorafgifte de mate van menselijke synucleïneexpressie, neurodegeneratie en neuro-inflammatie in de nigrostriatale route beïnvloedt, evenals de mate van motorische stoornissen in een muismodel van unilaterale stereotaxische levering van menselijk synucleïne in substantia nigra. Om een aseptische omgeving te behouden, draagt u geschikte chirurgische kleding tijdens de hele operatie, inclusief schoenovertrekken, operatiemasker, sanitaire barrière, handschoenen en operatiemuts.Spuit ethanol op de muis en al het chirurgische materiaal om de aseptische omgeving te behouden. Om een analgesie te induceren, injecteert u carprofen subcutaan elke 12 uur, beginnend een uur voor de operatie en doorgaand tot drie dagen na de operatie. Om de muis te verdoven, plaatst u het dier in een inductiekamer.Open de isofluraanstroom met een snelheid van 0,5% en verhoog deze vervolgens langzaam tot 5% gedurende ongeveer vijf minuten totdat de muis zijn rechtreflex heeft verloren. Verwijder het dier uit de inductiekamer. Breng het dier onmiddellijk over naar een niet-rebreathing circuit met een neuskegel van de juiste grootte.Handhaaf de muisanesthesie, met isofluraan 1% gedurende de hele tijd van de operatie. Bevestig dat de muis volledig is verdoofd door in zijn staarten en poten te knijpen. Wanneer de muis niet reageert bij het knijpen van de staart en poten, betekent dit dat de muis volledig is verdoofd.Scheer de muizenkop met een schaar. Reinig de muizenhuid met een wattenstaafje met chloorhexidine 2% en verwijder al het haar. Bevestig de muiskop in het stereotaxische frame.Plaats een hoornvliesbeschermer in beide muizenogen, met behulp van een wattenstaafje. Om stressinductie bij andere knaagdieren te voorkomen, vermijdt u de aanwezigheid van een andere muis in de operatiekamer. Reinig de muizenkop met drie ronden chloorhexidine 2%, gevolgd door ethanol 70% Bedek de schedel met chirurgisch materiaal en maak een dun gat met een boor op coördinaten anteroposterior 2,8 mm en mediolateraal 1,4 mm, met betrekking tot de mediale lijn.Steek de naald van een spuit van 10 microliter in het gat en beweeg de naald langzaam in de hersenen, totdat hij 7,2 mm dorsoventral bereikt, ten opzichte van dura. Laat de naald twee minuten in de eindpositie staan, zodat het weefsel een beetje kan bezinken, en injecteer vervolgens elke 30 seconden een microliter virale vectoren in de rechter substantia nigra, met een snelheid van 0,2 microliter. Laat de naald vijf minuten na de levering van virale vectoren in dezelfde positie staan en trek hem vervolgens langzaam terug.Sluit de wond met een steriele zijden hechtdraad. Plaats de muis in de huiskooi, voorverwarmd door hem over een elektrisch warm matras te leggen. Beoordeel 12 weken na de stereotaxische operatie de motorische prestaties met behulp van een vereenvoudigde versie van de straaltest, die eerder is beschreven.Gebruik hiervoor een horizontale balk van 25 cm lang en 3 cm breed. Het balkoppervlak moet worden bedekt door een metalen rooster met vierkanten van één centimeter en een centimeter boven de balk worden verhoogd. Maak een video van de muis, terwijl je de rasteroppervlakstraal doorkruist, van het ene uiteinde naar het andere uiteinde van de balk, waar de thuiskooi zich bevindt.Train de muis gedurende twee dagen, vóór de bepaling van de motorprestaties. Train de muis op de eerste dag om vijf keer door de balk te lopen, zonder het raster. Train op de tweede dag de muis om vijf keer door de balk te lopen, in aanwezigheid van raster.Evalueer op de derde dag de motorprestaties. Om dit te doen, kwantificeert u het aantal fouten dat is uitgevoerd, door de linkerpoten of door de rechtervoeten afzonderlijk, door de video's in een slow-motionmodus te bekijken. Om de muis te verdoven, injecteert u een mengsel van ketamine en xylazine intraperitoneaal.Zodra de muis volledig is verdoofd, opent u de thorax met chirurgisch materiaal en stelt u het hart bloot. Steek vervolgens een naald met platte punt in de linkerkamer van het hart. Door de naald aan een pijp te koppelen, perfundeer 50 milliliter fosfaatbufferzoutoplossing, met een snelheid van 9,5 milliliter per minuut, met behulp van een peristaltische pomp.Verwijder de hersenen met een schaar en pincet en fixeer het vervolgens door onderdompeling, in vijf milliliter 4% paraformaldehyde, in fosfaatbufferzoutoplossing. Plaats daarna de vaste hersenen, in 15 milliliter van 30% sucrose gedurende 48 uur. Plaats vervolgens de hersenen in vier milliliter cryoprotectie-oplossing en bewaar de hersenen op 80 graden, of gebruik het onmiddellijk in de volgende stap.Om striatale plakjes te verkrijgen, snijdt u de hersenen in 40 micrometer dikke secties, beginnend bij 1,34 mm en eindigend bij 0,26 mm. Oogst elke plak in een cryobuis van twee milliliter, volgens anteroposteriorbevel. Om immunohistochemische en immunofluorescentieanalyse in het striatum uit te voeren, kiest u vijf coronale striatale secties met uniforme intervallen, die de volledige rostrocaudale omvang van de kern bestrijken.Om de juiste afgifte van virale vectoren in de dopaminerge neuronen van de nigrostriatale route te valideren, werden vectoren die coderen voor GFP geïnjecteerd, in de substantia nigra, en 12 weken later werden de GFP-fluorescentie en tyrosinehydroxylase-immunoreactiviteit geanalyseerd in de substantia nigra en het striatum door immunofluorescentie. De GFP-geassocieerde fluorescentie bevond zich uitsluitend op de ipsilaterale plaats en een significante colocalisatie met tyrosinehydroxylase-immunoreactiviteit werd waargenomen in zowel substantia nigra als striatum, wat wijst op de juiste afgifte van virale vectoren in de dopaminerge neuronen van de nigrostriatale route. Om de dosis vectoren te testen, coderend voor synucleïne vereist, om een significante overexpressie van menselijk synucleïne te induceren die neurodegeneratie van de ninigrale dopaminerge neuronen bevordert, werden verschillende doses van de vectoren geïnjecteerd.En 12 weken later werden de menselijke synucleïne-immunoreactiviteit en de mate van tyrosinehydroxylase-immunoreactiviteit getest in de nigrostriatale route. Humane synucleïne immunoreactiviteit was duidelijk, met alle doses getest in de substantia nigra. Echter, alleen muizen die 10 tot de 10 virale genomen per muis ontvingen, vertoonden duidelijke menselijke synucleïne immunoreactiviteit, in het striatum.Muizen die 10 tot de 10 virale genomen per muis ontvingen van vectoren die coderen voor menselijk synucleïne, vertoonden een significant verlies van dopaminerge neuronen in de substantia nigra. Hoewel muizen die dezelfde dosis vectoren kregen die coderen voor GFP, een lage mate van neuronaal verlies vertoonden, vertoonden deze muizen een significant lagere mate van neurodegeneratie, in vergelijking met die muizen die vectoren ontvingen, coderend voor menselijk synucleïne. Met behulp van de bundeltest werd uitsluitend bij die muizen een significante vermindering van de motorische prestaties gedetecteerd, waarbij 10 tot 10 virale genomen per muis van vectoren die coderen voor menselijk synucleïne werden ontvangen, bij het vergelijken van het aantal fouten van de rechter- en de linkerpoot, of bij het vergelijken van het totale aantal fouten, van muizen die vectoren ontvingen die coderen voor menselijk synucleïne, waarbij die muizen de controlevector ontvangen.Om het begin van menselijke synucleïne-expressie te definiëren, werden muizen behandeld met 10 tot de 10 virale genomen per muis, van vectoren die coderen voor menselijk synucleïne of schijnchirurgie, en de mate van menselijke synucleïne-expressie werd geanalyseerd in de substantia nigra, eenmaal per week, gedurende weken twee tot vijf na de stereotaxische operatie. De resultaten tonen aan dat menselijke synucleïne-expressie duidelijk begon te worden in week vijf na de stereotaxische operatie. Om de piek van microgliale activering te bepalen, werd de mate van cellen die hoge niveaus van Iba1 tot expressie brachten, gekwantificeerd in het striatum van muizen, gedurende weken 2-15 na de operatie.De resultaten tonen een significante toename van microgliale activering van de ipsilaterale kant, vergeleken met de contralaterale kant van muizen, 15 weken na de virale inenting. Het aantal regulerende T-cellen geïnfiltreerd in de substantiële nigra werd geanalyseerd op verschillende tijdstippen, na de stereotaxische chirurgie door immunofluorescentie, gevolgd door confocale microscopie-observatie. De piek van regulerende T-celinfiltratie in de substantia nigra werd waargenomen in week 11 na de operatie.Het muismodel van neurodegeneratie dat hier wordt geanalyseerd, vertegenwoordigt een nuttig model om aantallen belangrijke aspectbetrokkenheid in de pathofysiologie van de ziekte van Parkinson te bestuderen. Betrokkenheidsmechanismen die betrokken zijn bij synucleïnepathologie, microgliale activering, de betrokkenheid van het perifere immuunsysteem, bij neuro-inflammatie en de mechanismen van neurodegeneratie Een juiste dosis adeno-geassocieerde virale vector, subtype vijf die codeert voor menselijk synucleïne om neurodegeneratie, neuro-inflammatie, T-celleninfiltratie en motorische stoornissen te induceren, is 10 tot de 10 virale genomen per muis. Deze studie toont aan dat vijf weken na de stereotaxische operatie een belangrijk tijdstip vormt, waarin menselijke synucleïne-expressie al duidelijk was, maar zonder motorische stoornissen in dit diermodel.Daarbij vertegenwoordigt dit tijdspunt een interessant temporeel punt, om te beginnen met de toediening van experimentele therapieën die zijn toegesneden op het stoppen van de voortgang van neuro-inflammatie en neurodegeneratie. Het meest geschikte tijdstip om neuro-inflammatie in dit diermodel te analyseren, is in week 15 na een stereotaxische operatie. Terwijl een goed moment om T-cel infiltratie in het centrale zenuwstelsel te analyseren.lijkt in week 11 na virale vectorinenting te zijn.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human &#945;-Synuclein

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracraniële Injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Detectie van neuritische plaques in de ziekte van Alzheimer Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

Methoden te karakteriseren Spontane en Schrik-geïnduceerde Locomotion in een-Rotenon geïnduceerde Parkinson&#39;s Disease Model van<em&gt; Drosophila</em

Parkinson&#8217;s disease is a neurodegenerative disorder that results from the degeneration of dopaminergic neurons in the central nervous system, ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Productie, zuivering en kwaliteitscontrole voor Adeno-associated Virus gebaseerde vectoren

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Convectie verbeterde levering van Optogenetische adeno-geassocieerde virale vector aan de cortex van rhesus macaque onder begeleiding van online MRI-beelden

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

In vivo directe herprogrammering van ingezeten gliacellen in interneuronen door intracerebrale injectie van virale vectoren

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Cochleaire oppervlakte voorbereiding in de volwassen muis

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Applying the RatWalker System for Gait Analysis in a Genetic Rat Model of Parkinson's Disease

Het ratwalkersysteem toepassen voor loopanalyse in een genetisch rattenmodel van de ziekte van Parkinson

Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder caused by the loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars ...

The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease

Het 6-hydroxydopamine rattenmodel van de ziekte van Parkinson

Motor symptoms of Parkinson's disease (PD)-bradykinesia, akinesia, and tremor at rest-are consequences of the neurodegeneration of dopaminergic neurons in ...