Name: analyzing the parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human &#945;-synuclein
Uploaded: 2022-07-29T13:00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human ÃŽÂ±-Synuclein at JoVE.com

Ringraziamo il Dr. Sebastián Valenzuela e il Dr. Micaela Ricca per la loro preziosa assistenza veterinaria nella nostra struttura per animali. Questo lavoro è stato supportato da "Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID" Centro Ciencia & Vida, FB210008 (a Fundación Ciencia & Vida), e il Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, FONDAP-15150012. Questo lavoro è stato anche finanziato dalle sovvenzioni FONDECYT-1210013 (a R.P.) e FONDECYT-1150766 (a F.C.) da "Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID)" e MJFF-10332.01 (a R.P.) e MJFF-17303 (a F.C.) dalla Michael J Fox Foundation for Parkinson's Research.

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di interessi finanziari o non finanziari concorrenti.

Il modello murino di neurodegenerazione qui analizzato potrebbe aiutare a studiare molti aspetti critici coinvolti nella fisiopatologia della malattia di Parkinson, compresi i meccanismi coinvolti nella patologia αSyn e nell'attivazione microgliale, il coinvolgimento del sistema immunitario periferico nella regolazione della neuroinfiammazione e i meccanismi della neurodegenerazione. Tra i meccanismi coinvolti nella patologia αSyn ci sono quei meccanismi subcellulari associati a disfunzione mitocondriale, lisosomiale o proteasomiale in presenza di un carico eccessivo di αSyn nei neuroni dopaminergici dell'SN2. È importante considerare che, oltre all'espressione hαSyn indotta dalla trasduzione mediata da AAV, il topo endogeno αSyn contribuisce anche al carico dell'espressione totale di αSyn. I topi transgenici che sovraesprimono αSyn sviluppano patologia sinucleina, neuropatologia e compromissione motoria simili a quei modelli murini basati sulla sovraespressione di hαSyn32. Per quanto riguarda l'attivazione microgliale, il presente modello murino potrebbe essere utilizzato per studiare come diversi attori molecolari e cellulari come citochine, neurotrasmettitori, astrociti, neuroni, barriera emato-encefalica e cellule T potrebbero regolare l'acquisizione di fenotipi funzionali pro-infiammatori o anti-infiammatori 8,10,11 . Questo modello costituisce anche un importante strumento per studiare il ruolo del sistema immunitario periferico, comprendente non solo le cellule T ma anche macrofagi, monociti e neutrofili, sui processi di neuroinfiammazione e neurodegenerazione dei neuroni nigrali 11,33,34. Infine, questo modello murino rappresenta anche un valido sistema per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della neurodegenerazione in vivo, compresi quelli indotti da processi cellulari interni, come lo stress ossidativo, i deficit energetici e gli organelli danneggiati 2, o quelli esercitati da attori esterni, come i fattori neurotossici prodotti da cellule microgliali, astrociti e cellule T citotossiche8, 28,29,35.
Un limite di questo modello murino è lo studio di come l'aggregazione patologica di αSyn in posizioni extra-cerebrali potrebbe costituire le fasi iniziali nello sviluppo della malattia di Parkinson36. A questo proposito, ci sono prove crescenti che indicano che, prima della neurodegenerazione dei neuroni nigrali e della compromissione motoria, la patologia αSyn inizia nella mucosa intestinale e nell'epitelio olfattivo36 e, probabilmente, nella risposta delle cellule T αSyn-specifica anche12. Successivamente, gli aggregati αSyn migrerebbero attraverso il nervo vago verso il tronco cerebrale, innescando la neuroinfiammazione e la neurodegenerazione dei neuroni dopaminergici12. Sebbene il modello AAV-hαSyn ricapitoli la maggior parte degli aspetti della malattia di Parkinson, non vi è alcun evidente coinvolgimento dell'aggregazione patologica di αSyn in posizioni extra-cerebrali in questo modello. Un modello alternativo che coinvolge la patologia hαSyn appropriato per studiare questi aspetti della malattia di Parkinson potrebbe essere topi transgenici che sovraesprimono hαSyn sotto il controllo del promotore Thy1, il modello Thy1-SNCA 37, in cui lo sviluppo della malattia dipende dal microbiota intestinale e comporta un evidente deterioramento gastrointestinale38.
Sebbene sia utile per lo studio dei diversi processi associati alla fisiopatologia della malattia di Parkinson, il presente modello murino comporta passaggi critici che dovrebbero essere minuziosamente controllati, tra cui la corretta consegna dei vettori virali nelle coordinate spaziali corrispondenti, l'espressione selettiva di hαSyn nei neuroni (che dipende dal sierotipo AAV e dal costrutto vettoriale), e la corretta dose di AAV e la tempistica prima di analizzare il fenotipo parkinsoniano. L'analisi della corretta consegna dei vettori virali nel SN è necessaria, in quanto l'uso delle coordinate spaziali corrette del SN potrebbe non essere sufficiente quando l'ago non è completamente dritto, che a volte è impercettibile per l'occhio umano. Inoltre, la diffusione dei vettori AAV dipende dal sierotipoAAV 39. Per questi motivi, è necessario eseguire controlli periodici di qualità verificando la corretta consegna e diffusione dei vettori AAV-GFP iniettati a seguito dell'osservazione della GFP in fette di cervello contenenti l'area del SN.
Per quanto riguarda l'espressione selettiva di hαSyn nei neuroni, in linea di principio, l'espressione di hαSyn potrebbe essere progettata per essere controllata da un promotore selettivo per i neuroni o, ancora più precisamente, selettiva per i neuroni dopaminergici, come l'uso del promotore TH nei vettori AAV per indurre l'espressione selettiva dei geni nei neuroni dopaminergici40 . Tuttavia, questa strategia non funziona quando ciò che si cerca è la sovraespressione del gene di interesse. Per questo motivo, nel presente modello, è essenziale utilizzare un promotore forte (un promotore che induce un'alta espressione del gene a valle) e sierotipi AAV con tropismo neuronale. In questo studio, il promotore CBA è stato utilizzato come promotore forte per indurre la sovraespressione di hαSyn e il sierotipo AAV5 è stato utilizzato per il vettore virale. Questo sierotipo è stato usato in precedenza per trasdurre i neuroni di topo e ratto41,42. Qui, i risultati hanno dimostrato che, 12 settimane dopo la somministrazione di AAV5-GFP nel SN dei topi, la fluorescenza verde era selettivamente presente sul lato ipsilaterale sia del SN che dello striato (Figura 1), indicando l'efficiente trasduzione dei neuroni della via nigrostriatale.
Un altro aspetto critico di questo modello murino della malattia di Parkinson è il punto temporale necessario per analizzare un particolare processo dopo l'intervento chirurgico. A questo proposito, questo lavoro mostra uno studio cinetico di diversi processi coinvolti nella patologia. Poiché i punti temporali chiave cambiano con la dose di genomi virali somministrati per topo, il sierotipo di AAV utilizzato, o anche con il lotto di AAV utilizzato, è stata effettuata per la prima volta un'analisi dose-risposta della quantità di AAV-αSyn necessaria per indurre una significativa perdita di neuroni TH + e compromissione motoria. Studi precedenti hanno mostrato una significativa compromissione motoria e una perdita di neuroni TH+ della via nigrostriatale dopo 12 settimane di iniezioni di AAV-αSyn nei topi a dosi comprese tra 6 x 108-3 x 1010 genomi virali per topo 16,17,30,31. Di conseguenza, la dose di AAV-hαSyn utilizzata per indurre l'espressione di hαSyn nella via nigrostriatale, la perdita di neuroni TH+ e la compromissione motoria nei topi variavano da 1 x 108-1 x 1010 genomi virali per topo. Inoltre, per controllare che la perdita di neuroni TH+ e la compromissione motoria fossero indotte dalla sovraespressione di hαSyn nel SN e non dall'infezione AAV dei neuroni del SN, sono stati inclusi gruppi di controllo in cui AAV codificante per un gene reporter (AAV-eGFP) è stato erogato unilateralmente nel SN di topi e sono stati determinati neurodegenerazione e compromissione motoria. I risultati hanno mostrato che, 12 settimane dopo l'intervento stereotassico, 1 x 1010 genomi virali per topo era una dose corretta di AAV5-hαSyn, poiché i topi che ricevevano questa carica virale mostravano hαSyn significativo nella via nigrostriatale (Figura 2 e Figura 3), perdita di neuroni TH+ (Figura 4) e compromissione motoria (Figura 5). Al contrario, dosi più basse di AAV5-hαSyn (1 x 108 genomi virali per topo e 1 x 109 genomi virali per topo) non erano abbastanza forti da raggiungere cambiamenti significativi in tutti questi parametri insieme (Figure 2-4). Da notare, la somministrazione di AAV-GFP a 1 x 1010 genomi virali per topo ha indotto un basso (~20%), ma significativo grado di perdita di neuroni TH+ di neuroni dopaminergici ninigrali (Figura 4A,B). Questo risultato concorda con le precedenti osservazioni che utilizzano questo modello41 ed è probabilmente la conseguenza di un basso livello di neuroinfiammazione indotto dalla somministrazione di vettori AAV nel SN. Tuttavia, l'entità della perdita di neuroni TH+ era significativamente più alta nei topi che ricevevano AAV5-hαSyn rispetto a quelli che ricevevano la stessa dose di AAV-GFP (Figura 4C). Da notare, la cinetica dell'espressione di hαSyn non dipende solo dall'efficienza della trasduzione, ma anche dall'estensione della diffusione AAV39. Poiché la diffusione dell'AAV dipende dal sierotipo AAV, i punti temporali chiave precisi in questo modello animale possono variare quando si utilizza un altro sierotipo AAV diverso da AAV5.
Successivamente, è stata condotta un'analisi cinetica utilizzando 1 x 1010 genomi virali per topo per determinare i punti temporali chiave in questo modello murino. Poiché le prove attuali hanno mostrato alcuni sintomi precoci che compaiono prima della compromissione motoria, che consentirebbe la diagnosi precoce della malattia di Parkinson43,44, questi esperimenti hanno cercato di trovare il punto temporale in cui l'espressione di hαSyn era già evidente ma in assenza di compromissione motoria. I risultati mostrano che l'insorgenza dell'espressione di hαSyn nel SN è avvenuta a 5 settimane dopo la somministrazione stereotassica di AAV-hαSyn (Figura 6). Questo punto temporale costituisce un punto temporale interessante per iniziare a somministrare terapie su misura per fermare i processi neuroinfiammatori e neurodegenerativi. Altri punti temporali chiave qui determinati sono stati i tempi di picco per due eventi critici associati al processo di neuroinfiammazione: il momento in cui le microglia raggiungono il massimo grado di attivazione e il tempo di infiltrazione massima delle cellule T nel SN. I risultati hanno mostrato una curva con un trend che raggiunge due ondate di massima attivazione microgliale, la prima a 10 settimane dopo l'intervento e la seconda a 15 settimane dopo l'intervento (Figura 7). L'analisi cinetica dell'infiltrazione delle cellule T ha mostrato il tempo di picco dell'infiltrazione di Treg nel SN a 11 settimane dopo l'intervento stereotassico (Figura 8). Sorprendentemente, nessuna cellula T effettrice (CD4 + Foxp3-) è stata rilevata infiltrandosi nel SN durante il periodo di tempo analizzato (settimane 8-13 dopo l'intervento chirurgico). Complessivamente, questi risultati suggeriscono un adeguato lasso di tempo per iniziare a somministrare terapie orientate a fermare il processo di neuroinfiammazione e attenuare l'infiltrazione delle cellule T nel SN utilizzando questo modello preclinico, che varia tra la settimana 5 dopo l'intervento chirurgico (l'inizio della sovraespressione di hαSyn) e la settimana 10 dopo l'intervento chirurgico (la prima ondata di neuroinfiammazione e infiltrazione delle cellule T) (Figura 9).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig09.jpg"> Figura 9: Riepilogo dei punti temporali chiave trovati per questo modello animale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig09large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Dopo il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson è la seconda malattia neurodegenerativa più diffusa in tutto il mondo. I neuroni primari colpiti nella malattia di Parkinson sono quelli della via nigrostriatale, che producono dopamina e controllano il movimento volontario. Di conseguenza, il sintomo più caratteristico associato a questo disturbo è la compromissione motoria. Questa patologia comporta anche la deposizione di aggregati proteici nel cervello, che sono composti principalmente da α-sinucleina (αSyn)1, una proteina citosolica associata ai terminali presinaptici. L'evidenza ha dimostrato che la generazione di inclusioni patogene di αSyn è innescata da un misfolding o da alcune modifiche post-traduzionali di questa proteina2.
In particolare, è stata stabilita una stretta relazione tra la patologia αSyn e la perdita di neuroni dopaminergici della via nigrostriatale nella malattia di Parkinson umana e nei modelli animali 3,4. Capire come vengono generati gli aggregati αSyn e come inducono la morte neuronale rappresenta una sfida significativa nel campo. Un gruppo crescente di studi ha dimostrato che, aumentando lo stress ossidativo, la disfunzione mitocondriale è una delle principali cause per la generazione di aggregati αSyn2. Infatti, diversi geni associati al rischio di malattia di Parkinson codificano proteine coinvolte nella funzione mitocondriale, nella morfologia e nelladinamica 5,6. Inoltre, la disfunzione lisosomiale, che provoca l'accumulo di mitocondri disfunzionali e αSyn mal ripiegato, costituisce un altro evento importante che promuove la generazione di aggregati αSyn7.
Prove emergenti hanno indicato che, una volta che gli aggregati di αSyn si depositano nel cervello, queste proteine patogene stimolano i recettori toll-like (TLR) sulla microglia, innescando così l'attivazione microgliale e un ambiente infiammatorio iniziale nella substantia nigra (SN)8,9. Inoltre, l'evidenza indica che gli aggregati di αSyn vengono catturati e presentati dalle cellule che presentano l'antigene alle cellule T, inducendo una risposta immunitaria adattativa specifica per αSyn10,11. Queste cellule T αSyn-specifiche successivamente si infiltrano nel cervello e vengono ristimolate da microglia attivate, promuovendo così la secrezione di fattori neurotossici che evocano la morte neuronale 9,10. È interessante notare che diverse linee di prova hanno suggerito che gli aggregati αSyn vengono generati prima nel sistema nervoso enterico e poi trasportati attraverso il nervo vago al tronco cerebrale12.
Diversi modelli animali di morbo di Parkinson sono stati utilizzati per molti anni, compresi quelli indotti dalla somministrazione di sostanze neurotossiche (cioè 6-idrossidopamina, paraquat, rotenone, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina) e quelli che coinvolgono condizioni genetiche (cioè α-sinucleina mutante, chinasi ripetuta 2 ricca di leucina mutante)13 . Nonostante i modelli che coinvolgono la neurodegenerazione indotta da neurotossine che replicano alcuni aspetti della malattia di Parkinson, nessuno di essi ricapitola tutti gli aspetti essenziali della malattia o non sono progressivi13. D'altra parte, sebbene i modelli murini genetici che coinvolgono l'espressione di versioni mutanti della chinasi ripetuta 2 ricca di leucina, le versioni mutanti della α-sinucleina o la sovraespressione della α-sinucleina wild-type umana provochino compromissione motoria e, in alcuni casi, anche lo sviluppo della sinucleinopatia, non riproducono una neurodegenerazione prominente dei neuroni dopaminergici ninigrali, che è un aspetto essenziale della malattia di Parkinson13, 14. Un terzo tipo di modello animale di neurodegenerazione è riuscito a soddisfare la maggior parte degli aspetti essenziali della malattia di Parkinson, la somministrazione stereotassica di vettori virali adeno-associati (AAV) che codificano per la α-sinucleina umana (AAV-hαSyn)14,15. È importante sottolineare che gli AAV consentono la trasduzione di neuroni con elevata efficacia e a lungo termine nel cervello adulto dei mammiferi. Inoltre, la somministrazione stereotassica di AAV-hαSyn nel SN ha dimostrato di riprodurre molti degli aspetti essenziali della malattia, tra cui la patologia αSyn, l'attivazione microgliale, la neurodegenerazione e la compromissione motoria 16,17,18,19,20. Questo studio presenta un'analisi di come la dose di vettore virale e il tempo dopo la consegna del vettore virale influenzano l'estensione dell'espressione di hαSyn, la neurodegenerazione e la neuroinfiammazione nella via nigrostriatale, nonché il grado di compromissione motoria nel modello murino di consegna stereotassica unilaterale di hαSyn nel SN.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANIMALS AND ANIMAL FOOD</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3-GFP C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td>
			<td>Stock No:&#160;023800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Rodent Diet</td>
			<td>LabDiet</td>
			<td>Rodent Diet 5001</td>
			<td>Standard Rodent diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td>
			<td>Stock No: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIRAL VECTORS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CBA-&#945;Syn</td>
			<td>University of Iowa Viral Vector Core Facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stock concentration at 10E13 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CBA-eGFP</td>
			<td>University of Iowa Viral Vector Core Facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stock concentration at 9.5 x 10E12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANESTHETICS AND ANALGESICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>218082</td>
			<td>1% for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Drag Pharma</td>
			<td>CHE30</td>
			<td>70 mg/Kg&#160; for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>VE2L9117</td>
			<td>For before transcardial perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tramadol</td>
			<td>Drag Pharma</td>
			<td>DPH134</td>
			<td>30 mg/Kg every 24 h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Centrovet</td>
			<td>EHL40</td>
			<td>9 mg/kg for stereotaxic surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam test</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>horizontal beam 25 cm length and 3 cm width. The beam surface was covered by a metallic grid (1 cm2).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostate</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>S2800 Coolpix</td>
			<td>For recording the beam test performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Used for IHC analysis (section 4.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI8</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Standard Stereotaxic, mouse</td>
			<td>Stoelting, Wood Dale, IL, USA</td>
			<td>51500</td>
			<td>stereotaxic frame for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>C-flex L/S16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply unit</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-RFL-T</td>
			<td>Used for IF analysis (section 5.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suture</td>
			<td>Sylkam&#174;, B Braun</td>
			<td>C0760171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 100 U</td>
			<td>BD</td>
			<td>324918</td>
			<td>For anesthesia before transcardial perfusion, 29G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe RN 5uL SYR W/O NEEDLE</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>HA-7641-01</td>
			<td>For viral vector innoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUFFERS AND REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aviden, Peroxidase Conjugate</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>189728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotrotection buffer</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20% glycerine and 2% DMSO in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount -G T</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>104078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>5000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>104005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.125 M, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase inactivating buffer</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.03% H2O2 in methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Hydrochloride</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>822184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>111065003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A21244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L)&#160; Alexa Fluor 546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-alpha-Synuclein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-Iba-1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR16588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Prism</td>
			<td>6.0</td>
			<td>Fos stats analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image capture with Leica microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProgRes Capture Pro</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image capture with Olympus microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VLC media player</td>
			<td>VideoLAN Organization</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For analysis of behavioural tests</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human &#945;-synuclein

La malattia di Parkinson è una malattia neurodegenerativa che comporta la morte dei neuroni dopaminergici della via nigrostriatale e, di conseguenza, la progressiva perdita di controllo dei movimenti volontari. Questo processo neurodegenerativo è innescato dalla deposizione di aggregati proteici nel cervello, che sono costituiti principalmente da α-sinucleina. Diversi studi hanno indicato che la neuroinfiammazione è necessaria per sviluppare la neurodegenerazione associata al morbo di Parkinson. In particolare, il processo neuroinfiammatorio coinvolge l'attivazione microgliale e l'infiltrazione di cellule T periferiche nella substantia nigra (SN). Questo lavoro analizza un modello murino della malattia di Parkinson che ricapitola l'attivazione microgliale, l'infiltrazione delle cellule T nel SN, la neurodegenerazione dei neuroni dopaminergici nigrali e la compromissione motoria. Questo modello murino della malattia di Parkinson è indotto dalla somministrazione stereotassica di vettori virali adeno-associati che codificano la α-sinucleina wild-type umana (AAV-hαSyn) nel SN. La corretta consegna di vettori virali nel SN è stata confermata utilizzando vettori di controllo che codificano per la proteina fluorescente verde (GFP). Successivamente, è stato valutato il modo in cui la dose di AAV-hαSyn somministrata nel SN ha influenzato l'estensione dell'espressione di hαSyn, la perdita di neuroni dopaminergici nigrali e la compromissione motoria. Inoltre, le dinamiche dell'espressione di hαSyn, dell'attivazione microgliale e dell'infiltrazione delle cellule T sono state determinate durante il decorso temporale dello sviluppo della malattia. Pertanto, questo studio fornisce punti temporali critici che possono essere utili per indirizzare la patologia della sinucleina e la neuroinfiammazione in questo modello preclinico della malattia di Parkinson.

Convalida della corretta consegna dei vettori AAV nei neuroni dopaminergici della via nigrostriatale Per studiare i processi di neuroinfiammazione, neurodegenerazione e compromissione motoria promossi dalla patologia della sinucleina, è stato utilizzato un modello murino di malattia di Parkinson indotto dalla somministrazione stereotassica unilaterale di AAV che codifica hαSyn nel SN 16,17,30,31 (vedere il disegno sperimentale nella Figura supplementare 1 ). Per convalidare la corretta consegna di vettori AAV nei neuroni dopaminergici della via nigrostriatale, aAAV che codifica GFP (AAV-GFP) è stato iniettato nel SN e 12 settimane dopo, la fluorescenza GFP e l'immunoreattività tirosina idrossilasi (TH) sono state analizzate nel SN e nello striato mediante immunofluorescenza. La fluorescenza associata alla GFP è stata osservata esclusivamente sul lato ipsilaterale e c'è stata una significativa colocalizzazione con immunoreattività TH sia nel SN che nello striato, indicando la corretta consegna di vettori AAV nei neuroni dopaminergici della via nigrostriatale (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig01.jpg"> Figura 1: Analisi della somministrazione di AAV-GFP nella via nigrostriatale. I topi hanno ricevuto AAV-GFP (1 x10 10 vg / mouse) e 12 settimane dopo sono stati sacrificati, e TH è stato immunocolorato in (A) SN (le barre di scala sono 118 μm) e (B) lo striato (le barre di scala sono 100 μm). La fluorescenza associata a TH e GFP è stata analizzata mediante microscopia a epifluorescenza. I nuclei sono stati colorati con DAPI. Vengono mostrate immagini rappresentative di colorazione unita o singola di TH (rosso), GFP (verde) e DAPI (blu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Impostazione della dose di vettore virale somministrato per indurre neurodegenerazione e compromissione motoria nel modello murino di malattia di Parkinson indotto da AAV-hαSyn Per testare la dose di AAV-hαSyn necessaria per indurre una significativa sovraespressione di hαSyn che promuove la neurodegenerazione dei neuroni dopaminergici nicrali, sono state iniettate diverse dosi (1 x 108 genomi virali [vg]/topo, 1 x 109 vg/topo, o 1 x10 10 vg/topo) di AAV-hαSyn e 12 settimane dopo, l'immunoreattività hαSyn e l'entità dell'immunoreattività TH sono state valutate nella via nigrostriatale. Sebbene l'immunoreattività hαSyn fosse evidente con tutte le dosi testate nel SN (Figura 2), solo i topi che ricevevano 1 x 1010 vg/topo presentavano un'evidente immunoreattività hαSyn nello striato (Figura 3). Inoltre, i topi che ricevevano 1 x 1010 vg/topo di AAV-hαSyn hanno mostrato una significativa perdita di neuroni dopaminergici nel SN (Figura 4A,B). Sebbene i topi che ricevevano 1 x10 10 vg/topo di AAV-GFP mostrassero un basso grado (~20%) di perdita neuronale (Figura 4A,B), i topi che ricevevano la stessa dose di AAV-hαSyn presentavano un grado significativamente più elevato di neurodegenerazione dei neuroni dopaminergici nigrali (Figura 4C). Di conseguenza, ulteriori esperimenti sono stati eseguiti utilizzando 1 x10 10 vg / mouse di AAV-hαSyn. Inoltre, l'entità della compromissione motoria è stata determinata nei topi che ricevevano dosi diverse di AAV-hαSyn utilizzando il test del fascio (Figura 5A), come descritto primadi 25. Una significativa riduzione delle prestazioni del motore è stata rilevata esclusivamente con 1 x10 10 vg/mouse di AAV-hαSyn nel beam test sia quando si confronta il numero di errori commessi dal pad destro e sinistro (Figura 5B) sia quando si confronta il numero totale di errori dei topi che ricevono AAV-hαSyn rispetto ai topi che ricevono il vettore di controllo AAV-GFP (Figura 5C). Di conseguenza, ulteriori esperimenti sono stati eseguiti utilizzando 1 x10 10 vg / mouse di AAV-hαSyn.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig02.jpg"> Figura 2: Analisi dell'espressione di α-sinucleina umana nel SN di topi trattati con diverse dosi di AAV-hαSyn. I topi hanno ricevuto AAV-hαSyn a (A) 1 x 1010 vg / mouse, (B) 1 x 109 vg / mouse, o (C) 1 x 108 vg / mouse e 12 settimane dopo sono stati sacrificati e l'espressione di hαSyn è stata analizzata mediante immunofluorescenza nel SN utilizzando la microscopia a epifluorescenza. I nuclei sono stati colorati con DAPI. Vengono mostrate immagini rappresentative di colorazione unita o singola di hαSyn (rosso) o DAPI (blu). Le barre della scala sono 118 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig03.jpg"> Figura 3: Analisi dell'espressione di α-sinucleina umana nello striato di topi trattati con diverse dosi di AAV-hαSyn. I topi hanno ricevuto AAV-hαSyn a (A) 1 x10 10 vg / mouse, (B) 1 x 109 vg / mouse, o (C) 1 x 108 vg / mouse) e 12 settimane dopo sono stati sacrificati e l'espressione di hαSyn è stata analizzata mediante immunofluorescenza nello striato usando la microscopia a epifluorescenza. I nuclei sono stati colorati con DAPI. Vengono mostrate immagini rappresentative di colorazione unita o singola di hαSyn (rosso) o DAPI (blu). Le barre della scala sono 100 μm. L'inserto nell'angolo in alto a destra delle immagini unite mostra un'area di interesse per un ingrandimento più elevato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig04.jpg"> Figura 4: Perdita di neuroni dopaminergici del SN in topi trattati con diverse dosi di AAV-hαSyn o vettore di controllo. I topi hanno ricevuto AAV-hαSyn (1 x10 10 vg/mouse, 1 x 109 vg/mouse, o 1 x 108 vg/mouse) o AAV-GFP (1 x 1010 vg/mouse) e 12 settimane dopo sono stati sacrificati e TH è stato analizzato nel SNpc mediante immunoistochimica. (A) Immagini rappresentative. Barre di scala, 100 μm. (B,C) La densità dei neuroni è stata quantificata come il numero di neuroni TH+/mm2. I dati rappresentano ± medie SEM. n = 3-8 topi per gruppo. (B) Un confronto tra lati omolaterali e controlaterali è stato eseguito utilizzando il t-test di Student accoppiato a due code. (C) È stato effettuato un confronto dei lati ipsilaterali di topi che ricevevano 1 x10 10 vg/mouse di AAV-hαSyn o AAV-GFP. (B,C) Mentre le barre bianche indicano la quantificazione dei neuroni TH+ sul lato ipsilaterale dei topi che ricevono AAV-hαSyn, le barre verdi indicano la quantificazione dei neuroni TH+ sul lato ipsilaterale dei topi che ricevono AAV-GFP. Le barre grigie indicano la quantificazione dei neuroni TH+ sul lato controlaterale del gruppo corrispondente. I confronti sono stati eseguiti da un t-test di uno studente spaiato a due code. *p < 0,05; **p < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig05.jpg"> Figura 5: Analisi delle prestazioni motorie in topi trattati con diverse dosi di AAV-hαSyn. I topi hanno ricevuto dosi diverse (1 x10 10 vg/mouse, 1 x 109 vg/mouse o 1 x 108 vg/mouse) di AAV-hαSyn o AAV-GFP e, 12 settimane dopo, le prestazioni del motore sono state valutate dal test del fascio. (A) Immagine di un topo che cammina sul raggio. (B) Il numero di errori effettuati dagli arti sinistri (controlaterali) rispetto agli arti destri (ipsilaterali) è stato quantificato nei gruppi di topi trattati con AAV-hαSyn. (C) Il numero totale di errori è stato confrontato tra diversi gruppi sperimentali che ricevevano la stessa dose di AAV-hαSyn o AAV-GFP. I dati rappresentano ± medie SEM. n = 3-5 topi per gruppo. I confronti sono stati eseguiti da (B) un t-test di uno studente a due code accoppiato o da (C) un t-test di uno studente a due code spaiato. *p < 0,05; **p < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Impostazione della cinetica del modello di malattia di Parkinson indotta da AAV-αSyn Dopo aver determinato la corretta dose di AAV-hαSyn utilizzata per indurre un livello significativo di neurodegenerazione e compromissione motoria, sono stati condotti esperimenti per definire l'insorgenza della sovraespressione di hαSyn. A tale scopo, i topi sono stati trattati con 1 x 1010 vg / topo di AAV-hαSyn o chirurgia fittizia. L'estensione dell'espressione di hαSyn è stata analizzata nel SN una volta alla settimana durante le settimane 2-5 dopo l'intervento stereotassico (vedere il disegno sperimentale nella Figura supplementare 2). I risultati mostrano che, nonostante l'espressione di hαSyn sia stata rilevata a bassi livelli già 2 settimane dopo l'intervento chirurgico, i cluster di hαSyn sono comparsi alla settimana 5 dopo l'intervento stereotassico (Figura 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig06.jpg"> Figura 6: Analisi del decorso temporale dell'espressione di α-sinucleina umana nel SN di topi trattati con AAV-hαSyn. I topi hanno ricevuto AAV-hαSyn (1 x 1010 vg / mouse) o solo la finta chirurgia stereotassica, e l'espressione di hαSyn nel SN è stata analizzata (A) 2 settimane, (B) 3 settimane, (C) 4 settimane o (D) 5 settimane dopo mediante immunofluorescenza utilizzando la microscopia a epifluorescenza. I nuclei sono stati colorati con DAPI. Vengono mostrate immagini rappresentative di colorazione unita o singola di hαSyn (rosso) o DAPI (blu). Barre di scala, 100 μm. L'inserto nell'angolo in alto a destra delle immagini unite mostra un'area di interesse per un ingrandimento più elevato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Successivamente, sono stati condotti esperimenti per determinare i punti temporali adatti per analizzare la neuroinfiammazione e l'infiltrazione delle cellule T nel sistema nervoso centrale (SNC) dopo la somministrazione stereotassica di AAV-hαSyn. Per determinare il picco di attivazione microgliale dopo il trattamento dei topi con AAV-hαSyn, l'estensione delle cellule che esprimono alti livelli di Iba1 nello striato è stata valutata una volta alla settimana durante le settimane 2-15 dopo l'intervento stereotassico. I risultati mostrano un aumento significativo dell'attivazione microgliale del lato ipsilaterale rispetto al lato controlaterale dei topi 15 settimane dopo il trattamento con AAV-hαSyn (Figura 7). Il numero di cellule Treg (CD4+ Foxp3+) infiltrate nel SNpc è stato valutato anche in diversi punti temporali dopo che la somministrazione stereotassica di AAV-hαSyn mediante immunofluorescenza ha seguito l'osservazione al microscopio confocale. I risultati mostrano che il picco di infiltrazione di Treg nello SNpc era a 11 settimane dopo l'intervento chirurgico, mentre l'estensione di Treg che si infiltrava in quest'area del cervello era inferiore alla settimana 8 o alla settimana 13 dopo l'intervento chirurgico (Figura 8). Nessuna cellula T CD4+ è stata rilevata infiltrandosi nello striato (dati non mostrati). Complessivamente, questi risultati indicano che, utilizzando 1 x 1010 vg / mouse di AAV-hαSyn, il punto temporale più adatto per analizzare la neuroinfiammazione è la settimana 15 dopo l'intervento stereotassico, mentre un punto temporale adeguato per analizzare l'infiltrazione delle cellule T nel SNC sembra essere la settimana 11 dopo il trattamento AAV-hαSyn.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig07.jpg"> Figura 7: Analisi del decorso temporale dell'attivazione microgliale in topi inoculati con AAV-hαSyn. I topi hanno ricevuto AAV-hαSyn (1 x10 10 vg/mouse) e l'attivazione microgliale è stata valutata mediante analisi immunoistochimica di Iba1 nello striato in diversi punti temporali dopo l'intervento chirurgico. (A) Vengono mostrate immagini di panoramica rappresentative dell'analisi immunoistochimica di Iba1 da topi sacrificati 5 settimane, 10 settimane o 15 settimane dopo l'inoculazione con AAV-hαSyn. Barre di scala, 110 μm. (B) La densità delle microglia attivate è stata quantificata come il numero di cellule che esprimono alti livelli di Iba1 e forma ameboide per area. I dati rappresentano ± medie SEM. n = 3 topi per gruppo. Un t-test di Student accoppiato a due code è stato utilizzato per determinare le differenze statistiche tra Iba1 oplaterale e controlaterale in ciascun gruppo. *p < 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig08.jpg"> Figura 8: Analisi del decorso temporale dell'infiltrazione di cellule T CD4+ nell'SN di topi inoculati con AAV-hαSyn. I topi reporterFoxp3 gfp hanno ricevuto AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mouse). La presenza di cellule T CD4+ che esprimono Foxp3 e la presenza di neuroni TH+ sono state analizzate in diversi punti temporali (settimana 8, settimana 11 e settimana 13 dopo l'intervento) nel SN mediante immunofluorescenza. (A) Vengono mostrate immagini rappresentative per la singola immunocolorazione o la fusione. Barre di scala, 100 μm. (B) È stato quantificato il numero di cellule T CD4+ Foxp3+ per area nel SN. I dati rappresentano ± SEM medio da 3 topi per gruppo. *p<0.05, cellule T CD4+ Foxp3+ ostallaterali rispetto a quelle controlaterali mediante t-test dello studente a due code. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura 1 supplementare: Disegno sperimentale per la valutazione dell'effetto di diverse dosi di vettori AAV sulla patologia della sinucleina, sulla neurodegenerazione e sulla compromissione motoria. I topi maschi C57BL/6 wild-type sono stati anestetizzati e hanno ricevuto inoculazione stereotassica di diverse dosi (1 x 1010 vg/mouse, 1 x 109 vg/mouse o 1 x 108 vg/mouse) di AAV che codifica per α-sinucleina umana (AAV-hαSyn) o eGFP (AAV-GFP) sotto il controllo del promotore CBA nella giusta substantia nigra (SN). Dopo 12 settimane, l'espressione di GFP e hαSyn nel SN e nello striato (Str) è stata valutata mediante immunofluorescenza (IF), le cellule positive alla tirosina idrossilasi (TH+) sono state quantificate mediante immunoistochimica (IHC) nel SN e le prestazioni motorie sono state valutate mediante il test del fascio. Il numero di topi in ciascun gruppo sperimentale è indicato tra parentesi. * indica i gruppi in cui un topo è morto prima delle analisi. Ogni analisi indica tra parentesi il numero della figura dal corpo del documento in cui sono mostrati i risultati corrispondenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Figura 2 supplementare: Disegno sperimentale per determinare la cinetica dell'infiltrazione delle cellule T, della neuroinfiammazione e dell'espressione di hαSyn. I topi reporter Foxp3gfp sono stati anestetizzati e hanno ricevuto l'inoculazione stereotassica di AAV (1 x10 10 vg / mouse) che codifica la α-sinucleina umana (AAV-hαSyn) sotto il controllo del promotore CBA nella giusta substantia nigra (SN) o chirurgia fittizia (PBS). I topi sono stati sacrificati in diversi punti temporali e l'espressione di hαSyn nel SN e nello striato è stata valutata mediante immunofluorescenza (IF), GFP (Foxp3), CD4 e tirosina idrossilasi positiva (TH+) cellule sono state quantificate da IF nel SN e l'espressione di Iba1 è stata analizzata mediante immunoistochimica (IHC) nello striato (Str). È indicato il numero di topi in ciascun gruppo sperimentale. Viene indicato l'intervallo di punti temporali inclusi in ciascuna analisi. Ogni analisi indica tra parentesi il numero della figura dal corpo del documento in cui sono mostrati i risultati corrispondenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

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Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein

Questo lavoro analizza la dose vettoriale e il tempo di esposizione necessari per indurre neuroinfiammazione, neurodegenerazione e compromissione motoria in questo modello preclinico di malattia di Parkinson. Questi vettori che codificano la α-sinucleina umana vengono consegnati nella substantia nigra per ricapitolare la patologia sinucleina associata al morbo di Parkinson.

Analisi del modello murino della malattia di Parkinson indotto da vettori virali adeno-associati che codificano la α-sinucleina umana

Parkinson&#39;s disease is a neurodegenerative disorder that involves the death of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway and, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di riprodurre la maggior parte degli aspetti essenziali della malattia di Parkinson in un modello animale. La somministrazione stereotassica di vettori virali adeno-associati, che codificano la sinucleina umana nella substantia nigra. La malattia di Parkinson è una malattia neurodegenerativa che comporta la morte del neurone dopaminergico, nella via nigrostriatale e, di conseguenza, la progressione della perdita di controllo del movimento volontario.Questo processo neurodegenerativo è accompagnato, dalla deposizione di aggregati proteici nel cervello, che sono costituiti principalmente da sinucleina. Prove emergenti hanno indicato che gli aggregati di sinucleina possono stimolare i recettori toll-like sulla microglia, innescando così l'infiammazione neurale nella substantia nigra. Inoltre, le prove indicano che gli aggregati di sinucleina possono essere catturati e presentati, dalle cellule che presentano l'antigene alle cellule T, inducendo una risposta immunitaria adattativa specifica alla sinucleina.La somministrazione stereotassica di vettori virali adeno-associati che codificano la sinucleina umana nella substantia nigra, ha dimostrato di riprodurre molti aspetti essenziali della malattia, tra cui la patologia sinucleina, l'attivazione microgliale, l'attivazione delle cellule T, la neurodegenerazione e la compromissione motoria. Questo studio presenta un'analisi di come un vettore virale e il tempo dopo la consegna del vettore virale, influenza l'estensione dell'espressione della sinucleina umana, la neurodegenerazione e la neuroinfiammazione nella via nigrostriatale, nonché il grado di compromissione motoria in un modello murino di consegna stereotassica unilaterale di sinucleina umana in substantia nigra. Per mantenere un ambiente asettico, indossare abiti chirurgici appropriati durante l'intero intervento chirurgico, compresi copriscarpe, maschera chirurgica, barriera sanitaria, guanti e cappuccio chirurgico.Spruzzare etanolo sul topo e su tutto il materiale chirurgico, per mantenere l'ambiente asettico. Per indurre un'analgesia, iniettare carprofene per via sottocutanea ogni 12 ore, iniziando un'ora prima dell'intervento chirurgico e continuando fino a tre giorni dopo l'intervento chirurgico. Per anestetizzare il topo, posizionare l'animale in una camera di induzione.Aprire il flusso di isoflurano ad una velocità dello 0,5% e quindi aumentarlo lentamente fino al 5% per circa cinque minuti fino a quando il mouse non ha perso il riflesso di raddrizzamento. Rimuovere l'animale dalla camera di induzione. Trasferire immediatamente l'animale su un circuito non respirante con un cono nasale di dimensioni appropriate.Mantenere l'anestesia del topo, con isoflurano 1% per tutto il tempo dell'intervento chirurgico. Conferma che il mouse sia completamente anestetizzato pizzicando le code e le zampe. Quando il mouse non reagisce quando pizzica la coda e le zampe, significa che il mouse è completamente anestetizzato.Rasare la testa del topo usando le forbici. Pulire la pelle del topo con un batuffolo di cotone con clorexidina 2% e rimuovere tutti i capelli. Fissare la testa del mouse nella cornice stereotassica.Posizionare un protettivo corneale in entrambi gli occhi del topo, usando un batuffolo di cotone. Per prevenire l'induzione dello stress in altri roditori, evitare la presenza di qualsiasi altro topo nella sala operatoria. Pulire la testa del topo con tre colpi di clorexidina 2% seguita da etanolo 70%Esporre il cranio utilizzando materiale chirurgico e praticare un foro sottile con un trapano alle coordinate anteroposteriorie 2,8 mm e mediolaterale 1,4 mm, rispetto alla linea mediale.Mettere l'ago di una siringa da 10 microlitri nel foro e spostare l'ago all'interno del cervello lentamente, fino ad arrivare a 7,2 mm dorsoventrali, rispetto alla dura. Lasciare l'ago nella posizione finale per due minuti, per consentire al tessuto di depositarsi un po ', quindi iniettare un microlitro di vettori virali nella giusta substantia nigra, ad una velocità di 0,2 microlitri ogni 30 secondi. Lasciare l'ago nella stessa posizione per cinque minuti dopo la consegna dei vettori virali, quindi ritirarlo lentamente.Chiudere la ferita usando una sutura di seta sterile. Metti il mouse nella gabbia di casa, preriscaldato posizionandolo su un materasso caldo elettrico. 12 settimane dopo l'intervento stereotassico, valutare le prestazioni motorie, utilizzando una versione semplificata del test del fascio, descritto in precedenza.A tale scopo, utilizzare una trave orizzontale di 25 cm di lunghezza e 3 cm di larghezza. La superficie del fascio deve essere coperta da una griglia metallica con quadrati di un centimetro ed elevata di un centimetro sopra la trave. Fai un video del mouse, mentre attraversi il raggio della superficie della griglia, da un'estremità all'estremità opposta del raggio, dove si trova la gabbia domestica.Addestrare il mouse per due giorni, prima della determinazione delle prestazioni del motore. Il primo giorno, allena il mouse a camminare attraverso il raggio cinque volte, senza la griglia. Il secondo giorno, allena il mouse a camminare attraverso il raggio, in presenza di griglia cinque volte.Il terzo giorno, valutare le prestazioni del motore. Per fare ciò, quantifica il numero di errori eseguiti, dalle zampe sinistre o dalle zampe destre separatamente, guardando i video in modalità slow-motion. Per anestetizzare il topo, iniettare una miscela di ketamina e xilazina per via intraperitoneale.Una volta che il topo è completamente anestetizzato, aprire il torace con materiale chirurgico ed esporre il cuore. Quindi inserire un ago a punta piatta, nel ventricolo sinistro del cuore. Accoppiando l'ago a un tubo, perfondere 50 millilitri di soluzione salina tampone fosfato, ad una velocità di 9,5 millilitri al minuto, utilizzando una pompa peristaltica.Rimuovere il cervello usando forbici e pinzette, quindi fissarlo per immersione, in cinque millilitri di paraformaldeide al 4%, in soluzione salina tampone fosfato. Successivamente, metti il cervello fisso, in 15 millilitri di saccarosio al 30% per 48 ore. Quindi metti il cervello in quattro millilitri di soluzione di crioprotezione e salva il cervello a 80 gradi, o usalo immediatamente nella fase successiva.Per ottenere fette striatali, tagliare il cervello in sezioni spesse 40 micrometri, a partire da 1,34 mm e finendo a 0,26 mm. Raccogli ogni fetta in un criotubo da due millilitri, seguendo l'ordine anteroposteriore. Per effettuare analisi immunoistochimiche e immunofluorescenti nello striato, scegliere cinque sezioni striatal coronali prese a intervalli uniformi, che coprono l'intera estensione rostrocaudale del nucleo.Per convalidare la corretta consegna di vettori virali nei neuroni dopaminergici della via nigrostriatale, sono stati iniettati vettori che codificano GFP, nella substantia nigra, e 12 settimane dopo, la fluorescenza GFP e l'immunoreattività tirosina idrossilasi sono state analizzate nella substantia nigra e nello striato mediante immunofluorescenza. La fluorescenza associata alla GFP, è stata localizzata esclusivamente nel sito ipsilaterale, ed è stata osservata una significativa colocalizzazione con immunoreattività tirosina idrossilasi sia nella substantia nigra che nello striato, indicando la corretta consegna di vettori virali nei neuroni dopaminergici della via nigrostriatale. Per testare la dose di vettori, codificando la sinucleina richiesta, per indurre una significativa sovraespressione di sinucleina umana che promuove la neurodegenerazione dei neuroni dopaminergici nigrali, sono state iniettate diverse dosi dei vettori.E 12 settimane dopo, l'immunoreattività della sinucleina umana e l'estensione dell'immunoreattività della tirosina idrossilasi sono state testate nella via nigrostriatale. L'immunoreattività della sinucleina umana è risultata evidente, con tutte le dosi testate nella substantia nigra. Tuttavia, solo i topi che ricevevano da 10 a 10 genomi virali per topo, presentavano un'evidente immunoreattività della sinucleina umana, nello striato.I topi che hanno ricevuto da 10 a 10 genomi virali per topo di vettori che codificano la sinucleina umana, hanno mostrato una significativa perdita di neuroni dopaminergici nella substantia nigra. Sebbene i topi che ricevevano la stessa dose di vettori che codificavano GFP, mostrassero un basso grado di perdita neuronale, questi topi presentavano un grado significativamente più basso di neurodegenerazione, rispetto a quei topi che ricevevano vettori, codificando la sinucleina umana. Utilizzando il test del fascio, è stata rilevata una significativa riduzione delle prestazioni motorie esclusivamente in quei topi, che ricevono da 10 a 10 genomi virali per topo di vettori che codificano la sinucleina umana, quando si confronta il numero di errori commessi dalla zampa destra e dalla zampa sinistra, o quando si confronta il numero totale di errori, di topi che ricevono vettori che codificano sinucleina umana, con quei topi che ricevono il vettore di controllo.Per definire l'insorgenza dell'espressione della sinucleina umana, i topi sono stati trattati con 10-10 genomi virali per topo, di vettori che codificano la sinucleina umana o chirurgia fittizia, e l'estensione dell'espressione della sinucleina umana è stata analizzata nella substantia nigra, una volta alla settimana, durante le settimane da due a cinque dopo l'intervento stereotassico. I risultati mostrano che l'espressione della sinucleina umana ha iniziato ad essere evidente alla quinta settimana dopo l'intervento stereotassico. Per determinare il picco di attivazione microgliale, l'estensione delle cellule che esprimono alti livelli di Iba1, è stata quantificata nello striato dei topi, durante le settimane 2-15 dopo l'intervento chirurgico.I risultati mostrano un aumento significativo dell'attivazione microgliale del lato ipsilaterale, rispetto al lato controlaterale dei topi, 15 settimane dopo l'inoculazione virale. Il numero di cellule T regolatorie infiltrate nel nigra sostanziale è stato analizzato in diversi punti temporali, dopo l'intervento stereotassico mediante immunofluorescenza, seguita dall'osservazione al microscopio confocale. Il picco di infiltrazione regolatoria delle cellule T nella substantia nigra è stato osservato alla settimana 11 dopo l'intervento chirurgico.Il modello murino di neurodegenerazione qui analizzato, rappresenta un modello utile per studiare i numeri di coinvolgimento degli aspetti chiave nella fisiopatologia della malattia di Parkinson. Meccanismi di coinvolgimento coinvolti nella patologia della sinucleina, nell'attivazione microgliale, nel coinvolgimento del sistema immunitario periferico, nella neuroinfiammazione e nei meccanismi di neurodegenerazione Una dose adeguata di vettore virale adeno-associato, sottotipo cinque che codifica la sinucleina umana per indurre neurodegenerazione, neuroinfiammazione, infiltrazione delle cellule T e compromissione motoria, è da 10 a 10 genomi virali per topo. Questo studio dimostra, che cinque settimane dopo l'intervento stereotassico, costituisce un punto temporale chiave, in cui l'espressione della sinucleina umana era già evidente, ma in assenza di compromissione motoria in questo modello animale.Quindi, questo punto temporale, rappresenta un punto temporale interessante, per iniziare la somministrazione di terapie sperimentali su misura per fermare il progresso della neuroinfiammazione e della neurodegenerazione. Il punto temporale più adatto per analizzare la neuroinfiammazione in questo modello animale, è alla settimana 15 dopo un intervento chirurgico stereotassico. Mentre un punto temporale adeguato per analizzare l'infiltrazione delle cellule T nel sistema nervoso centrale.sembra essere alla settimana 11 dopo l'inoculazione del vettore virale.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human &#945;-Synuclein

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Neuroscienze

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Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

Metodi di caratterizzare spontanea e startle indotta Locomozione in un rotenone-indotta malattia di Parkinson Modello di<em&gt; Drosophila</em

Parkinson&#8217;s disease is a neurodegenerative disorder that results from the degeneration of dopaminergic neurons in the central nervous system, ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventricular Iniezione virale del cervello neonatale mouse per persistente e diffusa trasduzione neuronale

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produzione, purificazione e controllo di qualità per i vettori basati su Virus Adeno-associato

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Convezione Consegna migliorata del vettore virale optogenetico adeno-associato alla Corteccia di Rhesus Macaque Sotto la guida di immagini MRI online

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Riprogrammazione diretta in vivo delle cellule gliali residenti negli interneuroni mediante iniezione intracerebrale di vettori virali

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Preparazione della superficie cocleare nel topo adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Applying the RatWalker System for Gait Analysis in a Genetic Rat Model of Parkinson's Disease

Applicazione del sistema RatWalker per l'analisi dell'andatura in un modello genetico di ratto della malattia di Parkinson

Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder caused by the loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars ...

The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease

Il modello di ratto 6-idrossidopamina della malattia di Parkinson

Motor symptoms of Parkinson's disease (PD)-bradykinesia, akinesia, and tremor at rest-are consequences of the neurodegeneration of dopaminergic neurons in ...